Introduction
Musen luktepitel i näshålan innefattar 6-10.000.000 bipolära lukt sensoriska neuroner 1. Varje lukt neuron väljer en av 1.200 luktreceptorgener för uttryck. Upptäckt av odörer börjar med luktämnen bindning till en luktreceptor 2, som sedan aktiverar adenylylcyklas typ-III (ACIII) 3 via lukt specifika G-protein Ga OLF 4. Den resulterande ökningen av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) öppnar en cyklisk nukleotid-gated (CNG), icke-selektiva katjon kanal som leder till inflöde av Ca2 + och Na +, och därefter Ca2 + inflöde leder till öppnandet av en Ca2 + aktiverad Cl - kanal 5,6. Den resulterande utåt Cl - flux underlättas av en hög intracellulär Cl - koncentration upprätthålls av stadig Cl - upptag, sannolikt via Na + / K + / Cl - cotransporter NKCC1, denCl - / HCO3 - växlar SLC4A1, och kanske ytterligare ännu inte identifierade transportörer 6-8.
Bipolära lukt nervceller har enkel, ogrenade axoner som skjuter direkt till luktbulben, och en dendrit som sträcker sig till ytan av epitelet och slutar som en specialiserad fack, den dendritiska ratten. Från denna knopp, 10-30 cilier, som kan nå en längd på upp till 50-60 um, utgår i slem som täcker epitelytan 9. Proteiner i den kanoniska signaltransduktion kaskad är huvudsakligen lokaliserade i membranet hos dessa cilier. Den ökade sensoriska ytan av epitelet förstärker förmågan att detektera doftämnen. På grund av tätheten av sensoriska neuroner, flimmerhår som sträcker sig från angränsande dendritiska rattar blandas. Denna sammanblandning resulterar i en slumpmässig blandning av cilier från olika neuroner, som uttrycker olika typer av luktreceptorer, på ytan av epitelet. Detektering och cellenular fördelning av ciliära proteiner som endast förekommer i en delmängd av sensoriska neuroner är därför svårt i kryosnitt. Dessutom är den exakta lokaliseringen av sådana proteiner längs cilier knappt möjligt, eftersom kryosnitt är vanligtvis tunnare än den genomsnittliga längden av cilier.
För att möjliggöra utredning av cilie lokalisering av hittills uncharacterized membranproteiner i doft nervceller, optimerad vi ett eget ansikte förberedelse teknik som tillåter en detaljerad analys av protein lokalisering i cilier. I korthet är musen avlivades och huvudet delas nära mittlinjen. Näsmusslorna, nasal och pannben tas bort för att exponera septum. Den septum med lukt delen av fodret epitel lossas genom att skära alla anslutningar till näshålan. Efter att sätta septum i en petriskål fylld med Ringers lösning, är epitelet avskalas und överförs till en belagd glasskiva. Efter en kort fixation steg, kan immunfärgning förfaranden utföras om hanteringen är så skonsamt som möjligt för att undvika skador på den bräckliga vävnaden. Vi visar uppnåe upplösningen genom att jämföra färgningen av två olika membranproteiner i lukt cilier i klassiska kryosnitt och i en face preparat som beskrivs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök hanterades vid Charité eller universitetskliniken Jena i enlighet med tyska Animal Care lagar undvika eventuella otillbörliga djurens lidande.
1. beredning av lösningar och Dissektion Arbetsplats
- Lösningar
OBS: Bered följande lösningar innan dissektion av epitelet.- Lösningar för dissektion förfarandet:
- Bered Ringers lösning (pH 7,4) med koncentrationer av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, och 10 mM glukos.
- Förbered en PBS - / - lösning (pH 7,4) med koncentrationer av 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4, 136 mM NaCl och 8,1 mM Na 2 HPO 4.
- Bered en fixeringslösning (pH 7,2) med koncentrationer av 1 x PBS - / -, 0,2 mM CaCl2, 4% sackaros och 4% paraformaldehyd. Sackaros i fixeringslösning förbättrar kryosektione och hämtning av kryosnitt. Förvara vid -20 ° C.
- Lösningar för färgningsproceduren
- Förbered en PBS + / + lösning med koncentrationer av 1 x PBS - / -, 0,48 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2.
- Förbered en PBST + / + lösning med koncentrationer av 1x PBS + / + och 0,1% Triton X-100.
- Förbered en blockerande lösningen med koncentrationer av 1x PBST + / + och 1% gelatin.
- Lösningar för dissektion förfarandet:
- Arbetsplats
- För dissektion arbetsplatsen, använder ett dissektionsmikroskop med stark belysning, samt en vätskeblockerare penna.
- Förbered en petriskål, fylld med Ringers lösning, och adhesiva glas.
- Skaffa följande kirurgiska instrument: ett par av kirurgiska saxar med en skarp och en trubbig spets, ett par fjäder sax med raka spetsform, två pincett med fin böjd spets form och ett rakblad (
2. Beredning av nässkiljeväggen
- Hus djur i godkända burar med regelbunden tillgång till mat och vatten och lämplig dag / natt cykel.
- Utför anestesi i en sluten behållare som innehåller gasväv indränkt med 100% isofluran och bildskärm smärtlindring genom att testa bakre foten reflexer. Eftersom halsdislokation kan orsaka blod i näshålan, direkt halshugga sövda möss.
- Ta bort huden att exponera benet av hela skallen och näsa, och torka bort den kvarvarande blod och vävnad noggrant med en pappershandduk. Ta bort underkäken och den främre tänderna.
- Incise dorsala ben av näsan bilateralt i 1-2 mm avstånd parallellt med suturlinjen att separera en sida av septum (medialt) från maxilla (lateralt). Split näsan med ett enda snitt. Om benrester och näsmusslorna fortfarande fäst vid septum, ta bort dessa noggrant för att exponera septum heltutan att röra den.
- Ta rygg näsbenet genom att skjuta den fina böjda spetsen av en tång längs ryggsidan av septum, mellan septum och näsben. Applicera lätt tryck på benet, skjut upp den och ta bort den.
- Att ge tillgång till de två septala vävnader, en från varje hålighet, försiktigt bort överkäke av den andra sidan av huvudet. När man förbereder äldre djur (P> 28), ta bort spetsen på pannbenet täcker lukt glödlampor.
- Identifiera luktepitel av dess svagt gul färg (Figur 1B). Den gränsar respiratoriskt epitel är vit och visar förflyttning av rörliga cilier som kan ses under dissekera mikroskop. Klipp längs gränsen mellan lukt och respiratoriskt epitel med ett par fina våren sax.
- Förläng snittet och separera septumet från den ventrala anslutningen till Vomer ben. Skär sedan längs gränsen mellan septum och lamina cribrosa av Os ethmoidale. Den septum är nu helt isolerad från alla anslutningar till huvudet. Använd skär lägen som visas i figur 1C.
3. Isolering av luktepitel för Immunofärgning
- Placera en adhesiv glasskiva i petriskål fylld med Ringers lösning. Placera den på kanten av petriskålen, så att ena halvan av glaset ligger i Ringers lösning (Figur 1A).
- Använd en pincett för att noggrant överföra SILBEN benet med luktepitel i petriskålen. Lyft det utan att ta tag den med pincetten tips.
- Ta den vinkelräta plattan hos SILBEN benet med en pincett och använda en andra en för att försiktigt avlägsna epitelet från en sida av septum. Skjut den böjda spetsen mellan den vinkelräta plattan och epitel att skala epitelet av.
- Var alltid noga med att identifiera strålkroppen sidan, ifall epitelet vänder i Ringers solutipå. Om epitel vänder, är det knappast möjligt att identifiera strålkroppen sidan efteråt. Mestadels, rullar epitelet upp med ciliära ytan inuti.
- Jämför den inskrivna vävnaden form med skär lägen som visas i figur 1C. Ta epitelet vid en position vid gränsen och dra den på glasskiva. Rör inte strålkroppen sidan med pincett för att undvika skador i vävnaden.
- Vänd septum och upprepa proceduren med epitel från andra sidan.
- Torka glasskiva runt båda bitar av luktepitel med en pappershandduk och omringa vävnaden med en vätska blockerare penna.
- Fäst vävnaden med 150 | il fixeringslösning i 10 min vid RT. Beträffande Cilia stabilitet och integritet, använda korta fixeringstider för en mängd olika testade antikroppar. Inom dessa 10 min cilier är fasta, men förmodligen inte hela epitel vävnad. Således omedelbar visualisera med mikroskopet efter de slande förfarande. Dock kanske fästTiderna varierar för enskilda antikroppar.
4. Färgningsprotokoll
OBS: Hantera vävnaden mycket noga för att bevara ciliära strukturer lukt sensoriska nervceller. Ta lösningar genom pipettering. Tappa inga lösningar direkt på epitel, som mekaniska krafter kunde störa den fina flimmerhår. Utför alla steg vid RT om inte annat anges.
- Avlägsna fixeringslösning och tvätta två gånger med PBS + / +.
- Inkubera epitelet under minst 1 h med blockeringslösning.
- Bered primär antikroppslösning genom upplösning av antikroppen i blockeringslösning (1: 200 för de antikroppar som användes i denna studie) och centrifugera under 5 min vid full hastighet för att avlägsna eventuella fällningar.
- Inkubera epitel med antikroppslösning i en fuktig kammare vid 4 ° CO / N.
- Tvätta epitel med PBS + / + 5 min minst 3 gånger.
- Förbered sekundär antikroppslösning genom upplösning av antikroppen i blockeringslösning (1: 500) och centrifugera under 5 min vid full hastighet.
- Inkubera epitelet med sekundär antikroppslösning under 1 timme i en mörk kammare.
- Tvätta epitel med PBS + / + 5 min minst 3 gånger.
- Avlägsna vätskan-blockerare med ett rakblad eller en pappershandduk. Tvätta epitel med destillerat vatten i 5 s.
- Bevara vävnaden i antifade monterings reagens.
OBS: bakgrundsfluorescens ökar snabbt inom dagar; mikroskopiska analysen senast 2 dagar efter inbäddning i monteringsmedium rekommenderas därför. Särskild försiktighet måste iakttas för att inte pressa vävnaden vid sökning rätt fokalplanet, eftersom det allvarligt kan skada beredningen. På grund av out-of-fokus fluorescens, är ytterligare utredning med konfokalmikroskopi rekommenderas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Luktepitel sv preparat ansikte kan användas för att undersöka lokalisering av proteiner i cilier av sensoriska neuroner, vilket gör att detaljerad undersökning av proteiner vars lokalisering är oklart efter analys av kryosnitt. Detta problem kan exemplifieras i fallet med färgning för Kin i IRRE liknande protein 2 (Kirrel2). Kirrel2 (även kallad Neph3) är en medlem av immunglobulin (Ig) superfamiljen av membranproteiner och fungerar som en homofil adhesionsproteinet. Det visade sig spela en roll i axon-vägledning i luktsystemet, och för att uttryckas i en delmängd av lukt nervceller i en aktivitet beroende sätt 10.
Immunofärgning för Kirrel2 i en typisk kryosektion genom luktepitel avslöjade lokalisering av Kirrel2 i axoner, soma och dendriter (Figur 2A). Alla lösningar framställdes såsom beskrivits ovan för en face beredningsteknik. Även om vissa labeling visas på toppen av lagret består av de dendritiska rattar förblev ciliär lokalisering osäkert efter analys av kryosnitt. Vissa nervceller uppvisade färgning i och kring deras lukt knopp, men enstaka cilier var svåra att identifiera. I kontrast, en face beredning av det olfaktoriska epitelet utföras enligt det ovan beskrivna protokollet otvetydigt visade ciliär lokalisering av Kirrel2 (Figur 2B). Intressant Kirrel2 uttrycktes endast i cilier av en relativt liten undergrupp av olfaktoriska neuroner, fastän analys av färgade kryosnitt uppvisade expression i en mycket större andel av neuroner. Dessutom hade en face preparatet inte bara visa ciliär färgning i allmänhet, men avslöjade variationer i strålkroppen uttrycksmönster som sträcker sig från nervceller med många långa cilier till nervceller med endast ett fåtal korta cilier. I vissa celler, Kirrel2 detekteras i den dendritiska ratten, men inte i cilier som sträcker sig från denna knopp. Den c AAnvända och funktionell relevansen av detta fynd återstår att klarlagd men det illustrerar potentialen i en face förberedelse för att ge nya insikter i protein lokalisering i luktsystemet.
Dessutom utförde vi ett immunfärgning för luktreceptor Mor-EG, som uppvisar stark ciliär uttryck 11. Receptorn är redan tydligt identifierbara i strålkroppen skiktet i kryosnitt (Figur 3A). Ändå är det inte möjligt analys av de detaljerade egenskaper såsom antalet cilier per ratten eller längden på enskilda cilier. Använda ansikts förberedelse för sv, identifiering av cilier från nervceller som uttrycker luktreceptor är lätt möjligt (Figur 3B, C). Den en face preparatet kan utföras med djur i olika åldrar. Även cilier från prenatala djur framgångsrikt färgade och visualiseras (figur 3D).
innehåll "> En förberedelser ansikte utgör därför ett verktyg väl lämpad att analysera ciliary morfologi och lokalisering av välkända ciliära proteiner i detalj.
Figur 1. Beredning av musens huvud. (A) Arrangemang av dissektion arbetsplatsen. Petriskål fylls med Ringers lösning och håller en vidhäftande glasskiva. De kirurgiska instrument rekommenderas för en face beredning. (B) Efter att ha avlägsnat en halv av musen huvudet, är skiljeväggen exponeras. Den septum är belagd med luktepitel (OE) och respiratoriskt epitel (RE). OB: luktbulben, V:. Vomeronasalorganet (C) För att isolera den del av septum fodrad med luktepitel, skär septum längs de påvisade linjer med ett par fina sax. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Jämförelse av Kirrel2 immunfärgning i kryosnitt och eget preparat ansikte. (A) Confocal bild (max projektion) av en postnatal dag 60 (P60) kryosektion immunostained för Kirrel2 avslöjar protein lokalisering i lukt sensoriska neuroner. Enstaka lukt knoppar visar stark färgning och Kirrel2 lokalisering i cilier antas (asterisk), men osäker. (B) Confocal bild (max projektion) av en P65 luktepitel en face beredning uppvisar tydliga Kirrel2 färgning i cilier av en delmängd av luktsinnet sensoriska neuroner . (Skalstrecken, 10 | im)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Jämförelse av Mor-EG immunfärgning i kryosnitt och eget preparat ansikte. (A) Confocal bild (max projektion) av en P60 kryosektion immunostained för luktreceptor Mor-EG. Strålkroppen lokalisering redan detekterbar. (B) Confocal bild av en P65 en face förberedelse immunostained för luktreceptor Mor-EG. Mor-EG uttrycks starkt i cilier av en delmängd av lukt sensoriska neuroner. I motsats till kryosnitt, cilier egenskaper avseende längd, antal cilier per knopp och exakta proteinlokalisering kan analyseras. (C) Högre förstoring av det inramade området i (B). (D) Confocal bilden av en embryonal dag 18 (E18) en face förberedelse immunostained för luktreceptor Mor-EG. Färgning av cilier kan tydligt ses. (Skala barer, 10 um) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P.
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
