Introduction
キイロショウジョウバエ ：発達と細胞生物学の分野が大幅にモデル生物の影響を受けてきた。このモデルの中では、目のディスクの研究はシグナル伝達、細胞生物学やその他の分野に関する知識を大いに貢献してきました。後半に第三の幼虫齢目のディスクが広く研究し、それが発達期間の一連のスナップショットを与えるように、利用するための強力なモデルであるされている、独自のシグナリング分子、およびプロセスとのそれぞれが、形態形成溝は、目のディスクを横切って進むにつれて8。しかし、更なる発展の蛹の段階に発達過程の理解を拡大する必要性がある。蛹のアイディスク3-7の研究がなされてきた一方で、私たちの知識は3齢目のディスクに行われている仕事の幅広さに近づかない。これは、蛹のアイディスク解剖で大きな困難に一部起因している。したがって、プレゼンテーション解剖の適切な方法が大幅にこの分野の研究を展開することができます。
簡単に、特に中旬蛹期間を中心に、解剖された蛹のアイディスク開発中の段階がありますが、他の期間は、はるかに困難な解剖べきである。このプロトコルは、普遍的にすべての蛹の発育時間枠のために使用することができる蛹目ディスクを切開するための1つの方法を表している。このプロトコルは、midpupal時点から目ディスクを分析するための簡単かつ迅速に方法を示す別のプロトコル9の代替として使用することができる。このプロトコルは、もともと撮影さと機能ゲノミクス（URCFG）蛹眼の解剖の手法で10,11でUCLAの学部研究コンソーシアムで高度な学部学生を訓練するために開発されました。多くの学部学生がこのような厳しいテクニックを学ぶためにこのビデオと方法を利用することができました。
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Protocol
この手順では、2日間の処置である。
1日目（2時間+解剖時間）
1.蛹アイディスク解剖
- 解剖用の蛹を選択します。
注：解剖する蛹の年齢は実験的なニーズによって決定されます。しかし、細胞の形態を検査した場合、これはしばしば、ビデオに示す蛹の年齢である25℃、蛹殻形成（APF）の後42時間で行われる。濡れた絵筆で（0時間APF考えられる）白い蛹を収集し、25℃に維持し、新しいフライ食品バイアル中で（収集時間に基づいて）時系列順に並べ。できるだけ近い蛹間の時間差を維持するために、この同じ時系列順に熟成蛹を解剖。 - シリコーン解剖板上のリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4で、レシピの材料を参照のこと）の低下に蛹を転送する。
- 鉗子やピアスと蛹のケースの上部を持ち、Lを開く鋭いピンセットで蛹ケースのower部分。新たに形成された穴にケースから蛹を削除します。
- 蛹でハサミで斜めカット、半ば胸部を作る。破片を除去またはPBSの新しいドロップに蛹ヘッドを移す。ピペット送風管を使用してクリーニングし（詳細は材料および図1を参照）、必要に応じて追加のPBSを加える。脱水症状を避けるために確認してください。
- しっかりとグリップピンセットで蛹頭部キューティクルの最上部。送風管の先端を使用して、穏やかに蛹のケースから、眼のディスクを含む、脳および他の組織を押し出すために蛹のケースに押し込み。キューティクル内の任意の組織をつかん避けるようにしてください。
- PBSを充填した送風管を使用して、穏やかに明確に分離し、脳および目のディスクを識別するために、ヘッドケースから脂肪体組織および他の破片を吹く。
注：蛹ヘッドケースに付着した脳を維持することは、研究者が彼を使用できるようになります目のディスクや脳に損傷を与えることなく、組織の将来の操作のための「ハンドル」として広告のケース。しかし、ヘッドケースから脳および目のディスクを除去することが一般的であり、これは全体的な手順および結果に有害ではない。それは頻繁に成功蛹ヘッドケース内および彼らが周囲の組織から明確に分離されるように、目からディスクと脳を抽出するために吹いてプッシュする複数の試みを取る。よりクリーンで別々の1は、目のディスクに固定から余分な組織を防ぐことができます周囲の組織からのアイディスクを得ることができます。 - 切開の後、すぐに修正溶液0.5ml（材料を参照）、氷上で3ウェルガラス皿に組織を移す。数分間定着液（それは目のディスクの次のセットを分析するのにかかる時間は、通常）の表面上の組織フロート。
注記 ：これは解剖のこのラウンドで解剖された最初のアイディスクでない場合、completelyは修正液中に前のアイディスクを水没。特殊な染色手順（ 例えば 、活性酸素種、リソソームなど）を実行する場合、これは固定前に行う必要があります。これを行うために、適切な染色プロトコルを継続する前に、氷冷PBS中で解剖目ディスクを格納する。 - 解剖されているすべてのアイディスクの解剖や水没に続いて、30分間室温でロッカーや岩に3ウェルガラス皿を移動します。
2.免疫染色
- 慎重に修正液を除去し、0.3％トリトンX-100を含むPBSを0.5mlを加える（0.3％PBT、材料を参照）、10分間、ロッカー上で組織を洗浄する。 4回の洗浄（各10分）の合計のために、この手順を3回繰り返します。
注意：ウェルから溶液を注意深く除去は、組織の損傷または損失を防止するために、解剖顕微鏡下で行うことができる。溶液はピペットで慎重に吸引することができる。我々は、ファインtippeを好むdは、開口部は、組織を吸引する可能性を低減するために平坦化されてきた使い捨てトランスファーピペット。 - 第4回の洗浄の最後に、洗浄液を除去し、ウェルに（材料を参照）0.5ミリリットルブロック溶液を追加し、30分間インキュベートする。
注：この時間枠は、あなたのニーズに応じて拡張することができます。 - 30分間のブロック時間の終了時に、マイクロウェルプレートのウェルに適切な数にする（ブロック溶液中に希釈された）一次抗体溶液の10μlをピペット。
NOTE：マイクロウェルプレートの一つのウェルは蛹ケースに取り付けアイディスクの約4対または添付脳眼ディスクの8孤立対を収容する。 （：500希釈1）および抗カット（1：200希釈）代表的なデータについては、このプロトコルで使用される一次抗体は、抗ホスホチロシンです。 - 3ウェルガラス皿から一次抗体溶液を充填したマイクロウェルプレートのウェルに解剖した組織を移す。
- 場所湿らせたペーパータオルの上マイクロウェルプレートは、4℃で一晩、空のピペットチップボックス（または他の類似の容器）とストア内（脱水を防ぐため）。
2日目（4時間+実装時間）
- 0.3％PBT（≈0.5ml）で新しい3ウェルガラス皿にマイクロウェルプレートからの組織を移し、ロッカー上で10分間組織を洗う。 4回の洗浄（各10分）の合計のために、このステップを3回以上繰り返します
- 最後の洗浄液を取り出し、ウェルにブロック溶液0.5mlを加える。 30分間ブロックする。
注：この時間枠は、あなたのニーズに応じて拡張することができます。 - ブロック溶液を除去し、ウェルに二次抗体溶液（ブロック溶液中に希釈し、あなたの一次抗体および蛍光波長に適した蛍光標識された抗体から作られる）の0.5ミリリットルを追加し、カバーまたはアルミニウムで光から3ウェルガラス皿を保護箔、室温で少なくとも2時間インキュベート温度。
注：すべてのその後の工程は、同様に、露光から保護されるべきである。このインキュベーションは、一次抗体のインキュベーションと同様のセットアップで、4℃で一晩延長することができるが、抗体の保存が望まれる場合、それはまた、実験用フィルム、またはマイクロウェルプレートで覆われた3ウェルガラス皿中で行うことができる。 - 抗体インキュベーションの終わりに、二次抗体溶液を除去し、ウェルに0.3％PBT 0.5mlを追加し、10分間ロッカー上洗う。 4回の洗浄（各10分）の合計に対して、この手順を繰り返します。
注：（：1,000希釈1）DAPI染色が必要な場合は、最初の洗浄を開始する前に、最初の洗浄のために使用されるPBTの500μlに（資料を参照）、DAPIストック溶液0.5μlを添加する。
3.取付
- 最後の洗浄の終わりには、brのを除去するための媒体としての70％グリセロールまたはPBSを使用して、スライド上の触角/眼、ディスクをマウントアインスライドの一方の側に、プール内の他の望ましくない組織。
- 慎重に鉗子間の静水圧を用いて組織を動かし、または非常に優しく鉗子先端で、スライドの中心に向かって列内の目のディスクをラインアップ。
- 組織の周りからすべての余分なグリセロールまたはPBSを取り外します（研究室のウィッキング作用を利用してワイプまたは鉗子は、このために働く）。
- 目のディスク列の一辺に沿って封入剤を少量（≈10μl）を置き、目のディスクに封入剤を広がるように組織上カバースリップを置く。
- スライドが完全に広がる組織/封入を可能にするために1〜2分間放置します。
- カバースリップのエッジの周りから余分な封入剤を拭き取り、明確なマニキュアでそれを封印。
- 共焦点顕微鏡を用いて眼ディスクの蛍光画像をキャプチャします。
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Representative Results
このプロトコルの使用例として、異なる抗体で免疫染色midpupalを示す結果（42時間APF 25°Cで）眼のディスクはホスホチロシン残基に対する抗体を使用することにより、図2に示されている、細胞の膜とすることができる観測された（ 図2A）。これはmidpupal段階の前に発生する最後のパターニングプロセス以下蛹眼の個眼細胞の規則的な配列を同定するために用いることができる。別の代表的な画像は、錐体細胞の核がカット転写因子（ 図2B）に対する抗体を用いて同定されることができ示す。
図1：解剖手順で使用送風管のアセンブリー·ダイアグラム番目の詳細については、材料のセクションを参照してください送風管のeは、個別のコンポーネント。
図2：midpupal目のディスクの免疫染色代表免疫染色は、Aを視覚化するためにこのプロトコルの使用を実証する）個眼の頂端形態（ホスホチロシン）とB）コーン細胞核（カット）42時間APFでの蛹のアイディスクから。スケールバー=50μmである。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
