Introduction
Områdena utvecklings och cellbiologi har kraftigt påverkats av modellorganism: Drosophila melanogaster. Inom denna modell har studier i ögat skivan bidrog en hel del kunskap om signalering, cellbiologi och andra områden. Den sena tredje larv stadiet öga skiva har studerats ingående och är en kraftfull modell att använda, eftersom det ger en ögonblicksbild av en rad utvecklingsperioder, eftersom morfogenetiska fåran fortskrider över ögat skivan var och en med sina egna unika signalmolekyler och processer, 8. Det finns dock ett behov av att ytterligare utöka vår förståelse av utvecklingsprocesser i PUPP utvecklingsfas. Även om det har gjorts studier på PUPP ögat skivan 3-7, gör vår kunskap inte fram bredden av arbete som har utförts på tredje stadiet ögat skiva. Detta beror delvis på den ökade svårigheten att dissekera PUPP ögat skivan. Därför kan en presentation avkorrekt metod för dissektion skulle kraftigt utöka forskningen inom detta område.
Även om det finns stadier inom PUPP ögonskiv utveckling som lätt dissekeras, särskilt runt mitt PUPP perioden, andra tidsperioder är mycket mer utmanande att dissekera. Detta protokoll utgör en metod för att dissekera PUPP ögon skivor som kan allmänt användas för alla PUPP utvecklingstidsramar. Detta protokoll kan användas som ett alternativ till ett annat protokoll 9 som visar en enklare och snabbare metod för att dissekera ögonskivor från midpupal tidpunkterna. Detta protokoll ursprungligen filmades och utvecklades för att träna avancerade studenter i UCLA Grundutbildning Research Consortium i funktionell genomik (URCFG) 10,11 i tekniken med PUPP ögat dissektion. Många studenter har kunnat utnyttja den här videon och metod för att lära sig denna utmanande teknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta förfarande är en 2 dagars förfarande.
Dag 1 (2 hr + dissekera tid)
1. PUPP Eye Disc Dissection
- Välj en puppa för dissekering.
OBSERVERA: Åldern på puppan som skall dissekeras kommer att bestämmas av de experimentella behov. Om prövningen cellmorfologi, detta sker ofta vid 42 timmar efter puparium bildning (APF) vid 25 ° C, vilket är en ålder av puppor som visas i videon. Samla vita puppor (ansåg 0 tim APF) med en fuktad pensel och ordna dem i kronologisk ordning (baserat på insamling tid) i en ny fluga livsmedelsflaska hålls vid 25 ° C. Dissekera åldrade puppor i samma kronologiska ordning att hålla tidsskillnader mellan puppor så nära som möjligt. - Överför puppan i en droppe fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4, se material för recept) på ett silikon dissekera platta.
- Hålla den övre delen av PUPP fallet med pincett och pierce och öppna lorn parti av PUPP fallet med ett par vassa pincett. Avlägsna puppan från fallet i det nybildade hålet.
- Gör ett diagonalt snitt med sax, mid-thorax, i puppan. Ta bort skräp eller överföra puppan huvudet till en ny droppe PBS. Rengör med pipetten blåsröret (se material och Figur 1 för detaljer) och lägga till ytterligare PBS som behövs. Se till att undvika uttorkning.
- Säkert grepp toppen av PUPP huvudet nagelbanden med en pincett. Med hjälp av spetsen på blåsröret, tryck försiktigt på PUPP fallet att pressa hjärnan och andra vävnader, inklusive ögat skivor ur PUPP fallet. Var noga med att undvika att ta tag någon vävnad i nagelbanden.
- Använda blåsröret fylls med PBS, blås försiktigt fettkroppsvävnad och annat skräp ut ur huvudet fallet att klart avskilja och identifiera hjärnan och ögat skivor.
OBS: Att hålla hjärnan kopplade till PUPP huvudet fallet gör det möjligt för forskare att använda hanad case som en "handtag" för framtida hantering av vävnaden utan att skada ögat skivor eller hjärna. Emellertid är det vanligt att driva bort hjärnan och ögonskivor från huvudet fallet och det är inte till förfång för den totala proceduren och resultat. Det tar ofta flera försök att blåsa och driver framgångsrikt extrahera ögon skivor och hjärna inifrån PUPP huvudet fallet och så att de är tydligt åtskilda från omgivande vävnad. Den renare och mer separat man kan få ögon skivor från den omgivande vävnaden kommer att bidra till att förhindra främmande vävnad från fastställande till ögon skivor. - Efter dissektion, omgående överlåta vävnaden till en 3 väl glasskål på is med 0,5 ml Fix lösning (se material). Float vävnaden på ytan av Fix lösning under några minuter (typiskt den tid det tar för att dissekera nästa uppsättning av ögonskivor).
OBS: Om det inte är det första ögat skivan som ska dissekeras i denna omgång av dissektion, Completely dränka den tidigare ögonskivan i Fix-lösning. Om med speciella färgningsprocedurer (t.ex. reaktiva syreradikaler, lysosomer, etc.) måste detta göras före fixering. För att kunna göra detta, lagra dissekerade ögon skivor i iskall PBS innan du fortsätter med det lämpliga färgningsprotokollet. - Efter dissektion och nedsänkning av alla ögon skivor som dissekeras, flytta 3 väl glasskål till en rocker och rock vid rumstemperatur i 30 minuter.
2. Immunfärgning
- Ta försiktigt bort Fix lösning och tillsätt 0,5 ml PBS med 0,3% Triton X-100 (0,3% PBT, se material) och tvätta vävnaden på en rocker i 10 min. Upprepa detta steg tre gånger för totalt 4 tvättar (10 min var).
OBS: Noggrann borttagning av lösningen från brunnen kan utföras under en dissekera mikroskop för att förhindra vävnadsskada eller förlust. Lösningen kan aspireras försiktigt med en pipett; vi föredrar en finare Tipped, engångstransferpipett pipett som har haft öppningen tillplattad för att minska risken för aspirerande vävnad. - Vid slutet av den 4: e tvätten, ta bort tvätten och lägga 0,5 ml blocket lösning (se material) till brunn och inkubera under 30 min.
OBS: Denna tidsram kan förlängas efter behov. - Vid slutet av den 30 minuter blocket tid, pipett 10 ul av primär antikroppslösning (spädd i Block-lösning) i lämpligt antal brunnar i en mikrobrunnsplatta.
OBS: En brunn i en mikroplatta kommer att rymma cirka 4 par ögonskivor fästa vid PUPP fallet eller 8 isolerade par av ögon skivor med hjärnor bifogas. De primära antikroppar som används i detta protokoll för de representativa uppgifterna är anti-fosfotyrosin (1: 500 utspädning) och anti-Cut (1: 200 utspädning). - Överför dissekerade vävnaden i mikroplattbrunnar fyllda med den primära antikroppen lösning från 3 och glasskål.
- Platsden mikrobrunnsplatta på ett fuktat pappershandduk (för att förhindra dehydrering) i en tom pipettspetsen låda (eller annan liknande behållare) och lagra vid 4 ° C över natten.
Dag 2 (4 hr + monterings tid)
- Överför vävnad från mikrobrunnsplattan till ett nytt 3 väl glasskål med 0,3% PBT (≈0.5 ml) och tvätta vävnaden under 10 minuter på rocker. Upprepa detta steg tre gånger för totalt 4 tvättar (10 min vardera)
- Ta bort den sista tvättningen och tillsätt 0,5 ml av Block lösning till brunnen. Blockera under 30 minuter.
OBS: Denna tidsram kan förlängas efter behov. - Ta bort Block lösning och tillsätt 0,5 ml av den sekundära antikroppslösning (tillverkad av fluorescerande antikroppar som är lämpliga för din primära antikropp och fluorescerande våglängd, utspätt i Block-lösning) till brunnen och skydda 3 borrningen glasskål från ljus med ett lock eller aluminium folier och inkubera under åtminstone 2 h vid rums-temperatur.
OBS: Alla efterföljande åtgärder bör på liknande sätt skyddas från ljus exponering. Denna inkubation kan förlängas till över natten vid 4 ° C, i en installation som liknar den primära antikroppen inkubation, men den kan också utföras i en tre väl glasskål täckt med laboratoriefilm, eller en mikrobrunnsplatta om bevarande antikropp önskas. - Vid slutet av antikropps inkubation, ta bort den sekundära antikroppslösning och tillsätt 0,5 ml 0,3% PBT till brunnen och tvätta på rocker i 10 min. Upprepa detta steg för totalt 4 tvättar (10 min vardera).
OBS! Om DAPI färgning önskas, innan den första tvätten, tillsätt 0,5 pl DAPI stamlösning (se material) till 500 pl PBT som kommer att användas för den första tvätten (1: 1000 utspädning).
3. Montering
- I slutet av den sista tvätten, montera antenn / ögon skivor på en bild med hjälp av 70% glycerol eller PBS som ett medium för att ta bort brain och andra oönskade vävnader i en pool på ena sidan av bilden.
- Flytta försiktigt vävnaden med hjälp av hydrostatiska trycket mellan pincett, eller mycket försiktigt med en pincett spets, och rada upp ögonskivorna i en kolumn mot centrum av bilden.
- Ta bort alla främmande glycerol eller PBS från hela vävnaden (med fuktspridande verkan av ett laboratorium torka eller tången arbeta för detta).
- Placera en liten mängd (≈10 il) av monteringsmedium längs en sida av ögat skiva kolonnen och placera ett täckglas på vävnaden för att sprida monteringsmedium på ögonskivor.
- Låt glid sit under 1 till 2 minuter för att tillåta vävnaden / monteringsmedium för att sprida ut helt.
- Torka någon extra monteringsmedium av från runt kanterna på täckglas och försegla den med genomskinligt nagellack.
- Fånga fluorescerande bilder av ögon skivor med konfokalmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som ett exempel på användningen av detta protokoll, resultaten visar midpupal (42 tim APF vid 25 ° C) ögon skivor immunostained med olika antikroppar visas i figur 2. Genom att använda en antikropp riktad mot fosfotyrosinrester kan membranet av cellerna vara observerade (Figur 2A). Detta kan användas för att identifiera den regelbundet arrangemang av ommatidial celler i PUPP ögat efter den slutliga mönstrings processer som sker före den midpupal skede. En annan representativ avbildar visar kärnorna av kon celler kan identifieras genom användning av en antikropp mot Cut transkriptionsfaktor (figur 2B).
Figur 1:. Assembly schema för blåsröret används i dissekering förfarandet Se avsnittet material för detaljer på the separata komponenter av blåsröret.
Figur 2:. Immunfärgning av midpupal ögonskivor representant immunfärgning som visar användningen av detta protokoll för att visualisera A) den apikala morfologi ommatidia (fosfotyrosin) och B) kon cellkärnor (Cut) från PUPP ögon skivor i 42 timmar APF. Skalstrecken = 50 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4, Bring volume to 1 μl, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH2O before using. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Caution: Irritant! Wear gloves. |
| 0.3% PBT | 1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. |
| Fix Solution | (≈4% Formaldehyde in PBS) 50 μl of 37% Formaldehyde, 450 μl 1x PBS, make fresh before use | ||
| Normal goat serum | Rockland antibodies & assays | B304 | Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 °C |
| Block Solution | 10% NGS in PBT. This can be made and stored at 4 °C for a few days prior to use. | ||
| DAPI stock solution | Life Technologies | D3571 | For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH2O. |
| VectaShield Mounting Medium | Vector Labs | H-1000 | Mounting medium |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For mounting. Prepare 70% dilution with ddH2O. |
| Equipment | |||
| Nutating mixer | VWR | 82007-202 | Used to rock tissue in 3 well glass dish |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Krayden | NC9897184 | Used to make silicone dissection dish |
| Silicone dissecting dish | Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 °C incubator. | ||
| 3 well glass dish | Corning | 7220-85 | The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product. |
| 72 well microwell minitray | Nunc | 438733 | |
| Sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow. |
| Disposable Transfer Pipets, Fine Tip | Samco Scientific | 231 | |
| Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches | |||
| PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2. |
| Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performance Plastics | ABW00001 |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347 (2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936 (2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
