Introduction
नाक गुहा में माउस घ्राण उपकला 6-10,000,000 द्विध्रुवी घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स एक शामिल हैं। प्रत्येक घ्राण न्यूरॉन अभिव्यक्ति के लिए 1200 odorant रिसेप्टर जीन की एक चुनता है। Odorants की जांच तो 4 OLF घ्राण विशिष्ट जी प्रोटीन Gα के माध्यम से adenylyl साइक्लेस प्रकार III (ACIII) 3 को सक्रिय करता है जो एक घ्राण रिसेप्टर 2, के लिए बाध्य odorant से शुरू होता है। चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) में वृद्धि के परिणामस्वरूप खोलता एक न्यूक्लियोटाइड-गेटेड गैर-चयनित कटियन चैनल सीए 2 + और ना +, और बाद में सीए की आमद के लिए अग्रणी (सीएनजी) 2 + तांता एक सीए 2 + सक्रिय सीएल का उद्घाटन करने के लिए सुराग चक्रीय - चैनल 5,6। जावक सीएल जिसके परिणामस्वरूप - प्रवाह एक उच्च intracellular सीएल द्वारा सुविधा है - ना + / + K / सीएल के माध्यम से होने की संभावना तेज, - - cotransporter NKCC1, एकाग्रता स्थिर सीएल द्वारा बनाए रखाCL - / HCO3 - एक्सचेंजर SLC4A1, और शायद अतिरिक्त अभी तक पहचान की जा ट्रांसपोर्टरों 6-8।
द्विध्रुवी घ्राण न्यूरॉन्स एकल, unbranched घ्राण बल्ब को सीधे परियोजना axons कि, और उपकला की सतह तक फैली हुई है और एक विशेष डिब्बे, वृक्ष के समान दस्ता के रूप में समाप्त हो जाती है कि एक डेन्ड्राइट है। ऊपर माइक्रोन 50-60 के लंबाई तक पहुँच सकते हैं जो इस घुंडी, 10-30 सिलिया, से, उपकला सतह 9 को कवर बलगम में निर्गत होना। विहित संकेत पारगमन झरना के प्रोटीन मुख्य रूप से इन सिलिया की झिल्ली में स्थानीय कर रहे हैं। उपकला की वृद्धि संवेदी सतह odorants पता लगाने की क्षमता बढ़ाता है। कारण संवेदी न्यूरॉन्स के घनत्व के लिए, पड़ोसी वृक्ष के समान knobs के विस्तार से सिलिया मिलाना। उपकला की सतह पर, घ्राण रिसेप्टर्स के विभिन्न प्रकार व्यक्त अलग न्यूरॉन्स से सिलिया के एक यादृच्छिक मिश्रण में इस खुलेपन का परिणाम है। का पता लगाने और सेलसंवेदी न्यूरॉन्स की एक सबसेट में ही मौजूद हैं, जो सिलिअरी प्रोटीन की ular आवंटन cryosections में इसलिए मुश्किल है। Cryosections सिलिया की औसत लंबाई की तुलना में आम तौर पर पतले हैं, क्योंकि इसके अलावा, सिलिया के साथ इस तरह के प्रोटीन का सटीक स्थानीयकरण, मुश्किल से ही संभव है।
घ्राण न्यूरॉन्स में अब तक uncharacterized झिल्ली प्रोटीन के सिलिअरी स्थानीयकरण की जांच सक्षम करने के लिए, हम सिलिया में प्रोटीन स्थानीयकरण के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है जो एक एन चेहरा तैयारी तकनीक अनुकूलित। संक्षेप में, माउस का बलिदान और सिर midline के पास विभाजित है। Turbinates, नाक, और ललाट हड्डियों पट बेनकाब करने के लिए हटा रहे हैं। अस्तर उपकला की घ्राण भाग के साथ पट नाक गुहा को सभी कनेक्शनों को काटने से ढीला है। घंटी समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश में पट लगाने के बाद, उपकला एक लेपित गिलास स्लाइड के लिए स्थानांतरित कर अंड से खुली है। एक छोटी fixat के बादहैंडलिंग कमजोर ऊतक के नुकसान से बचने के लिए संभव के रूप में कोमल है अगर आयन कदम है, immunostaining प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया जा सकता है। हम शास्त्रीय cryosections में और वर्णित एन चेहरा तैयारी में घ्राण सिलिया में दो अलग-अलग झिल्ली प्रोटीन के धुंधला की तुलना द्वारा प्राप्त संकल्प प्रदर्शित करता है।
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Protocol
नोट: सभी पशु प्रक्रियाओं पशुओं के किसी भी अनुचित पीड़ा से बचने जर्मन पशु की देखभाल कानूनों के साथ समझौते में Charité या विश्वविद्यालय क्लिनिक जेना को संभाल रहे थे।
1. की तैयारी समाधान और विच्छेदन दफ्तर
- समाधान
नोट: उपकला के विच्छेदन शुरू करने से पहले निम्न समाधानों को तैयार।- विच्छेदन प्रक्रिया के लिए समाधान:
- 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, और 10 मिमी ग्लूकोज की सांद्रता के साथ घंटी समाधान (7.4 पीएच) तैयार करें।
- / - - 2.68 मिमी KCl, 1.47 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 136 मिमी NaCl, और 8.1 मिमी ना 2 HPO 4 की सांद्रता के साथ समाधान (7.4 पीएच) एक पीबीएस तैयार करें।
- / - - 0.2 मिमी 2 CaCl, 4% सुक्रोज, और 4% paraformaldehyde के 1x पीबीएस की सांद्रता के साथ एक लगानेवाला समाधान (पीएच 7.2) तैयार करें। लगानेवाला समाधान में सुक्रोज क्रायो को बेहतर बनाता हैसेक्शनिंग और पिकअप cryosections की। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- धुंधला प्रक्रिया के लिए समाधान
- 1x पीबीएस की सांद्रता के साथ एक पीबीएस + / + समाधान तैयार - / -, 0.48 मिमी 2 MgCl, 0.9 मिमी 2 CaCl।
- 1x पीबीएस + / + और 0.1% ट्राइटन X-100 की सांद्रता के साथ एक PBST / + + समाधान तैयार है।
- 1x PBST / + + और 1% जिलेटिन की सांद्रता के साथ एक अवरुद्ध समाधान तैयार है।
- विच्छेदन प्रक्रिया के लिए समाधान:
- दफ्तर
- विच्छेदन कार्यस्थल के लिए, चमकदार रोशनी के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप, साथ ही एक तरल-अवरोधक कलम का उपयोग करें।
- घंटी समाधान, और चिपकने वाला गिलास स्लाइड के साथ भरा एक पेट्री डिश, तैयार करें।
- निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरण प्राप्त करें: शल्य कैंची की एक जोड़ी तेज और एक कुंद टिप, सीधे टिप आकार के साथ वसंत कैंची, ठीक घुमावदार टिप आकार और एक रेजर ब्लेड के साथ दो संदंश की एक जोड़ी (साथ
नाक पट 2. तैयारी
- भोजन और पानी और उचित दिन / रात चक्र करने के लिए नियमित रूप से उपयोग के साथ मंजूरी दे दी पिंजरों में घर पशुओं।
- रियर पैर सजगता परीक्षण के द्वारा 100% isoflurane और मॉनिटर एनलजेसिया से लथपथ एक बंद गोदाम युक्त धुंध में संज्ञाहरण प्रदर्शन करते हैं। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था नाक cavities में रक्त का कारण बन सकता है, सीधे से anesthetized चूहों सिर काटना।
- पूरे खोपड़ी और नाक की हड्डी का पर्दाफाश करने के लिए त्वचा निकालें, और अच्छी तरह से एक कागज तौलिया का उपयोग कर शेष रक्त और ऊतकों को दूर पोंछ। निचले जबड़े और सामने दांत निकालें।
- मैक्सिला (पार्श्व) से पट (मध्यवर्ती) के एक तरफ अलग करने के लिए सीवन लाइन के लिए 1-2 मिमी दूरी समानांतर में द्विपक्षीय नाक के पृष्ठीय हड्डी काटकर अलग कर देना। एक भी कटौती के साथ नाक विभाजित। अस्थि अवशेष और turbinates अभी भी पट से जुड़े होते हैं, तो ध्यान से इन निकालने के लिए पूरी तरह से पट बेनकाब करने के लिएयह बिना छुए।
- पट और नाक की हड्डी के बीच, पट के पृष्ठीय पक्ष के साथ एक संदंश के ठीक घुमावदार टिप फिसलने से पृष्ठीय नाक की हड्डी निकालें। , हड्डी पर थोड़ा दबाव लागू करें इसे धक्का और इसे हटा दें।
- प्रत्येक गुहा से दो सेप्टल ऊतकों के लिए उपयोग, एक प्रदान करने के लिए, ध्यान से सिर के दूसरे पक्ष की मैक्सिला हटा दें। बड़े जानवरों (> 28 पी) की तैयारी, घ्राण बल्ब को कवर ललाट हड्डी की नोक को हटा दें।
- इसके थोड़ा पीला रंग (चित्रा 1 बी) द्वारा घ्राण उपकला को पहचानें। सीमावर्ती श्वसन उपकला सफेद है और विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है कि गतिशील सिलिया के आंदोलन से पता चलता है। ठीक वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ घ्राण और श्वसन उपकला के बीच सीमा पर काटें।
- कटौती का विस्तार करने और VOMER हड्डी करने के लिए उदर कनेक्शन से पट अलग। फिर पट और ओएस ethmoidal के पटल cribrosa के बीच की सीमा के साथ काटाई। पट अब पूरी तरह से सिर करने के लिए सभी कनेक्शनों से अलग है। चित्रा 1C में दिखाया गया काटने पदों का प्रयोग करें।
Immunostaining के लिए घ्राण उपकला 3. अलगाव
- घंटी समाधान के साथ भरा पेट्री डिश में एक चिपकने वाला गिलास स्लाइड रखें। कांच की एक आधा घंटी समाधान (चित्रा 1 ए) में निहित है, इसलिए है कि पेट्री डिश के किनारे पर रखें।
- ध्यान से पेट्री डिश के लिए घ्राण उपकला साथ सलाखें हड्डी स्थानांतरित करने के लिए एक संदंश का प्रयोग करें। संदंश सुझावों के साथ इसे हथियाने के बिना यह लिफ्ट।
- एक संदंश के साथ सलाखें हड्डी का सीधा थाली ले लो और ध्यान से पट के एक तरफ से उपकला दूर करने के लिए एक दूसरे से एक का उपयोग करें। उपकला दूर छील सीधा करने के लिए थाली और उपकला के बीच घुमावदार टिप स्लाइड।
- उपकला घंटी soluti में flips मामले में, सिलिअरी पक्ष की पहचान करने के लिए हमेशा के लिए सुनिश्चित करेंपर। उपकला flips है, यह बाद में सिलिअरी पक्ष की पहचान करने के लिए शायद ही संभव है। ज़्यादातर, उपकला अंदर सिलिअरी सतह के साथ रोल।
- चित्रा 1C में दिखाया गया काटने पदों के साथ दाखिला लिया ऊतक आकार की तुलना करें। सीमा पर एक स्थान पर उपकला पकड़ो और गिलास स्लाइड पर यह पुल। ऊतक के घावों से बचने के लिए संदंश के साथ सिलिअरी ओर मत छुओ।
- पट मुड़ें और दूसरी तरफ से उपकला के साथ प्रक्रिया को दोहराने।
- एक कागज तौलिया के साथ घ्राण उपकला के दोनों टुकड़े चारों ओर कांच स्लाइड सूखी और एक तरल-अवरोधक कलम के साथ ऊतक घेरना।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए 150 μl लगानेवाला समाधान के साथ ऊतक को ठीक करें। सिलिया स्थिरता और अखंडता के संबंध में, परीक्षण किया एंटीबॉडी की एक किस्म के लिए कम निर्धारण बार का उपयोग करें। इन 10 मिनट सिलिया के भीतर निर्धारित है, लेकिन शायद नहीं पूरे उपकला ऊतक होते हैं। इस प्रकार, तत्काल के लिए बाद में माइक्रोस्कोप के साथ कल्पनाप्रक्रिया taining। हालांकि, लगानेवाला टाइम्स व्यक्ति एंटीबॉडी के लिए अलग-अलग हो सकता है।
4. धुंधला प्रोटोकॉल
नोट: घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की सिलिअरी संरचनाओं की रक्षा करने के लिए बहुत ध्यान से ऊतक संभाल लेना। Pipetting द्वारा समाधान निकालें। यांत्रिक बलों ठीक सिलिया को बाधित कर सकता है, के रूप में उपकला पर सीधे कोई समाधान नहीं छोड़ दें। अन्यथा कहा नहीं तो आरटी पर सभी चरणों को पूरा करें।
- लगानेवाला समाधान निकालें और पीबीएस + / + के साथ दो बार धो लो।
- अवरुद्ध समाधान के साथ कम से कम एक घंटा के लिए उपकला सेते हैं।
- किसी भी अवक्षेप को दूर करने के लिए पूरी गति से 5 मिनट के लिए: (इस अध्ययन में इस्तेमाल एंटीबॉडी के लिए 200 1) और सेंट्रीफ्यूज अवरुद्ध समाधान में एंटीबॉडी भंग करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है।
- 4 डिग्री सीओ / एन पर एक नम कक्ष में एंटीबॉडी समाधान के साथ उपकला सेते हैं।
- पीबीएस + / + के लिए 5 मिनट से धो लें उपकला में कम से कम तीन बार।
- पूरी रफ्तार से 5 मिनट के लिए और अपकेंद्रित्र: समाधान (500 1) अवरुद्ध में एंटीबॉडी भंग करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है।
- एक अंधेरे कक्ष में एक घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ उपकला सेते हैं।
- पीबीएस + / + के लिए 5 मिनट से धो लें उपकला में कम से कम तीन बार।
- एक रेजर ब्लेड या कागज तौलिया के साथ तरल-ब्लॉकर निकालें। 5 एस के लिए आसुत जल के साथ उपकला धो लें।
- Antifade बढ़ते अभिकर्मक में ऊतक को बचाना।
नोट: दिनों के भीतर तेजी से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है; नहीं बाद में दो दिन से बढ़ते मध्यम में एम्बेड करने के बाद सूक्ष्म विश्लेषण इसलिए सिफारिश की है। विशेष देखभाल सही फोकल हवाई जहाज़ जब खोज यह गंभीर तैयारी को नुकसान पहुंचा सकता है, क्योंकि ऊतक निचोड़ करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए। कारण बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति के लिए, confocal माइक्रोस्कोपी के साथ आगे की जांच की सिफारिश की है।
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Representative Results
चेहरे की तैयारी एन घ्राण उपकला जिसका स्थानीयकरण cryosections के विश्लेषण के बाद यह स्पष्ट नहीं है प्रोटीन की विस्तृत जांच की इजाजत दी संवेदी न्यूरॉन्स की सिलिया में प्रोटीन का स्थानीयकरण जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह समस्या irre की तरह प्रोटीन 2 (Kirrel2) के परिजनों के लिए धुंधला के मामले में उदाहरण जा सकता है। (यह भी Neph3 कहा जाता है) Kirrel2 एक homophilic आसंजन प्रोटीन के रूप में झिल्ली प्रोटीन और कार्यों की इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) superfamily का एक सदस्य है। यह घ्राण प्रणाली में अक्षतंतु-मार्गदर्शन में एक भूमिका निभाने के लिए, और एक गतिविधि पर निर्भर तरीके से 10 में घ्राण न्यूरॉन्स की एक सबसेट में व्यक्त होना दिखाया गया था।
घ्राण उपकला के माध्यम से एक ठेठ cryosection में Kirrel2 के लिए Immunostaining एक्सोन, सोम और dendrites (2A चित्रा) में Kirrel2 के स्थानीयकरण का पता चला। एन चेहरा तैयारी तकनीक के लिए ऊपर वर्णित के रूप में सभी समाधान तैयार थे। कुछ एल यद्यपिabeling वृक्ष के समान knobs के रचना की परत के शीर्ष पर, सिलिअरी स्थानीयकरण cryosections के विश्लेषण के बाद अनिश्चित बनी हुई दिखाई देती है। कुछ न्यूरॉन्स में और उनके घ्राण घुंडी चारों ओर धुंधला प्रदर्शन किया, लेकिन एकल सिलिया की पहचान करने के लिए मुश्किल थे। इसके विपरीत, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन घ्राण उपकला के चेहरे तैयारी एन असंदिग्ध रूप से Kirrel2 (चित्रा 2B) की सिलिअरी स्थानीयकरण दिखाया। दाग cryosections के विश्लेषण के न्यूरॉन्स की एक बहुत बड़ा प्रतिशत में अभिव्यक्ति से पता चला हालांकि दिलचस्प है, Kirrel2 ही, घ्राण न्यूरॉन्स की एक अपेक्षाकृत छोटे सबसेट का सिलिया में व्यक्त की गई थी। इसके अलावा, एन चेहरा तैयारी सिर्फ सामान्य रूप में सिलिअरी धुंधला दिखाना है, लेकिन लंबे समय से कई सिलिया के साथ न्यूरॉन्स से केवल कुछ ही कम सिलिया के साथ न्यूरॉन्स को लेकर सिलिअरी अभिव्यक्ति पैटर्न में बदलाव नहीं पता चला था। कुछ कोशिकाओं में, Kirrel2 नहीं बल्कि इस घुंडी से देने सिलिया में, वृक्ष के समान घुंडी में खोजा गया था। सी ause और इस खोज के कार्यात्मक प्रासंगिकता elucidated जाना बना रहता है, लेकिन यह घ्राण प्रणाली में प्रोटीन स्थानीयकरण में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एन चेहरा तैयारी की क्षमता दिखाता है।
इसके अलावा, हम मजबूत सिलिअरी अभिव्यक्ति 11 दर्शाती है कि घ्राण रिसेप्टर Mor जैसे, के लिए एक immunostaining प्रदर्शन किया। रिसेप्टर पहले से ही cryosections में सिलिअरी परत (चित्रा 3) में स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य है। फिर भी, इस तरह के घुंडी प्रति सिलिया की संख्या या व्यक्तिगत सिलिया की लंबाई के रूप में विस्तृत विशेषताओं का विश्लेषण संभव नहीं है। घ्राण रिसेप्टर व्यक्त न्यूरॉन्स से एन चेहरा तैयारी, सिलिया की पहचान का उपयोग करना (चित्रा 3 बी, सी) आसानी से संभव है। एन चेहरा तैयारी अलग अलग उम्र के जानवरों के साथ किया जा सकता है। जन्म के पूर्व जानवरों से यहां तक कि सिलिया सफलतापूर्वक दाग और चित्रा (3 डी) कल्पना थे।
चेहरे की तैयारी एन सामग्री "> इसलिए अच्छी तरह से सिलिअरी आकृति विज्ञान और विस्तार में जाने-माने सिलिअरी प्रोटीन का स्थानीयकरण का विश्लेषण करने के लिए अनुकूल एक उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
माउस सिर के 1. तैयारी चित्रा। विच्छेदन कार्यस्थल की (ए) व्यवस्था। पेट्री डिश घंटी समाधान के साथ भरा है और चिपकने वाला एक गिलास स्लाइड रखती है। शल्य चिकित्सा उपकरणों चेहरा तैयारी एन के लिए सिफारिश कर रहे हैं। (बी) माउस सिर के एक आधे हटाने के बाद, पट अवगत कराया है। पट घ्राण उपकला (ँ) और श्वसन उपकला (आरई) के साथ लेपित है। ओबी: घ्राण बल्ब, वि।: Vomeronasal अंग (सी) घ्राण उपकला से अटे पट का हिस्सा अलग करने के लिए, ठीक कैंची की एक जोड़ी के साथ प्रदर्शन किया तर्ज पर पट काटा। एस: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Cryosections में और चेहरे की तैयारी एन Kirrel2 immunostaining की 2. तुलना चित्रा। Kirrel2 के लिए immunostained एक प्रसव के बाद दिन 60 (P60) cryosection (ए) confocal छवि (अधिकतम प्रक्षेपण) घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स में प्रोटीन स्थानीयकरण का पता चलता है। एकल घ्राण knobs के मजबूत धुंधला और Kirrel2 सिलिया में स्थानीयकरण माना जाता है (तारांकन), लेकिन अनिश्चित दिखाते हैं। एक P65 घ्राण उपकला (बी) confocal छवि (अधिकतम प्रक्षेपण) चेहरा तैयारी घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की एक सबसेट का सिलिया में स्पष्ट Kirrel2 धुंधला दर्शाती एन । (स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन)9 / 52299fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Cryosections में और चेहरे की तैयारी एन mor-ईजी immunostaining की 3. तुलना चित्रा। घ्राण रिसेप्टर mor-उदाहरण के लिए immunostained एक P60 cryosection (ए) confocal छवि (अधिकतम प्रक्षेपण)। रोमक स्थानीयकरण पहले से ही detectable है। (बी) घ्राण रिसेप्टर mor-उदाहरण के लिए immunostained चेहरा तैयारी एन एक P65 के confocal छवि। Mor-ईजी दृढ़ता से घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स की एक सबसेट का सिलिया में व्यक्त किया है। Cryosections के विपरीत, सिलिया विशेषताओं लंबाई, घुंडी और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण विश्लेषण किया जा सकता प्रति सिलिया की संख्या के विषय में। (बी) में बॉक्सिंग क्षेत्र (सी) उच्च बढ़ाई। (डी) Confocघ्राण रिसेप्टर mor-उदाहरण के लिए immunostained चेहरा तैयारी एन एक भ्रूण दिन 18 (E18) के अल छवि। सिलिया का धुंधला स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। (स्केल सलाखों, 10 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
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