Abstract
Langdurige veranderingen in de hersenen of 'plasticiteit van het brein' ten grondslag liggen aan adaptief gedrag en de hersenen herstel na ziekte of letsel. Bovendien kan de interactie met onze omgeving plasticiteit van het brein te induceren. In toenemende mate wordt het onderzoek probeert te identificeren welke omgevingen plasticiteit van het brein gunstig voor de behandeling van de hersenen en gedragsstoornissen te stimuleren. Twee milieu manipulaties beschreven die verhogen of tyrosine hydroxylase immunopositive (TH +, de snelheidsbeperkende enzym in dopamine (DA) synthese) in de volwassen muis middenhersenen verlagen neuronen. De eerste bestaat koppeling mannelijke en vrouwelijke muizen continu samen gedurende 1 week, waarbij middenhersenen TH + neuronen in mannetjes verhoogt met ongeveer 12%, maar vermindert middenhersenen TH + neuronen met ongeveer 12% bij vrouwen. De tweede groep omvat een behuizing muizen continu voor 2 weken in 'verrijkte omgeving' (EE) met loopwielen, speelgoed, touwen, nestmateriaal, enz., Die ikncreases middenhersenen TH + neuronen met ongeveer 14% bij mannen. Daarnaast wordt een protocol beschreven voor gelijktijdige infusie van medicijnen direct in de middenhersenen tijdens deze milieu manipulaties om onderliggende mechanismen milieuredenen hersenplasticiteit identificeren. Bijvoorbeeld wordt EE-inductie van meer middenhersenen TH + neuronen afgeschaft gelijktijdige blokkade van synaptische ingang op neuronen van de middenhersenen. Samen vormen deze gegevens blijkt dat informatie over het milieu wordt doorgegeven via synaptische input voor middenhersenen neuronen om in of uit uitdrukking van 'DA' genen schakelen. Zo passende milieueisen stimulatie, of drug targeting van de onderliggende mechanismen, nuttig voor de behandeling van de hersenen en gedragsstoornissen in verband met onevenwichtigheden in de middenhersenen DA zou kunnen zijn (bijvoorbeeld de ziekte van Parkinson, Attention Deficit Hyperactivity Disorder, schizofrenie, en drugsverslaving).
Introduction
DArgic signalering door neuronen in het ventrale tegmentale gebied (VTA) en substantia nigra pars compacta (SNC) van de middenhersenen wordt gedacht belangrijk voor een beloning gemotiveerd cognitieve, emotionele en motorische gedrag te zijn. Echter, te veel of te weinig middenhersenen DA signalering veroorzaakt veel invaliderende symptomen in een verscheidenheid van neurologische aandoeningen (zoals de ziekte van Parkinson, Attention Deficit Hyperactivity Disorder, schizofrenie, en drugsverslaving). Geneesmiddelen die verhogen of verlagen DA signalering verlichten deze symptomen, maar ze produceren ook bijwerkingen toe te schrijven aan ontregelde signalering en off-target effecten. Drug werkzaamheid neemt af in de tijd door de compenserende responsen van de hersenen. De uitdaging is dan ook om de normale middenhersenen DA signalering te herstellen in een meer gerichte en fysiologische manier, en een favoriete aanpak is door het verhogen of verlagen van het aantal middenhersenen DA neuronen.
Bewijs is accumuleren voor sevrale decennia dat de expressie van genen en eiwitten die betrokken zijn bij het metaboliseren van en handel DA en andere catecholaminen in de volwassen volwassen cellen is aanpasbaar (beoordeeld in 1). In de middenhersenen, vermindert het aantal tyrosine hydroxylase immunopositieve (TH +, de snelheidsbeperkende enzym in DA synthese) neuronen dan verhoogt volgende neurotoxine administratie 2,3, terwijl het aantal TH immunonegative (TH-) neuronen toont het tegenovergestelde patroon (dwz toeneemt Vervolgens daalt 3). Dit is consistent met het verlies dan winnen van de "DA fenotype 'van sommige cellen. Het aantal TH + en TH- SNc neuronen is ook aangetoond veranderen in gelijke maar tegengestelde richtingen na verschillende behandelingen die de elektrische activiteit van deze cellen 4,5 veranderen. Bijvoorbeeld, infusie van de kleine geleiding, door calcium geactiveerde kalium (SK) kanaal antagonist apamin in middenhersenen gedurende 2 weken vermindert het aantal TH + en verhogingen (met hetzelfde bedrag) number van TH- SNc neuronen 4,5. Daarentegen infusie van de SK kanaal agonist 1-Ebio verhoogt het aantal TH + en vermindert (met dezelfde hoeveelheid) het aantal TH- SNc neuronen 4,5. Vergelijkbare veranderingen werden waargenomen na verschillende behandelingen voor SNc neuronale activiteit, waarvan sommige afferente input 4 gericht. Deze schijnbare regeling van het aantal SNc DArgic neuronen van neuronale activiteit en afferente invoer oppert de mogelijkheid dat het milieu of het gedrag aantal SNc neuronen beïnvloeden. Indeed volwassen muizen blootgesteld aan verschillende omgevingen of meer middenhersenen (SNc en VTA) TH + neuronen, en ten minste enkele van deze milieu-geïnduceerde veranderingen opgeheven door gelijktijdige blokkade van synaptische input middenhersenen 6. De doelstellingen van deze mededeling zijn: (1) geven meer details over hoe we onze milieu-manipulaties en infusies met geneesmiddelen uit te voeren; en (2) nadere gegevens ter ondersteuning van onze stelling dat de environment regelt het aantal middenhersenen DA neuronen, via afferente ingang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle experimentele procedures op dieren werden goedgekeurd door de Florey Instituut voor Neurowetenschappen en geestelijke gezondheid Animal Ethics Committee en voldoen aan de Australische National Health en Medical Research Council gepubliceerd gedragscode voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (7 e editie, 2004).
1. Milieu Manipulaties
- Geslacht Koppelen
- Gebruik geslachtsrijp (> 8 weken oud), leeftijd gematchte mannelijke en vrouwelijke muizen.
LET OP: Wij gebruiken meestal de C57BL / 6 muizen, maar hebben dezelfde resultaten met behulp van Zwitserse muizen in dit protocol had. We gebruiken meestal n = 8 mannen en n = 8 vrouwtjes voor elk experiment verdeeld in n = 2 male-male paren (n = 4 mannetjes), n = 2 vrouwelijke uiteinden paren (n = 4 vrouwtjes), en n = 4 man-vrouw paren (n = 4 reuen en n = 4 vrouwtjes). - Bij aankomst in het dier bedrijf faciliteit, de groep-house de muizen naar geslacht voor> 3 dagen om te acclimatiseren. Hier en throughout het geslacht pairing, houd externe prikkels uit de omgeving (bijvoorbeeld de omgevingstemperatuur, licht: donker cyclus, voedsel, water, behandeling en reiniging) constante of verdeel eveneens om alle muizen.
- Willekeurig elke muis toewijzen aan een man-man paar, een vrouw-vrouw paar, of een man-vrouw paar. Plaats elk paar in een schone kooi afzonderlijk (2 muizen / kooi) met ad libitum toegang tot voedsel en water, en eenvoudig te huisvesten op deze wijze continu gedurende 7 dagen.
OPMERKING: Routine veeteelt is OK in deze periode, maar moet eerlijk worden verdeeld over alle muizen. Zorg ervoor dat het koppelen van de mannelijke en vrouwelijke nestgenoten te voorkomen.
- Gebruik geslachtsrijp (> 8 weken oud), leeftijd gematchte mannelijke en vrouwelijke muizen.
- Milieu-Verrijking
- Gebruik geslachtsrijp (> 8 weken oud), leeftijd gematchte mannelijke of vrouwelijke muizen.
OPMERKING: We gebruiken meestal n = 18 muizen per experiment, verdeeld in n = 6 / behandelingsgroep. - Bij aankomst in het dier bedrijf faciliteit houd ze-groep gehuisvest in identieke standaard ondergebracht (SH) (bv (bijvoorbeeld omgevingstemperatuur, licht: donker cyclus, voedsel, water, behandeling en reiniging) constant en gelijkmatig verspreiden naar alle muizen.
- Om het milieu verrijking beginnen, willekeurig elke muis naar een van de 3 groepen toe te wijzen: SH; loopwiel (RW) of verrijkt milieu (EE) en plaats elke groep muizen samen in dezelfde schone kooi met ad libitum toegang tot voedsel en water.
LET OP: Hier grotere rat houdt kooien voor alle groepen, het meten van 27 cm breed, 42 cm lang en 16 cm diep werden gebruikt.- Daarnaast bieden de volgende omgevingsomstandigheden aan elke groep: SH met alleen nest (papier pellets of zaagsel) op de vloer; RW bestaande uit SH plus 2 loopwielen; EE bestaande RW plus speelgoed (touwen, ladders, tunnels, en objecten zoals lege papieren handdoek rollen en stukjes weefsel papier) waarmee explore, spelen, klimmen, verstoppen, en nest.
- Onderbrengen in deze wijze continu gedurende 14 dagen.
OPMERKING: Routine veeteelt is OK in deze periode, maar moet eerlijk worden verdeeld over alle muizen.
- Onderwerp EE muizen om extra 'super-verrijking' (SE) door ze samen te brengen in een grotere kooi met daarin roman speelgoed voor 1 uur / dag (zelfde uur per dag), 5 dagen / week.
LET OP: Hier werd een 46 cm breed, 69 cm lang en 40 cm diep kunststof kuip gebruikt.- Handhaaf nieuwigheid door de presentatie van een andere set van speelgoed elke sessie. Schoon speelgoed die opnieuw worden voorgelegd aan muizen met zeepwater en 80% ethanol om geuren te verwijderen.
- Na elke SE-sessie, de terugkeer van de muizen om hun EE kooi. Handvat SH en RW muizen hetzelfde als SE muizen (met uitzondering van de SE zelf) gedurende deze periode (bijvoorbeeld verwijderen en terug te keren elk SH en RW muis van en naar zijn kooi).
- Gebruik geslachtsrijp (> 8 weken oud), leeftijd gematchte mannelijke of vrouwelijke muizen.
- Voorbereiding
- Gebruik steriele osmotische pompen en herseninfusiekit kits, die commercieel verkrijgbaar zijn. De dag voor de implantatie, met behulp van aseptische techniek, prime de implantaten door het invullen van elke pomp, verbindingsbuis en canule met steriele geneesmiddel of vehikel oplossing (zoals beschreven in de gebruiksaanwijzing van de pompen meegeleverd). Sluit ze elkaar en incubeer in steriele zoutoplossing overnacht bij 37 ° C. Incubeer drugs-en-voertuig gevulde implantaten los om kruisbesmetting te voorkomen.
- Chirurgie.
OPMERKING: Afhankelijk van het land van de experimentator worden speciale dierproeven vergunningen of quota die nodig is om dergelijke vormen van chirurgie en postoperatieve experimenten na te streven.- Steriliseren alle chirurgische apparatuur en maken gebruik van aseptische technieken. Verdoven van een muis (bijvoorbeeld met behulp van 1-2% isofluorane in de lucht) en plaats deze in een m³otaxic headframe. Controleer de diepte van de anesthesie tijdens de gehele procedure en beheren verdere verdoving als nodig is (bijvoorbeeld ontbreken van ledematen terugtrekking aan schadelijke poot snufje is een indicatie van een adequate anesthesie). Zorg ervoor dat de ogen worden beschermd tegen uitdroging door smeermiddel oogzalf, en dat de lichaamstemperatuur van de muis normaal tijdens de gehele procedure blijft.
- Voeg een middellijn incisie door de huid vanaf tussen de ogen en afwerking 2 cm posterieur aan de achterkant van de schedel. Blunt ontleden de huid weg van de onderliggende fascia over de rug van de muis een subcutane 'pocket' groot genoeg om gemakkelijk de pomp en de verbindingsbuis wanneer de canule wordt ingebracht (de verbindingsbuis niet worden gebogen na voltooiing) creëren. Schraap duidelijk de fascia uit over het dorsale aspect van de schedel.
- Met behulp van een ongeveer 1,5 mm diameter tandheelkundige braam, drill down in de schedel op het juiste stereotaxisch coördineert until een dunne, flexibele laag van het bot blijft. Schil deze laag weg met behulp van fijne pincet (dit voorkomt beschadiging van de onderliggende dura mater en de hersenen met de tandheelkundige braam). Controleer de schedel wordt gereinigd van bloed en botfragmenten, en dat er geen verdere bloeding.
- Met de canule in het bezit van een canule houder, plaats de pomp en de verbindingsbuis in het onderhuidse 'pocket' bovenliggende terug van de muis. Vervolgens plaatst de punt van de canule in de juiste stereotaxische coördinaten en op het oppervlak van de hersenen. Verlagen zorgvuldig de canule in de hersenen, maar stoppen met ongeveer 1 mm kort van de vereiste diepte.
OPMERKING: De resterende diepte zal worden onderhandeld na het aanbrengen van de eerste laag van tandheelkundige acryl. - Zorgen voor weer het oppervlak van de schedel is schoon en droog, vervolgens een klein volume van tandheelkundige acryl en gebruik een tandenstoker om het te glad over de gehele blootgestelde oppervlak van de schedel, met inbegrip van in de braam-gat door de schedel rond the canule. Voordat de acryl verhardt, hoe lager de canule tip de resterende diepte in het doel.
- Maak een klein volume van tandheelkundige acrylaat en laag dit over de eerste als over de witte plastic ondersteuning van de canule, de canule op zijn plaats vast. Herhaal met extra lagen van acryl nodig.
- Nadat de acryl is uitgehard, verwijder voorzichtig de canulehouder en snijd de witte plastic verwijderbare canule tabblad met behulp van een scalpel verwarmd met een butaan vlam. Tenslotte hechten de huid gesloten over de gehele implantaat.
- Postoperatieve Behandeling van Dieren
- Breng antiseptische zalf op de huid marges en beheren een ontstekingsremmend de muis (zoals meloxicam, 3 mg / kg sc). Verwijder de muis uit het frame, plaats het onder een warmtelamp, en observeren tot hij weer bij bewustzijn. Gebruik een muis die een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
OPMERKING: Experimental manipulaties zoals geslacht koppelen en milieu verrijking kan worden gestart of de dag na de operatie op zijn vroegst hervat. - Toezicht op hun lichaamsgewicht, algemene gedrag en uiterlijk per dag. Behandel tekenen van infectie (bijvoorbeeld zwelling, roodheid, pus) rond chirurgische incisies met actuele antiseptische zalf. Behandel eventuele tekenen ziekte, pijn, stress of ongemak (bijvoorbeeld verlies van> 10% lichaamsgewicht, sociale terugtrekking, gebrek aan verzorging, "opschudden", beweging disfunctie, epileptische aanvallen) met systemische analgetica en / of antibiotica als dat nodig is.
- Euthanaseren muizen indien> 15% gewichtsverlies of symptomen van ziekte, pijn, stress of ongemak niet worden verholpen binnen 1 week van corrigerende behandeling.
- Breng antiseptische zalf op de huid marges en beheren een ontstekingsremmend de muis (zoals meloxicam, 3 mg / kg sc). Verwijder de muis uit het frame, plaats het onder een warmtelamp, en observeren tot hij weer bij bewustzijn. Gebruik een muis die een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
3. Brain Tissue Voorbereiding, Immunohistochemisch Verwerking en Stereology
- Perfusie
- Onmiddellijk na het milieu / drugs manipulaties, de voorbereiding van de hersenen voor studie.
- Toedienen eerst een overdosis van verdoving de muizen te doden (bijvoorbeeld 100 mg / kg ip natriumpentobarbiton). Eenmaal verdoofd maar voordat het hart stopt met kloppen, leg de muis op zijn rug en bind of vastpinnen beide voorpoten.
- Met behulp van een scalpel weggesneden huid die over de thorax dan incisie door de spier net onder de ribbenkast in de buikholte. Plaats een klem op de processus xiphoideus van de ribbenkast en til de ribbenkast omhoog en van de lever blootstellen van het membraan.
- Knip het membraan en door de ribben zijdelings aan beide zijden met grote schaar totdat de ribbenkast terug over de kop naar de longen en het hart bloot te klappen. Met behulp van fijne schaar een kleine incisie in het rechter atrium als een uitgang voor bloed en geperfuseerd oplossingen knip door de bodem van de linker ventricle en plaats een canule omhoog door de linker ventrikel, het linker atrium, en in de aorta.
- Klem de canule op zijn plaats dan pomp warm (37 ° C) heparine en 0,1 M fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) door het vaatstelsel totdat de oplossing het rechter atrium verlaten geheel vrij bloed. Vervolgens pomp koud (4 ° C) fixatief (bijvoorbeeld 4% paraformaldehyde in PBS) door het vaatstelsel, totdat de muis goed vastgesteld. Verwijder de hersenen en plaats in PBS met 30% sucrose voor 2-3 dagen tot de hersenen wastafels.
OPMERKING: Andere soorten weefsels preparaat kan worden toegepast, afhankelijk van de deskundigheid in de desbetreffende laboratorium.
- Onmiddellijk na het milieu / drugs manipulaties, de voorbereiding van de hersenen voor studie.
- Voorbereiding van Vrij zwevende Weefsel secties
- Snijd seriecoupes door de gebieden van de hersenen van belang en het verzamelen van deze in PBS.
LET OP: Wij snijden 40 micrometer dikke secties met behulp van een cryostaat. Andere soorten weefsel snijden kan worden toegepast, afhankelijk van de expertise in de corresponding laboratorium.
- Snijd seriecoupes door de gebieden van de hersenen van belang en het verzamelen van deze in PBS.
- Immunohistochemie
- Voeren standaard immunohistochemie voor eiwitten van belang. Incubeer secties 5% normaal geitenserum en 0,3% Triton X-100 in PBS bij kamertemperatuur gedurende 30 min, vervolgens immuunreactie met polyklonale konijn anti-TH (1: 400) bij 4 ° C gedurende 48 uur, vervolgens gebiotinyleerd polyklonaal geit anti -rabbit (1: 1000) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Vervolgens incuberen in avidine-peroxidase (1: 500) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, daarna op kobalt en nikkel geïntensiveerd diamino-benzidine (0,5 mg / ml) bij kamertemperatuur gedurende 18-20 min; de laatste 3-5 minuten van het diamino-benzidine incubatie toe waterstofperoxide (0,01%) tot chromageen precipitatie katalyseren. Was secties driemaal 10 min elk in PBS voor, na en tussen elk van de bovenstaande stappen.
- Monteer de hoofdstukken over ontsloten microscoop dia's, de lucht te drogen, dan Nissl vlek (neutraal rood), uitdrogen in alcohol, duidelijke (X-3B), en dekglaasje.
- Schatting van het totale aantal TH + en TH- SNc (en VTA en LC) neuronen met behulp van onpartijdige stereological methoden. Zorg ervoor dat de stereologist blind is voor de ontvangen behandeling. Uitsluiten glia op basis van soma diameter <5 urn en tellen alleen die cellen met een zichtbare kern.
- Identificeer de SNc (en VTA en LC) door de ruimtelijke locaties van TH + cellen en anatomische oriëntatiepunten / grenzen volgens de hersenen atlas van Paxinos en Watson 7. Telling TH + cellen in een counting frame (55 x 55 urn = 3025 um 2) goed vooraf bepaalde intervallen (x = 140 urn, y = 140 urn voor SNc; x = 100 um, y = 100 urn voor VTA en LC) gedurende elke kern in elke vierde sectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volwassen muizen blootgesteld aan deze milieu manipulaties aantallen middenhersenen (SNc en VTA), maar niet LC veranderd, TH + neuronen en EE plus gelijktijdige middenhersenen infusie van hetzij picrotoxine of bicuculline (GABAA-receptorantagonisten) afschaft EE-inductie van meer SNc TH + neuronen. Deze gegevens werden eerder gepubliceerd 6. De huidige gegevens zijn verzameld in repliceren experimenten uitgevoerd als onderdeel van die vorige studie, maar zijn niet elders gepubliceerd.
Specifiek, volwassen mannelijke muizen die zijn gekoppeld aan volwassen vrouwelijke muizen hebben meer TH + SNc en VTA (middenhersenen) neuronen dan mannetjes gepaard met mannen, terwijl vrouwen gepaard met mannetjes hebben minder TH + SNc en VTA neuronen dan vrouwen gepaard met vrouwen (figuur 1 in 6). Een ander voorbeeld is hier gegeven in figuur 1, waarbij het gemiddelde ± SE aantal TH + neuronen SNc bij mannelijke en vrouwelijke muizen laat onmiddellijk following geslacht koppelen. Mannetjes gekoppeld vrouwen gedurende 7 dagen ongeveer 12% meer TH + neuronen SNc dan mannen gepaard met mannetjes (twee blauwe kolommen in figuur 1). Daarentegen vrouwen gepaard met mannetjes ongeveer 12% minder TH + neuronen SNc dan vrouwen gepaard met vrouwtjes (twee rode kolommen in figuur 1).
Het aantal TH + SNc en VTA neuronen verhoogt ook in volwassen mannelijke muizen onder EE (figuur 2 6) en EE-inductie van meer SNc TH + neuronen wordt opgeheven door gelijktijdige blokkade van middenhersenen GABA A-receptoren (figuur 3 6). Een ander voorbeeld is hier gegeven in figuur 2, waarin EE met vehiculum infusie resulteerde in ongeveer 14% meer TH + neuronen SNc dan SH met drager infusie (links twee kolommen in figuur 2). Echter, EE met GABAA-receptorantagonist infusie (hetzij 10 uM picrotoxine of 51; M bicuculline) afgeschaft deze toename (recht twee kolommen in figuur 2). Merk deze gegevens van de SNc contralateraal van de infusie canule en zijn vrijwel identiek aan de waargenomen in de ipsilaterale SNc die werden gerapporteerd in 6 effecten.
Figuur 1:. Effecten van geslacht koppelen aan het aantal SNc TH + neuronen Onmiddellijk na 7 dagen geslacht koppeling (protocol 1.1) volwassen muizen geperfuseerd (3.1), de middenhersenen werd doorgesneden (3.2), werden secties verwerkt voor tyrosine hydroxylase (TH , het snelheidsbeperkende enzym in DA synthese) immunohistochemie (3.3), en de nummers van TH + SNc neuronen werden geschat met behulp van stereologie (3.4). Hier Uitgezet zijn het gemiddelde ± SE aantal SNc TH + neuronen in mannelijke muizen gepaard met mannelijke muizen (n = 4 mannelijke muizen van n = 2 male-male paren, lichtblauw colUMN), mannetjes gepaard met vrouwen (n = 6 mannelijke muizen van 6 man-vrouw paren donkerblauwe kolom), vrouwen gepaard met vrouwen (n = 8 vrouwtjesmuizen van n = 4 twee vrouwelijke paren, lichtrood kolom), en vrouwen gepaard met mannetjes (n = 6 vrouwtjesmuizen van n = 6 man-vrouw paren, donkerrood kolom). Koppelen aan het andere geslacht resulteerde in een toename van het aantal SNc TH + neuronen in mannetjes maar een daling van het aantal SNc TH + neuronen in vrouwen (p <0,001 ANOVA; * p <0,05 Tukey paarsgewijze meerdere vergelijkingen).
Figuur 2: Effecten van milieu verrijking met middenhersenen GABAA-receptor blokkade van het aantal SNc TH + neuronen Onmiddellijk na 14 dagen milieu verrijking (protocol 1.2) met gelijktijdige infusie van ofwel drager, de GABAA-receptorantagonist pag.icrotoxin (10 uM), of de GABAA-receptorantagonist bicuculline (5 uM) in de linker middenhersenen (protocol 2), volwassen mannelijke muizen geperfuseerd (3.1), de middenhersenen werd doorgesneden (3.2), werden secties verwerkt voor tyrosine hydroxylase ( TH, het snelheidsbepalende enzym bij DA synthese) immunohistochemie (3.3), en de aantallen TH + neuronen in de rechter (contralaterale) SNc geschat met behulp stereology (3.4). Hier Uitgezet zijn het gemiddelde ± SE aantal SNc TH + neuronen in standaard ondergebracht (SH) mannelijke muizen met vehikel infusie (n = 6, lichtblauw kolom), milieu verrijkt (EE) mannen met drager infusie (n = 6, eerste donkerblauw kolom), EE mannen met picrotoxine infusie (n = 6, tweede donker blauwe kolom), en EE mannen met bicuculline infusie (n = 6, derde donker blauwe kolom). EE resulteerde in een toename van het aantal SNc TH + neuronen, maar dit werd afgeschaft door infusie van picrotoxine of bicuculline in de contralaterale middenhersenen (p <0,001 ANOVA; * P <0.001 Tukey paarsgewijze meerdere vergelijkingen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Milieu-manipulaties
De motivatie achter het ontwerp van deze milieu-manipulaties (geslacht koppelen en milieu verrijking) was om te bepalen of het milieu, en / of het gedrag ingegeven door het milieu, wordt geassocieerd met veranderingen in het aantal middenhersenen DA neuronen. De focus lag daarom op het leveren van omgevingen en het stimuleren van gedrag dat waarschijnlijk middenhersenen DA signalering betrekken. Deze omvatten het koppelen met het andere geslacht, en het milieu verrijking bestaande toegang tot loopwielen, touwen, ladders, tunnels, en objecten om te verkennen, spelen, klimmen, verstoppen, en nest. Beide omgevingen moeten beloning gemotiveerd cognitieve, emotionele en motorische gedragingen, die in verband zijn gebracht met acute stijging van de middenhersenen DA neuronale ontlading en DA vrijlating te bevorderen (bijvoorbeeld 8). Onze hypothese was ze ook samen met een langduriger veranderingen in middenhersenen DA signalering brmoet over door veranderingen in het aantal middenhersenen DA neuronen. Hier en elders 6, wordt het bewijs geleverd dat dit inderdaad het geval is.
Ons onderzoek begon met behulp van het geslacht pairing-protocol (1.1), omdat het bestaat uit een kern oer en essentiële-beloning gemotiveerd gedrag (dwz copulatie). Ook, reproductieve, pair-bonding, en sociaal gedrag zijn gekend om analoge veranderingen in andere neurochemische systemen induceren (bv veranderingen in dichtheid van oxytocine, vasopressine en corticotrophin releasing hormone cellen in 9 hypothalamus). Inderdaad, na 7 dagen continu koppelen met het andere geslacht, zien we hier en elders 6 dat mannetjes hebben ongeveer 10% meer TH + middenhersenen neuronen terwijl vrouwtjes hebben ongeveer 10% minder TH + middenhersenen neuronen [Opmerking: Deze effecten bestaan SNc (huidige studie en 6) en VTA 6, maar niet de locus coeruleus 6, waarbij TH helpt synthetiseren noradrenaline].Dit ondersteunt het idee dat het aantal middenhersenen DA neuronen in de volwassen hersenen niet vast, maar verandert afhankelijk van de omgeving, gedrag of milieu / gedrag interacties. Ander bewijs voert deze veranderingen worden veroorzaakt door veranderingen in expressie van het TH-gen en eiwit bestaande neuronen van de middenhersenen, in tegenstelling tot DA neurogenese of degeneratie. (1) DA neurogenese in de volwassen muis middenhersenen wordt hetzij helemaal 10-14, of een snelheid veel lager dan kan verklaren de toevoeging van ongeveer 500 nieuwe SNc DA neuronen in week 15,16. (2) Studies kwantificeren van veranderingen in het aantal SNc neuronen na 2 weken infusies van verschillende drugs richten op de elektrische activiteit van de middenhersenen neuronen hebben consequent onthuld gelijk (weer ongeveer 10%), maar tegenover veranderingen TH + en TH- cellen, wat resulteert in geen netto verandering in het totale aantal cellen 4,5. Dit is consistent met de regulering van TH eiwitniveaus boven of onder immunohistochemisch detectable levels zonder optellen of aftrekken van neuronen. (3) Veel studies hebben gemeld activiteit-afhankelijke veranderingen in de TH-gen en eiwit expressie in cellen over een tijdschaal van enkele uren 17-23, en hetzelfde is gemeld in de middenhersenen 4.
De vraag rijst dus wat zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan veranderingen in de expressie van de TH-gen en eiwit in bestaande middenhersenen neuronen. Mogelijkheden zijn onder andere geslachtshormonen, die ten grondslag liggen aan zowel de basislijn verschillen in aantal TH + middenhersenen neuronen bij mannen en vrouwen, alsmede genderspecifieke veranderingen (toename bij mannen en neemt af bij vrouwen) na het paren hier en eerder 6 gemeld. Een andere mogelijkheid is de activiteit-afhankelijke regulatie van TH expressie. SNc en VTA neuronen (zowel DA en niet-DA) ontvangt synaptische inbreng voornamelijk uit het striatum, hypothalamus, nucleus subthalamicus, en frontale cortex 24. In het kader van gender koppelen, deze ingangenkan worden geregeld door sensomotorische gedrag, reukzin, feromonen, stress, metabolisme, of voortplanting. Activiteit-afhankelijke regulatie van TH expressie kan worden gemedieerd via calcium of neuropeptide signaalwegen die gen- en eiwitexpressie (bv 1).
Om u te helpen onderscheid te maken tussen geslachtshormonen versus activiteit-afhankelijke mechanismen ten grondslag liggen aan de gevolgen van gender koppelen aan het aantal middenhersenen DA neuronen we in dienst van het milieu verrijking protocol (1.2), die betere controles tegen de mogelijke invloed van geslachtshormonen en misschien ook andere hormonen ( bijvoorbeeld feromonen, stress, reproductie) en de mogelijke invloed van afferente aangedreven neuronale activiteit. De relevante factor is hier de verschillende groepen waren veel meer vergelijkbaar in termen van geslacht (alle mannen), hormonen, sociale status en stress. Hoewel de sociale status en stress, kunnen nog steeds verschillen tussen groepen (bijvoorbeeld een meer dominante en agressieve manin één groep), is het onwaarschijnlijk dat dit altijd dezelfde groep (bijvoorbeeld EE), en de effecten van EE zijn nu meerdere keren 6 gerepliceerd. In EE, de omvang van de toename middenhersenen TH + neuronen was hetzelfde als in het geslacht koppeling protocol (vergelijk mannen in de figuren 1 en 2 deze studie, en Figuren 1 en 2 in 6). Bovendien werd het-EE geïnduceerde toename in SNc TH + neuronen veroorzaakt door omgevingsfactoren verrijking volledig afgeschaft door gelijktijdige blokkade van middenhersenen GABA A-receptoren (Figuur 2 huidige studie en figuur 3 in 6), die ongeveer 70% van alle afferente input te leveren voor middenhersenen DA 25 neuronen. Tezamen geven deze gegevens aan-afferente aangedreven neurale activiteit minstens even krachtig invloed op het aantal middenhersenen DA neuronen hormonen.
Verder inzicht in de milieu-factors vaststellen van het aantal middenhersenen TH + neuronen afkomstig uit waarin de effecten van RW en EE. RW bestaat uit een goed geleerd of banale motorische activiteit (die op de wielen), terwijl EE bestaat uit een vergelijkbaar bedrag van een dergelijke activiteit, zij het van een grotere verscheidenheid (dwz diverse speelgoed maar ongewijzigd gedurende de 14 dagen), plus voortdurende blootstelling aan nieuw speelgoed in de component SE (1.2.4). Onze eerder gepubliceerde gegevens 6 onthulde geen of geringe verhogingen van de SNc en VTA TH + neuronen in RW vergelijking met SH muizen, maar veel grotere stijgingen van de EE (+ SE) muizen. Dit benadrukt zintuiglijke stimulatie, cognitie, nieuwheid en / of leren en geheugen als meer potente regulatoren van het aantal middenhersenen DA neuronen dan banale fysieke activiteit alleen.
EE is uitgebreid gebruikt om therapeutische effecten induceren en vergroten hersenen reparatie in verschillende diermodellen van hersenaandoeningen zoals Alzheimer, Huntington en de ziekte van Parkinson 26. De nvttuur van dergelijke milieu-manipulaties is dat ze zeer sterk variëren tussen laboratoria (net als 'standaard gehuisvest' omstandigheden), maar er zijn belangrijke aspecten van EE protocollen die opmerkelijk zijn en zijn eerder besproken 27. EE biedt extra milieu nieuwheid en complexiteit opzichte van standaard huisvesting, teneinde het niveau van sensorische stimulatie, cognitieve en fysieke oefeningen verbeteren. Bij het ontwerpen van EE experimenten, moet men ethologische factoren, waaronder de zintuiglijke en cognitieve vaardigheden van de dieren en hun instinctieve schijven overwegen. Muizen (en ratten) zijn nachtdieren, met inferieure visuele vaardigheden voor de mens, maar uitstekend somatosensorische en olfactorische acuities, moet de verrijking objecten de aangeboren instincten en capaciteiten van de proefdieren te reflecteren. Daarom is de nieuwheid, vorm, textuur en geur van de voorwerpen die bijzonder opvallende muizen kunnen zijn. Evaluaties van de relatieve sterkte van Moti knaagdieren 'kingen voor een verscheidenheid van verrijking objecten hebben geleid tot aanbevelingen voor de opneming van kauwtabletten objecten, zodat de kans om fundamentele, soort-typisch gedrag 28,29 oefenen. De verstrekking van nestmateriaal wordt beschouwd als een fundamenteel onderdeel van de verrijking protocol en muizen zullen instinctief scheuren alle objecten van papier of karton, waardoor kans voor zintuiglijke, cognitieve en motorische activiteiten 30,31. Belangrijk is ook dat in een experiment met meerdere EE kooien, het equivalent nieuwheid en complexiteit van objecten is opgenomen, op variantie binnen de EE-groep minimaliseren en soortgelijke controle van omgevingsparameters geboden voor de SH groep. Idealiter zou de aantallen muizen per kooi dezelfde tussen EE en SH-groepen (tenzij de effecten van sociale groepsgrootte worden specifiek onderzocht) te zijn, en geen 'food traktaties' moet worden gebruikt in EE, als elk dieet verschillen tussen groepen konden verwarren tHij interpretatie van de effecten van de cognitieve en fysieke oefeningen die EE verbetert 12. Andere belangrijke overwegingen zijn de duur van de blootstelling aan een verrijkte omgeving en de leeftijd waarop de verrijking begint. Terwijl differentiële expressie van genen is aangetoond na 3 uur in een verrijkt milieu 32 kan Langdurige blootstelling vereist voor structurele en functionele veranderingen optreden 33,34. Bovendien kan verrijkings- geïnduceerde plasticiteit worden versterkt bij postnatale kritische ontwikkelingsstoornissen periodes 35.
Osmotische pomp en de hersenen infuus canule implantaten voor drug infusies
De osmotische pomp en canule implantaten zijn zeer effectief voor het leveren van medicijnen direct in de hersenen. Met ervaring, het implantaat operatie duurt ongeveer 1 uur per muis. Tandheelkundige acryl alleen al is voldoende om de canule op zijn plaats vast te stellen voor langere tijd (Let op: Wij zijn gestegen tot 28 dagen in het oTher experimenten); Er is geen behoefte aan extra bevestigingsmiddelen, zoals botschroeven. Het is belangrijk om te zorgen voor voldoende speling in de buis die de pomp en canule om voor maximale hoofd en nek flexie zonder dat te veel stress op de aansluitingen. Dit geldt met name voor langere termijn infusies, waar de groei van bindweefsel rond de pomp kan verankeren plaats waardoor de flexibiliteit van het implantaat reduceren. Waar mogelijk, muizen zijn ook single-gehuisvest na een operatie aan huisgenoten beschadiging van het implantaat niet door krassen, trekken of bijten te voorkomen. De dosis geneesmiddel wordt grotendeels bepaald door het toegevoegd aan de pomp bedrag. In dit verband moet ook aandacht worden besteed aan het pompdebiet, de chemische stabiliteit van het geneesmiddel bij 37 ° C, en de diffusiesnelheid van het geneesmiddel uit de canule door de hersenen. Momenteel beschikbaar pompen van onze leverancier kunnen infusie gedurende maximaal 6 weken te handhaven op een debiet van 0,15 pl / uur; de snelleest beschikbare debiet is 10 pl / uur, maar voor de duur van slechts 1 week. Langere infusietijden kan worden bereikt door extra kleine chirurgische ingrepen aan uitgeputte pompen door volle pompen op de achterkant van de verbindingsbuis (dus zonder de geïmplanteerde canule). De ruimtelijke omvang van methyleenblauw (1% methyleenblauw, MW 320, in 0,9% NaCl) diffusie van een canule-uiteinde geïmplanteerde 0,3 mm boven het linker SNc halverwege langs de mediolateral aspect werd gemeten om zich vanaf de zijrand van de middenhersenen gewoon over de middellijn mediolaterally en het gehele dorsoventral omvang van de middenhersenen (na 2 weken van de infusie). Dit is veel meer verspreid dan een kleine kern zoals SNc en de verspreiding van geneesmiddel kan groter (of kleiner) afhankelijk van zijn MW, chemische stabiliteit, buffercapaciteit, etc. Inderdaad kan men afleiden uit de huidige gegevens (figuur 2) dat zowel picrotoxine en bicuculline in biologisch actieve concentrati bereikt de contralaterale SNcons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
- Aumann, T., Horne, M. Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons. Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).
- Sauer, H., Oertel, W. H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience. 59, 401-415 (1994).
- Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat. The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).
- Aumann, T. D., et al. Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons. Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).
- Aumann, T. D., et al. SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta. Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).
- Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice. Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic Press. (2001).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).
- Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry. Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).
- Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).
- Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).
- Lie, D. C., et al. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).
- Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor. Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).
- Yoshimi, K., et al. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).
- Shan, X., et al. Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice. Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).
- Zhao, M., et al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).
- Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).
- Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion. Brain research. 339, 151-153 (1985).
- Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).
- Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).
- Richard, F., et al. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).
- Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).
- Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons. Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).
- Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 74, 858-873 (2012).
- Tepper, J. M., Lee, C. R. GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons. Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).
- Hannan, A. J. Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity. Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Chmiel, D. J., Noonan, M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).
- Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects. Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).
- Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).
- Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).
- Rampon, C., et al. Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).
- Eckert, M. J., Abraham, W. C. Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus. Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).
- Sztainberg, Y., Chen, A. An environmental enrichment model for mice. Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).
- Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy. Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).
