Introduction
El epitelio olfatorio del ratón en la cavidad nasal comprende 6-10000000 bipolares neuronas sensoriales olfativas 1. Cada neurona olfativa elige una de 1.200 genes de receptores odoríferos para la expresión. Detección de los odorantes comienza por la unión a un receptor olfativo 2, que entonces activa la adenilato ciclasa de tipo III (ACIII) 3 a través de la proteína G específica olfativa Ga olf 4 odorante. El consiguiente aumento de la adenosina monofosfato cíclico (cAMP) abre un nucleótido cíclico-cerrada (GNC), canal catiónico no selectivo que conduce a afluencia de Ca 2+ y Na +, y, posteriormente, Ca 2 + afluencia conduce a la apertura de un Cl Ca 2+ activado - canal de 5,6. El resultante hacia afuera Cl - flujo es facilitado por un alto Cl intracelular - concentración constante mantenida por Cl - absorción, probablemente a través de la Na + / K + / Cl - NKCC1 cotransportador, laCl - / HCO 3 - SLC4A1 intercambiador, y tal vez los transportistas adicionales aún por identificar 6-8.
Neuronas olfativas bipolares tienen axones individuales, no ramificados que se proyectan directamente al bulbo olfatorio, y una dendrita que se extiende a la superficie del epitelio y termina como un compartimento especializado, el mando dendríticas. De este mando, 10-30 cilios, que puede alcanzar una longitud de hasta 50-60 micras, emanar en el moco que cubre la superficie epitelial 9. Las proteínas de la cascada de transducción de señal canónica se localizan principalmente en la membrana de estas cilios. El aumento de la superficie del epitelio sensorial amplifica la capacidad de detectar olores. Debido a la densidad de las neuronas sensoriales, cilios que se extiende desde las perillas dendríticas vecinos se entremezclan. Esta interrelación resultados en una mezcla aleatoria de los cilios de diferentes neuronas, que expresan diferentes tipos de receptores olfativos, en la superficie del epitelio. La detección y la célulaular asignación de las proteínas ciliares que sólo están presentes en un subconjunto de neuronas sensoriales tanto, es difícil en criosecciones. Además, la localización precisa de dichas proteínas a lo largo de los cilios es apenas posible, ya que cryosections son típicamente más delgada que la longitud media de los cilios.
Para permitir la investigación de ciliar localización de las proteínas de membrana hasta ahora no caracterizados en las neuronas olfativas, hemos optimizado una técnica de preparación de la cara en la que permite el análisis detallado de la localización de proteínas en los cilios. En pocas palabras, se sacrifica el ratón y la cabeza dividió cerca de la línea media. Los cornetes, nasal, y los huesos frontales se retiran para exponer el tabique. El tabique con la parte olfativa del epitelio de revestimiento se afloja mediante la reducción de todas las conexiones a la cavidad nasal. Después de poner el tabique en una placa de Petri llena con solución de Ringer, el epitelio se despega und transferido a un portaobjetos de vidrio recubierto. Tras una breve fixatpaso de iones, procedimientos inmunotinción se puede realizar si la manipulación es tan suave como sea posible para evitar el daño del tejido frágil. Se demuestra la resolución alcanzable mediante la comparación de la tinción de dos proteínas de membrana diferentes en cilios olfatorios en cryosections clásicos y en la preparación cara es descrito.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos los animales procedimientos fueron manejados en la Charité o Clínica Universitaria de Jena de acuerdo con las leyes de Cuidado Animal alemanes evitando cualquier sufrimiento innecesario de los animales.
1. Soluciones Preparación y Disección del lugar de trabajo
- Soluciones
NOTA: Preparar las siguientes soluciones antes de comenzar la disección del epitelio.- Soluciones para el procedimiento de disección:
- Preparar la solución de Ringer (pH 7,4) con concentraciones de NaCl 140 mM, KCl 5 mM, HEPES 10 mM, 2 mM CaCl 2, 1 mM de MgCl 2, y glucosa 10 mM.
- Preparar una PBS - / - solución (pH 7,4) con concentraciones de 2.68 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4, NaCl 136 mM, y 8,1 mM Na 2 HPO 4.
- Preparar una solución de fijación (pH 7,2) con concentraciones de 1x PBS - / -, 0,2 mM CaCl 2, 4% de sacarosa, y 4% de paraformaldehído. La sacarosa en la solución de fijación mejora crioseccionamiento y recoger de cryosections. Almacenar a -20 ° C.
- Soluciones para el procedimiento de tinción
- Preparar un PBS + / + solución con concentraciones de 1x PBS - / -, 0,48 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2.
- Preparar una PBST + / + solución con concentraciones de 1x PBS + / + y 0,1% de Triton X-100.
- Preparar una solución de bloqueo con concentraciones de 1x PBST + / + y 1% de gelatina.
- Soluciones para el procedimiento de disección:
- Lugar de trabajo
- Para el lugar de trabajo de disección, usar un microscopio de disección con una iluminación brillante, así como una pluma líquido-bloqueante.
- Preparar una placa de Petri, lleno de solución de Ringer, y portaobjetos de vidrio adhesivas.
- Obtenga los siguientes instrumentos quirúrgicos: un par de tijeras quirúrgicas con un sostenido y una punta roma, un par de tijeras de primavera con forma de punta recta, dos pinzas con forma de punta curva fina y una hoja de afeitar (
2. Preparación del tabique nasal
- Casa animales en jaulas aprobados con acceso regular a alimentos y agua y el ciclo día / noche apropiada.
- Realizar la anestesia en un recipiente que contiene una gasa empapada cerrado con 100% de isoflurano y el monitor analgesia probando los reflejos del pie trasero. Desde dislocación cervical puede causar que la sangre en las cavidades nasales, decapitar directamente ratones anestesiados.
- Quitar la piel para exponer el hueso de todo el cráneo y la nariz, y limpiar la sangre y el tejido restante a fondo usando una toalla de papel. Retire la mandíbula inferior y los dientes delanteros.
- Incisión en la médula dorsal de la nariz bilateralmente en 1-2 mm de distancia paralela a la línea de sutura para separar un lado del tabique (medial) de la maxilar (lateralmente). Dividir la nariz con un solo corte. Si los restos de hueso y cornetes todavía están unidos al tabique, eliminar estas cuidadosamente para exponer el tabique completamentesin tocarlo.
- Quitar el hueso nasal dorsal deslizando la punta curvada multa de una pinza a lo largo de la cara dorsal del tabique, entre el septo y el hueso nasal. Aplique una ligera presión sobre el hueso, empuje hacia arriba y retírela.
- Para proporcionar acceso a los dos tejidos septales, uno de cada cavidad, retirar cuidadosamente el maxilar superior del otro lado de la cabeza. En la preparación de los animales más viejos (P> 28), retire la punta del hueso frontal que cubre los bulbos olfatorios.
- Identificar el epitelio olfativo por su color ligeramente amarillo (Figura 1B). El epitelio respiratorio bordeando es blanco y muestra el movimiento de los cilios móviles que puede ser vista bajo el microscopio de disección. Corte a lo largo de la frontera entre el epitelio olfativo y respiratoria con un par de tijeras finas primavera.
- Extienda el corte y separar el tabique de la conexión ventral al hueso vómer. A continuación, corte a lo largo de la frontera entre el tabique y la lámina cribosa del etmoides Ose. El tabique está completamente aislado de todas las conexiones a la cabeza. Use las posiciones de corte mostradas en la Figura 1C.
3. El aislamiento del epitelio olfativo para Inmunoticción
- Publicar un portaobjetos de vidrio adhesivo en la placa de Petri llena con solución de Ringer. Colocarlo sobre el borde de la placa de Petri, de manera que una mitad del vidrio se encuentra en solución de Ringer (Figura 1A).
- Utilice unas pinzas para transferir cuidadosamente el hueso etmoidal con el epitelio olfativo a la placa de Petri. Levante sin agarrarlo con las puntas de las pinzas.
- Coge la placa perpendicular del hueso etmoides con uno fórceps y utilizar un segundo uno para quitar cuidadosamente el epitelio de un lado del tabique. Deslice la punta curvada entre la lámina perpendicular y el epitelio de pelar el epitelio apagado.
- Sé siempre asegúrese de identificar el lado ciliar, en caso de que el epitelio voltea en soluti de Ringeren. Si el epitelio voltea, no es posible identificar el lado ciliar después. Sobre todo, el epitelio se enrolla con la superficie ciliar dentro.
- Comparar la forma de tejido inscrito con las posiciones de corte mostrado en la Figura 1C. Coge el epitelio en una posición en la frontera y tire de ella en el portaobjetos de vidrio. No toque el lado ciliar con las pinzas para evitar lesiones del tejido.
- Girar el septum y repetir el procedimiento con el epitelio desde el otro lado.
- Seque el portaobjetos de vidrio alrededor de las dos piezas de epitelio olfativo con una toalla de papel y rodear el tejido con un lápiz líquido bloqueador.
- Fijar el tejido con la solución de fijación 150 l durante 10 min a RT. En cuanto a la estabilidad y la integridad de los cilios, usar tiempos de fijación cortos para una variedad de anticuerpos ensayados. Dentro de estos 10 min cilios son fijos, pero probablemente no todo el tejido epitelial. Por lo tanto, visualizar inmediata con el microscopio después de los scontienen procedimiento. Sin embargo, los tiempos pueden variar para la adherencia de anticuerpos individuales.
4. Protocolo de tinción
NOTA: Maneje el tejido con mucho cuidado para preservar las estructuras ciliares de las neuronas sensoriales olfativas. Retire soluciones con la pipeta. No deje caer alguna solución directamente sobre el epitelio, como las fuerzas mecánicas podrían interrumpir la multa cilios. Realice todos los pasos a temperatura ambiente si no se indica lo contrario.
- Eliminar la solución de fijador y lavar 2 veces con PBS + / +.
- Incubar el epitelio durante al menos 1 hora con solución de bloqueo.
- Preparar la solución de anticuerpo primario mediante la disolución del anticuerpo en solución de bloqueo (1: 200 para los anticuerpos utilizados en este estudio) y centrifugar durante 5 min a velocidad máxima para eliminar cualquier precipitado.
- Incubar el epitelio con una solución de anticuerpo en una cámara húmeda a 4 ° CO / N.
- Epitelio lavado con PBS + / + durante 5 minutos al menos 3 veces.
- Preparar la solución de anticuerpo secundario disolviendo el anticuerpo en solución de bloqueo (1: 500) y centrifugar durante 5 min a toda velocidad.
- Incubar el epitelio con una solución de anticuerpo secundario durante 1 hr en una cámara oscura.
- Epitelio lavado con PBS + / + durante 5 minutos al menos 3 veces.
- Retire el líquido bloqueador con una hoja de afeitar o una toalla de papel. Lave el epitelio con agua destilada durante 5 s.
- Preservar el tejido en antifade reactivo montaje.
NOTA: La fluorescencia de fondo se incrementa rápidamente en cuestión de días; Por lo tanto, se recomienda el análisis microscópico, a más de 2 días después de la incorporación en medio de montaje. Especial cuidado se debe tener de no apretar el tejido cuando se busca el plano focal correcta, ya que puede dañar seriamente la preparación. Debido a la fluorescencia fuera de foco, se recomienda investigación adicional con microscopía confocal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Epitelio olfatorio en los preparativos de la cara puede ser utilizado para investigar la localización de las proteínas en los cilios de las neuronas sensoriales, lo que permite la investigación detallada de las proteínas cuya localización está claro después de un análisis de cryosections. Este problema puede ser ejemplificado en el caso de la tinción de la proteína para Kin-IRRE como 2 (Kirrel2). Kirrel2 (también llamado Neph3) es un miembro de la superfamilia de proteínas y funciones de la membrana de inmunoglobulina (Ig) como una proteína de adhesión homophilic. Se ha demostrado desempeñar un papel en axón-orientación en el sistema olfativo, y que se expresa en un subconjunto de neuronas olfativas en una manera dependiente de la actividad 10.
La inmunotinción para Kirrel2 en un cryosection típica a través de epitelio olfativo localización de Kirrel2 en los axones, soma y dendritas (Figura 2A) reveló. Todas las soluciones se prepararon como se ha descrito anteriormente para la cara técnica de preparación en. Aunque algunos lAbeling aparece en la parte superior de la capa compuesta de los mandos dendríticas, localización ciliar seguía siendo incierto tras el análisis de cryosections. Algunas neuronas mostraron tinción en y alrededor de su mando olfativo, pero cilios individuales eran difíciles de identificar. En contraste, en la preparación de cara del epitelio olfativo realizado de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente mostraron de manera inequívoca ciliar localización de Kirrel2 (Figura 2B). Curiosamente, Kirrel2 sólo se expresó en los cilios de un subconjunto relativamente pequeño de las neuronas olfativas, aunque el análisis de cryosections teñidas mostró expresión en un porcentaje mucho mayor de las neuronas. Por otra parte, la preparación en cara no sólo se tiñe ciliar en general, pero reveló variaciones en los patrones de expresión ciliares que van desde las neuronas con muchos cilios largo de las neuronas con sólo unos pocos cilios corto. En algunas células, Kirrel2 se detectó en el mando dendrítica, pero no en los cilios que se extienden desde este mando. El c ausa y relevancia funcional de este hallazgo aún no se ha dilucidado, pero ilustra el potencial de la preparación de cara en proporcionar nuevos conocimientos sobre la localización de la proteína en el sistema olfativo.
Además, se realizó una inmunotinción para el receptor olfativo Mor-EG, que exhibe una fuerte expresión ciliar 11. El receptor es ya claramente identificable en la capa ciliar en criosecciones (Figura 3A). Sin embargo, el análisis de las características detalladas tales como el número de los cilios por mando o la longitud de los cilios individuo no es posible. Uso de la preparación en face, la identificación de los cilios de las neuronas que expresan el receptor olfativo es fácilmente posible (Figura 3B, C). La preparación en la cara se puede realizar con animales de diferentes edades. Incluso los cilios de animales prenatales se tiñeron y se visualizaron (Figura 3D) con éxito.
contenido "> En los preparativos de cara, por tanto, representan una herramienta muy adecuada para analizar la morfología ciliar y la localización de las proteínas ciliares conocidas en detalle.
Figura 1. Preparación de la cabeza del ratón. (A) Disposición de los lugares de trabajo de disección. Placa de Petri se llena con solución de Ringer y tiene un portaobjetos de vidrio adhesivo. Se recomiendan los instrumentos quirúrgicos para la preparación en la cara. (B) Después de retirar una media de la cabeza del ratón, el tabique está expuesto. El tabique está recubierto con epitelio olfativo (OE) y el epitelio respiratorio (RE). OB: bulbo olfatorio, V:. Órgano vomeronasal (C) Para aislar la parte del tabique forrado con epitelio olfativo, corte el tabique lo largo de las líneas demostrado con un par de tijeras finas. s: //www.jove.com/files/ftp_upload/52299/52299fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Comparación de Kirrel2 inmunotinción en cryosections y en los preparativos de cara. (A) Imagen confocal (proyección máxima) de un 60 (P60) criosección día postnatal inmunoteñidas para Kirrel2 revela la localización de proteínas en las neuronas sensoriales olfativas. Perillas individuales olfativas muestran una tinción fuerte y Kirrel2 se supone localización en los cilios (asterisco), pero incierto. (B) Confocal imagen (proyección máxima) de un epitelio olfativo P65 en la preparación de cara exhibe tinción Kirrel2 claro en los cilios de un subconjunto de neuronas sensoriales olfativas . (Barras de escala, 10 micras)9 / 52299fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Comparación de Mor-EG inmunotinción en cryosections y en los preparativos de cara. (A) Imagen confocal (proyección máxima) de un criosección P60 inmunoteñidas para el receptor olfativo Mor-EG. Localización ciliar ya es detectable. (B) Imagen confocal de un P65 en la preparación de cara inmunoteñidas para el receptor olfativo Mor-EG. Mor-EG se expresa fuertemente en los cilios de un subconjunto de neuronas sensoriales olfativas. En contraste con cryosections, características cilios relativa a longitud, el número de los cilios por la perilla y la localización exacta de proteína pueden ser analizados. (C) Un mayor aumento de la zona de caja en (B). (D) Confocal imagen de un día embrionario 18 (E18) en la preparación de cara inmunoteñidas para el receptor olfativo Mor-EG. La tinción de los cilios puede verse claramente. (Las barras de escala, 10 micras) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
