Introduction
I campi di biologia dello sviluppo e delle cellule sono stati notevolmente influenzati dalla organismo modello: Drosophila melanogaster. All'interno di questo modello, gli studi del disco occhi hanno contribuito una grande quantità di conoscenze in materia di segnalazione, biologia cellulare e in altri settori. Il terzo disco in ritardo stadio larvale occhio è stato ampiamente studiato ed è un potente modello di utilizzare, in quanto dà una fotografia istantanea di una serie di periodi di sviluppo, ciascuno con le proprie molecole e dei processi di segnalazione unica, come il solco morfogenetica progredisce attraverso il disco occhio 8. Tuttavia, vi è la necessità di ampliare ulteriormente la nostra comprensione dei processi di sviluppo nella fase di pupa dello sviluppo. Mentre ci sono stati studi sul disco occhio pupa 3-7, la nostra conoscenza non si avvicina l'ampiezza del lavoro che è stato eseguito il terzo disco instar occhio. Ciò è dovuto, in parte, alla maggiore difficoltà di sezionare il disco dell'occhio pupa. Pertanto, una presentazione delcorretto metodo di dissezione potrebbe espandere notevolmente la ricerca in questo settore.
Mentre ci sono fasi di sviluppo all'interno di pupa disco occhio che sono facilmente sezionati, in particolare intorno alla metà del periodo di pupa, altri periodi di tempo sono molto più difficili da sezionare. Questo protocollo rappresenta un metodo per sezionare i dischi degli occhi pupa che può essere usato universalmente per tutte le pupe tempi di sviluppo. Questo protocollo può essere utilizzato in alternativa a un altro protocollo 9, che mostra un metodo semplice e veloce per sezionare i dischi occhio dai punti temporali midpupal. Questo protocollo è stato originariamente girato e sviluppato per la formazione di studenti universitari avanzati in Undergraduate Research Consortium UCLA in Genomica Funzionale (URCFG) 10,11 nella tecnica di pupa dissezione dell'occhio. Molti studenti universitari sono stati in grado di utilizzare questo video e metodo per imparare questa tecnica impegnativa.
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Protocol
Questa procedura è una procedura di 2 giorni.
1 ° giorno (2 ore + tempo di dissezione)
1. pupa Disco Eye Dissection
- Selezionare una pupa per la dissezione.
NOTA: L'età della pupa essere sezionato sarà determinata dalle esigenze sperimentali. Tuttavia, se l'esame di morfologia cellulare, questo è spesso fatto a 42 ore dopo la formazione puparium (APF) a 25 ° C, che è l'età delle pupe mostrato nel video. Raccogliere bianco pupe (considerato APF 0 ore) con un pennello bagnata e disporli in ordine cronologico (in base al tempo di raccolta) in un nuovo flacone mosca cibo mantenuta a 25 ° C. Sezionare il pupe affinato in questo stesso ordine cronologico di mantenere le differenze di tempo tra pupe più vicino possibile. - Trasferire la pupa in una goccia di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, vedi materiali per ricetta) su una piastra di dissezione silicone.
- Tenere la parte superiore del case pupa con una pinza e forare e aprire il lparte ower del caso pupa con un paio di pinze taglienti. Rimuovere la pupa dal caso nel foro appena formata.
- Fare un taglio diagonale con le forbici, a metà del torace, in pupa. Rimuovere i detriti o trasferire la testa pupa di una nuova goccia di PBS. Pulire utilizzando il tubo pipetta soffiante (vedi materiali e la Figura 1 per i dettagli) e aggiungere ulteriori PBS, se necessario. Assicurati di evitare la disidratazione.
- Afferrare saldamente la parte superiore della cuticola testa di pupa con un paio di pinze. Utilizzando la punta del tubo soffiatore, premere delicatamente sul caso pupa per estrudere il cervello e altri tessuti, tra cui i dischi degli occhi, fuori dal bozzolo. Essere sicuri di evitare di afferrare qualsiasi tessuto all'interno della cuticola.
- Utilizzando il tubo soffiatore riempito con PBS, soffiare delicatamente il tessuto grasso corporeo e altri detriti fuori del caso testa di separare in modo chiaro e identificare i dischi del cervello e degli occhi.
NOTA: Mantenere il cervello attaccato alla testa caso pupa permetterà ai ricercatori di utilizzare il luicaso ad una "maniglia" per la futura manipolazione del tessuto senza danneggiare i dischi occhi o cervello. Tuttavia, è comune per rimuovere i dischi cervello e degli occhi da quelle della testa e questo non è dannoso per la procedura generale ei risultati. Spesso ci vogliono diversi tentativi di soffiaggio e spingendo per estrarre correttamente i dischi occhi e cervello dall'interno del bozzolo testa e in modo che siano nettamente separate dal tessuto circostante. Il più pulito e più un separato possono ottenere i dischi occhi dal tessuto circostante contribuisce a prevenire i tessuti estranei di fissare ai dischi degli occhi. - Dopo la dissezione, trasferire immediatamente il tessuto di un piatto di vetro 3 bene su ghiaccio con 0,5 ml di soluzione Fix (vedi materiali). Float il tessuto sulla superficie della soluzione Fix per alcuni minuti (in genere il tempo necessario per sezionare il successivo insieme di dischi oculari).
NOTA: Se questo non è il primo disco occhio ad essere sezionato in questo giro di dissezione, completely immergere il disco precedente occhio nella soluzione Fix. Se l'esecuzione di procedure di colorazione speciali (ad esempio, le specie reattive dell'ossigeno, lisosomi, ecc), questo deve essere fatto prima della fissazione. Per fare questo, conservare i dischi occhio sezionato in PBS freddo prima di continuare con il protocollo di colorazione appropriata. - A seguito di dissezione e la sommersione di tutti i dischi degli occhi viene sezionato, spostare il piatto di vetro 3 oltre a un rocker e rock a temperatura ambiente per 30 minuti.
2. Immunostaining
- Rimuovere con cautela la soluzione Fix e aggiungere 0,5 ml di PBS con 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, vedi materiali) e lavare il tessuto su una sedia a dondolo per 10 minuti. Ripetere questa operazione per altre tre volte per un totale di 4 lavaggi (10 min ciascuna).
NOTA: la rimozione accurata della soluzione dal pozzo può essere eseguita sotto un microscopio da dissezione per evitare danni ai tessuti o di perdita. La soluzione può essere aspirato accuratamente con una pipetta; preferiamo un fine-Tipped, pipetta di trasferimento monouso che ha avuto l'apertura appiattita per ridurre la possibilità di aspirare il tessuto. - Alla fine del quarto lavaggio, rimuovere la pulizia e aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco (vedi materiali) al pozzetto ed incubare per 30 min.
NOTA: Questo lasso di tempo può essere esteso in base alle vostre esigenze. - Alla fine del tempo di blocco 30 min, pipettare 10 ml di soluzione di anticorpo primario (diluito in soluzione Block) nel numero appropriato di pozzetti in una micropiastra.
NOTA: Un pozzetto di una micropiastra ospiterà circa 4 coppie di dischi occhi collegati al caso pupa o 8 coppie isolate di dischi occhio con il cervello attaccato. Gli anticorpi primari utilizzati nel presente protocollo per i dati rappresentativi sono anti-fosfotirosina (diluizione 1: 500) e anti-Cut (diluizione 1: 200). - Trasferire il tessuto sezionato nei pozzetti per micropiastre riempiti con la soluzione di anticorpo primario dal piatto di vetro 3 bene.
- Luogola micropiastra su un tovagliolo di carta bagnato (per evitare la disidratazione) in una scatola vuota pipetta punta (o altro contenitore simile) e conservare a 4 ° C per una notte.
2 ° giorno (4 ore + tempo di montaggio)
- Trasferire il tessuto dalla micropiastra in un piatto di vetro 3 bene con 0,3% PBT (≈0.5 ml) e lavare il tessuto per 10 min a bilanciere. Ripetere questa operazione per altre tre volte per un totale di 4 lavaggi (10 min ciascuna)
- Rimuovere l'ultimo lavaggio e aggiungere 0,5 ml di soluzione di blocco al pozzo. Blocco per 30 min.
NOTA: Questo lasso di tempo può essere esteso in base alle vostre esigenze. - Rimuovere la soluzione di blocco e aggiungere 0,5 ml di Soluzione Anticorpi secondaria (a base di anticorpi fluorescente appropriate per il vostro anticorpo primario e lunghezza d'onda fluorescente, diluito in soluzione Block) per il bene e proteggere il piatto di vetro 3 e dalla luce con un coperchio o di alluminio sventare e incubare per almeno 2 ore a cameratemperatura.
NOTA: Tutti i passi successivi devono essere protetti in modo analogo da esposizione alla luce. Questo incubazione può essere estesa a tutta la notte a 4 ° C, in una configurazione simile a quella di incubazione dell'anticorpo primario, ma può essere eseguita anche in un piatto di vetro 3 ben coperta con la pellicola di laboratorio, o una micropiastra qualora la conservazione degli anticorpi è desiderato. - Al termine dell'incubazione anticorpi, rimuovere la Soluzione Anticorpi secondari e aggiungere 0,5 ml di 0,3% PBT al pozzo e lavare il bilanciere per 10 min. Ripetere questo passaggio per un totale di 4 lavaggi (10 minuti ciascuno).
NOTA: Se colorazione DAPI si desidera, prima di iniziare il primo lavaggio, aggiungere 0,5 ml di DAPI soluzione madre (vedi materiali) ai 500 ml di PBT che saranno utilizzati per il primo lavaggio (1: 1.000 diluizione).
3. Montaggio
- Alla fine l'ultimo lavaggio, montare i dischi delle antenne / occhio su un vetrino utilizzando 70% glicerolo o PBS come mezzo per rimuovere il brain e altri tessuti indesiderati in una piscina su un lato della slitta.
- Spostare con attenzione il tessuto con pressione idrostatica tra le pinze, o molto delicatamente con una punta pinza, e allineare i dischi degli occhi in una colonna verso il centro della diapositiva.
- Rimuovere tutti glicerolo estraneo o PBS provenienti da tutto il tessuto (con wicking azione di un laboratorio wipe o la pinza lavorare per questo).
- Mettere una piccola quantità (≈10 ml) di mezzo di montaggio lungo un lato della colonna disco occhi e posizionare un coprioggetto sul tessuto in modo da distribuire la soluzione di montaggio sui dischi oculari.
- Lasciate scivolo sedersi per 1 o 2 minuti per consentire il / mezzo di montaggio tessuto a diffondersi completamente.
- Pulire qualsiasi mezzo di montaggio in più fuori intorno ai bordi del coprioggetto e sigillare con smalto trasparente.
- Cattura immagini fluorescenti dei dischi oculari utilizzando la microscopia confocale.
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Representative Results
Come esempio dell'uso di questo protocollo, risultati illustrano midpupal (42 ore APF a 25 ° C) dischi occhio immunostained con anticorpi differenti sono rappresentati nella figura 2. Utilizzando un anticorpo diretto contro residui fosfotirosina, la membrana delle cellule può essere osservati (Figura 2A). Questo può essere utilizzato per identificare la disposizione regolare di celle ommatidial nell'occhio pupa seguenti processi patterning finali che si verificano prima della fase midpupal. Un'altra immagine rappresentativa raffigura i nuclei di coni possono sono identificati utilizzando un anticorpo contro il fattore di trascrizione di taglio (Figura 2B).
Figura 1:. Schema di montaggio del tubo soffiatore utilizzato nella procedura di dissezione, vedere la sezione materiali per i dettagli su the componenti separate del tubo di lancio.
Figura 2:. Immunostaining di dischi occhio midpupal immunostaining rappresentante dimostrare l'uso di questo protocollo per visualizzare A) la morfologia apicale di ommatidi (fosfotirosina) e B) nuclei delle cellule cono (Cut) da dischi occhi pupa a 42 ore APF. Barre di scala = 50 micron.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
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