Abstract
Långvariga förändringar i hjärnan eller "hjärnans plasticitet" bakom adaptivt beteende och hjärn reparation efter sjukdom eller skada. Dessutom kan interaktioner med vår miljö framkalla hjärnans plasticitet. Alltmer, är forskning försöker identifiera vilka miljöer stimulerar hjärnans plasticitet välgörande för behandling hjärnan och beteendestörningar. Två miljö manipulationer beskrivs som ökar eller minskar antalet tyrosinhydroxilas immunopositiva (TH +, det hastighetsbegränsande enzymet i dopamin (DA) syntes) nervceller i den vuxna musen mitthjärnan. Den första omfattar pairing manliga och kvinnliga möss tillsammans kontinuerligt under 1 vecka, vilket ökar mitthjärnan TH + nervceller med cirka 12% hos män, men minskar hjärnan TH + nervceller med cirka 12% hos kvinnor. Den andra består av bostäder möss kontinuerligt i 2 veckor i "berikade miljöer" (EE) innehållande löphjul, leksaker, rep, bomaterial, etc., som jagncreases mitthjärnan TH + nervceller med cirka 14% hos män. Dessutom är ett protokoll beskrivs för samtidigt infusion läkemedel direkt in i mitthjärnan under dessa miljö manipulationer för att hjälpa till att identifiera mekanismerna bakom miljö inducerad hjärnans plasticitet. Till exempel är EE-induktion av mer mitthjärnan TH + neuroner avskaffas genom samtidig blockad av synaptisk inmatning på mitthjäman neuroner. Tillsammans har dessa uppgifter tyder på att information om miljön förmedlas via synaptiska ingång till mitthjärnan nervceller för att slå på eller stänga av uttryck av "DA" gener. Således lämplig miljö stimulering, eller drog inriktning av de underliggande mekanismerna, kan vara till hjälp för behandling av hjärn och beteendestörningar associerade med obalanser i mitthjärnan DA (t.ex. Parkinsons sjukdom, uppmärksamhetsstörning och hyperaktivitet, schizofreni, och drogmissbruk).
Introduction
DArgic signalering av neuroner i den ventrala tegmentala arean (VTA) och substantia nigra pars compacta (SNC) för mitthjärnan tros vara viktiga för belöning-motiverade kognitiva, känslomässiga och motoriska beteenden. Dock orsakar för mycket eller för lite mitthjärnan DA signalering många invalidiserande symptom i olika neurologiska sjukdomar (t.ex. Parkinsons sjukdom, uppmärksamhet underskott och Hyperactivity Disorder, schizofreni, och narkotikamissbruk). Läkemedel som ökar eller minskar DA signalering lindra dessa symptom, men de producerar också biverkningar som kan tillskrivas dysreglerad signalering och off-target effekter. Läkemedlets effektivitet avtar också över tiden på grund av kompenserande svar i hjärnan. Utmaningen är därför att återställa normal mitthjärnan DA signalering på ett mer målinriktat och fysiologiska sätt, och en gynnad tillvägagångssätt är genom att öka eller minska antalet mitthjärnan DA nervceller.
Bevis har ackumulerats för sevrala decennier att uttrycket av gener och proteiner involverade i metaboliserande och handel DA och andra katekolaminer i mogna vuxna celler är modifierbara (granskade i 1). I mitthjärnan, minskar antalet tyrosinhydroxilas immunopositiva (TH +, det hastighetsbegränsande enzymet i DA syntes) nervceller sedan ökar efter neurotoxin administration 2,3, medan antalet TH immunonegative (TH) neuroner visar det motsatta mönstret (dvs ökar sedan minskningar 3). Detta överensstämmer med förlust sedan vinna den "DA fenotypen" av vissa celler. Antalet TH + och TH- snc neuroner har också visats att ändras i lika men motsatta riktningar efter olika behandlingar som förändrar den elektriska aktiviteten hos dessa celler 4,5. Till exempel, infusion av liten-konduktans, kalciumaktiverade kalium (SK) kanalantagonist apamin i mitthjärnan under två veckor minskar antalet TH + och ökar (med samma belopp) NUmber av TH- SNC Neuroner 4,5. I motsats härtill ökar infusion av SK kanal agonisten en-EBIO antalet TH + och minskar (med samma belopp) antalet TH- snc neuroner 4,5. Liknande förändringar sågs efter olika behandlingar riktade SNC nervaktivitet, inklusive några som riktade afferenta ingångar 4. Denna uppenbara reglering av antalet SNC DArgic neuroner genom neuronal aktivitet och afferenta ingång tar upp möjligheten att miljön eller beteende kan påverka antalet SNC neuroner. Indeed vuxna möss som exponeras för olika miljöer har mer eller mindre mitthjärnan (SNC och VTA) TH + nervceller, och åtminstone en del av dessa miljö inducerade förändringar avskaffas genom samtidig blockad av synaptisk input i mitthjärnan 6. Syftet med detta meddelande är att: (1) ge mer information om hur man genomför våra miljö manipulationer och drog infusioner; och (2) ge ytterligare uppgifter som stöder vårt påstående att eMILJÖ reglerar antalet mitthjärnan DA nervceller, via afferenta ingång.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla experimentella procedurer på djur har godkänts av Florey Institute of Neuroscience & Mental Hälsa Animal etikkommitté och uppfyller Australiens nationella hälso-och medicinska forskningsrådet publicerade uppförandekod för skötsel och användning av djur för vetenskapliga ändamål (7: e upplagan, 2004).
1. Miljö Manipulationer
- Kön Pairing
- Använd könsmogna (> 8 veckor gamla), åldersmatchade manliga och kvinnliga möss.
OBS: Vi använder vanligtvis C57BL / 6 möss, men har haft samma utfall som använder schweiziska möss i detta protokoll. Vi använder vanligtvis n = 8 hanar och n = 8 honor för varje experiment, uppdelat i n = 2 mans hane par (n = 4 hanar), n = 2 kvinnliga kvinnliga paren (n = 4 honor), och n = 4 manliga kvinnliga par (n = 4 hanar och n = 4 honor). - Vid ankomsten i djuret anläggningen anläggningen, grupp-house mössen efter kön för> 3 dagar att acklimatisera. Här och rakt igenomHout genusihopkopplingen hålla ovidkommande stimuli från omgivningen (t.ex. omgivningstemperatur, ljus: mörker-cykel, mat, vatten, hantering och rengöring) konstant eller distribuera lika för alla möss.
- Slumpmässigt tilldela varje mus till en hane-hane paret, en hona-hona par, eller en han-hon paret. Placera varje par i en ren bur isolerat (2 möss / bur) med fri tillgång till mat och vatten, och helt enkelt hus dem på detta sätt kontinuerligt under 7 dagar.
OBS: Rutin djurhållning är OK under denna period men måste fördelas lika till alla möss. Var noga med att undvika parning av manliga och kvinnliga syskon.
- Använd könsmogna (> 8 veckor gamla), åldersmatchade manliga och kvinnliga möss.
- Miljö Anrikning
- Använd könsmogna (> 8 veckor gamla), åldersmatchade manliga eller kvinnliga möss.
OBS: Vi använder vanligtvis n = 18 möss för varje experiment, uppdelade i n = 6 / behandlingsgrupp. - Vid ankomsten till djuret anläggningen anläggningen hålla dem hålls i grupp i samma standard inrymt (SH) (t.ex. (t.ex. omgivningstemperatur, ljus: mörker-cykel, mat, vatten, hantering och rengöring) konstant eller distribuera lika för alla möss.
- Till att börja miljöberikning, slumpmässigt tilldela varje mus till en av tre grupper: SH; löphjul (RW), eller miljö anrikad (EE) och placera varje grupp av möss ihop till en identisk ren bur med fri tillgång till mat och vatten.
OBS: Här, större råtthållande burar för alla grupper, som mäter 27 cm bred, 42 cm lång och 16 cm djupa användes.- Dessutom ger följande omgivningsförhållanden till varje grupp: SH bestående enda kull (papperspellets eller sågspån) på golvet; RW bestående SH plus 2 löphjulen; EE bestående RW plus leksaker (rep, stegar, tunnlar, och objekt som tomma pappershandduksrullar och bitar av mjukpapper) som till explore, lek, klättra, gömma, och boet.
- Hus dem på detta sätt kontinuerligt under 14 dagar.
OBS: Rutin djurhållning är OK under denna period men måste fördelas lika till alla möss.
- Ämnes EE möss till ytterligare "super anrikning" (SE) genom att placera dem tillsammans i en större bur som innehåller nya leksaker för 1 timme / dag (samma timme varje dag), 5days / vecka.
OBS: Här var en 46 cm bred, 69 cm lång och 40 cm djupa plastbalja som används.- Behåll nyhet genom att presentera en annan uppsättning leksaker varje session. Rena leksaker som ska åter presenteras för möss med tvålvatten och 80% etanol för att avlägsna dofter.
- Efter varje SE session tillbaka mössen till sina EE bur. Handtag SH och RW möss samma som SE-möss (utom SE själv) under hela denna period (t.ex. ta bort och återvänder varje SH och RW-mus från och till sin bur).
- Använd könsmogna (> 8 veckor gamla), åldersmatchade manliga eller kvinnliga möss.
- Framställning
- Använd sterila osmotiska pumpar och hjärninfusions kit, som är tillgängliga i handeln. Dagen före implantation, med aseptisk teknik, prime implantaten genom att fylla varje pump, rör och kanyl med sterilt läkemedel eller fordonslösning (som beskrivs i instruktionerna som medföljer pumparna). Anslut dem tillsammans och inkubera i steril saltlösning över natt vid 37 ° C. Inkubera läkemedels- och fordonsfyllda implantat separat för att undvika korskontaminering.
- Kirurgi.
OBS: Beroende på vilket land försöks, speciella Djurförsök utsläppsrätter och tillstånd som krävs för att bedriva denna typ av kirurgi och postoperativa experiment.- Sterilisera all kirurgisk utrustning och anställa aseptisk teknik hela. Söva en mus (t.ex. med 1-2% isofluoran i luft) och placera den i en stereotaxic gruvlave. Kontrollera anestesidjupet under hela förfarandet och administrera ytterligare bedövningsmedel som behövs (t.ex. avsaknad av lem tillbakadragande till skadliga tass nypa indikerar adekvat anestesi). Säker ögonen skyddas från uttorkning genom smörjmedelsögonsalva, och att musens kroppstemperatur är normal hela proceduren.
- Gör en mittlinjeincision genom huden med utgångspunkt från mellan ögonen och efterbehandling 2 cm posteriort om bakkanten av skallen. Blunt dissekera huden bort från den underliggande fascia ner på baksidan av musen för att skapa en subkutan ficka tillräckligt stor för att bekvämt passa pumpen och anslutningsröret när kanylen är implanterad (förbindelseröret skall inte krökas vid färdig). Skrapa rensa fascian från över dorsala aspekten av skallen.
- Använda en ca 1,5 mm diameter tandvård Burr, borra ner i skallen på lämplig stereotaxiska koordinater until ett tunt, flexibelt skikt av benrester. Detta skikt bort med fin pincett (detta undviker att skada den underliggande dura mater och hjärna med tand burr) Peel. Säker skallen rengörs med någon blod och benfragment, och att det inte finns någon ytterligare blödning.
- Med kanylen hålls av en kanyl hållare, placera pumpen och anslutningsröret i den subkutana ficka liggande musens rygg. Därefter placera kanylens spets vid de lämpliga stereotaxic koordinater och på ytan av hjärnan. Sänk försiktigt ner kanylen in i hjärnan men sluta ungefär 1 mm kortare på önskat djup.
OBS: Det återstående djupet kommer att förhandlas efter applicering av det första lagret av dentala akryl. - Säker igen ytan av skallen är ren och torr, sedan förbereda en liten volym dentala akryl och använda en tandpetare för att släta över hela exponerade området av skallen, inklusive i burr hål genom skallen runt the kanyl. Innan akryl hårdnar, sänk kanylen tippa resterande djupet in i målet.
- Förbered en annan liten volym dentala akryl och lager här över den första, liksom över den vita plasten stöd för kanylen, för att fixera kanylen på plats. Upprepa med ytterligare lager av akryl som behövs.
- När akryl har hårdnat, försiktigt bort kanylen hållaren och avbröt den vita plasten löstagbara kanyl flik med hjälp av en skalpell blad värms med en butan flamma. Slutligen sutur huden stängt över hela implantatet.
- Post kirurgisk behandling av djur
- Applicera antiseptisk salva till marginalerna hud, och administrera en anti-inflammatoriskt till musen (t.ex. Meloxikam, 3 mg / kg se). Ta musen från ramen, placera den under en värmelampa, och observera tills den återfår medvetandet. Skicka inte tillbaka en mus som har opererats för företaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
OBS: Experimental manipulationer som kön parning och miljöberikning kan initieras eller återupptas dagen efter operationen tidigast. - Övervaka sin kroppsvikt, allmänna beteende och utseende dagligen. Behandla tecken på infektion (t ex svullnad, rodnad, pus) runt kirurgiska snitt med utvärtes antiseptisk salva. Behandla alla tecken sjukdom, smärta, stress eller obehag (t.ex. förlust av> 10% kroppsvikt, socialt tillbakadragande, brist på grooming, "fluffa", rörelse dysfunktion, kramper) med system analgetika och / eller antibiotika som behövs.
- Euthanize möss om> 15% viktminskning eller symtom på sjukdom, smärta, stress eller obehag är icke återvinnings inom 1 vecka avhjälpande behandling.
- Applicera antiseptisk salva till marginalerna hud, och administrera en anti-inflammatoriskt till musen (t.ex. Meloxikam, 3 mg / kg se). Ta musen från ramen, placera den under en värmelampa, och observera tills den återfår medvetandet. Skicka inte tillbaka en mus som har opererats för företaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
3. hjärnvävnad Förberedelse, Immunohistokemisk Processing och Stereology
- Perfusion
- Omedelbart efter miljö / drog manipulationer, förbereda hjärnan för studien.
- Först administrera en överdos av bedövningsmedel för att döda möss (t.ex. 100 mg / kg ip natriumpentobarbiton). När sövda men innan hjärtat slutar slå, lägg musen på rygg och slips eller sätta fingret på båda framben.
- Med användning av en skalpell skära bort huden liggande över thorax incisionsfilm sedan genom muskeln strax under bröstkorgen in i bukhålan. Placera en klämma på xiphoid processen för bröstkorgen och lyft bröstkorgen upp och bort från levern exponera membranet.
- Skär igenom membranet och genom revbenen sidled på båda sidor med stora saxar tills bröstkorgen kan vikas tillbaka över huvudet för att exponera lungorna och hjärtat. Använda fina saxar gör ett litet snitt i höger förmak som en utgångspunkt för blod och perfusion lösningar, sedan skära genom basen av den vänstra ventrikel och placera en kanyl upp genom vänster kammare, vänster förmak, och i aorta.
- Kläm fast kanylen på plats sedan pump varm (37 ° C) hepariniserades och 0,1 M fosfatbuffrad fysiologisk saltlösning (PBS) genom kärl tills lösningen som lämnar det högra förmaket är helt fri från blod. Därefter pumpa kall (4 ° C) fixeringslösning (såsom 4% paraformaldehyd i PBS) genom kärl tills hela musen är väl fixerad. Ta hjärnan och placera i PBS med 30% sackaros i 2-3 dagar tills hjärnan sjunker.
OBS: Andra typer av förberedelse vävnad kan tillämpas beroende på kompetens i motsvarande laboratorium.
- Omedelbart efter miljö / drog manipulationer, förbereda hjärnan för studien.
- Beredning av fritt flytande Kryosnitt
- Skär seriesnitt genom hjärnregioner av intresse och samla dessa i PBS.
OBS: Vi skär 40 um tjocka sektioner med hjälp av en kryostat. Andra typer av vävnad sektione kan tillämpas beroende på kompetens inom corresponding laboratorium.
- Skär seriesnitt genom hjärnregioner av intresse och samla dessa i PBS.
- Immunohistokemi
- Utför standard immunohistokemi för proteiner av intresse. Inkubera sektioner i 5% normalt getserum och 0,3% Triton X-100 i PBS vid rumstemperatur under 30 min, därefter immunoreagerar med polyklonala kanin-anti-TH (1: 400) vid 4 ° C under 48 h, sedan polyklonal biotinylerad get anti -rabbit (1: 1000) vid rumstemperatur under 2 h.
- Därefter inkubera i avidin-peroxidas (1: 500) vid rumstemperatur under 1 timme, därefter i kobolt- och nickel-intensifierat diamino-bensidin (0,5 mg / ml) vid rumstemperatur under 18 till 20 min; för den sista 3-5 minuter av diamino-bensidin inkubation till väteperoxid (0,01%) för att katalysera kromagen utfällning. Tvätta avsnitt tre gånger för 10min vardera i PBS före, efter och mellan varje av ovanstående steg.
- Montera avsnitten om gelatiniserade objektglas, lufttorka dem, sedan Nissl fläcken (neutralrött), torka i alkohol, klart (X-3B), och täckglas.
- Uppskatta det totala antalet TH + och TH SNC (och VTA och LC) nervceller använder objektiva stereologisk metoder. Se till att stereologist är blind för den erhållna vården. Uteslut Glia på grundval av soma diameter <5 | j, m och räkna endast de celler med en synlig kärna.
- Identifiera SNC (och VTA och LC) av de rumsliga placeringen av TH + celler och anatomiska landmärken / gränser enligt de hjärnatlas Paxinos och Watson 7. Räkna TH + celler inom en räknings ram (55 x 55 um = 3025 um 2) med jämna förutbestämda intervall (x = 140 nm, y = 140 ìm för SNC, x = 100 nm, y = 100 nm för VTA och LC) under varje kärna i var fjärde avsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vuxna möss som utsätts för dessa miljö manipulationer har förändrat antal mitthjärnan (SNC och VTA), men inte LC, TH + nervceller, och EE plus samtidig mitthjärnan infusion av antingen pikrotoxin eller bikukullin (GABA A-receptorantagonister) upphäver EE-induktion av mer SNC TH + neuroner. Dessa data har tidigare publicerats i 6. Föreliggande data samlades i upprepade experiment utförs som en del av den föregående undersökningen, men har inte publicerats någon annanstans.
Specifikt vuxna hanmöss som har kopplats ihop med vuxna honmöss har mer TH + SNC och VTA (mitthjärnan) neuroner än män parat med hanar, medan honorna paras med hanar har färre TH + SNC och VTA nervceller än honor parade med honor (Figur 1 i 6). Ett annat exempel på detta finns här i figur 1, som visar medelvärdet ± SE antal TH + SNC nervceller i manliga och kvinnliga möss omedelbart following genus parning. Hanar parade med honor under 7 dagar har ungefär 12% fler TH + SNC nervceller än män parade med män (två blå kolumnerna i figur 1). Däremot honor parade med hanar har ungefär 12% färre TH + SNC nervceller än honor parade med kvinnor (två röda pelare i figur 1).
Antalet TH + SNC och VTA nervceller ökar också i vuxen hanmöss föremål för EE (figur 2 i 6), och EE-induktion av fler SNC TH + nervceller avskaffas genom samtidig blockad av mitthjärnan GABA A-receptorer (Figur 3 i 6). Ett annat exempel på detta finns här i figur 2, där EE med fordons infusion gav en 14% fler TH + SNC nervceller än SH med fordons infusion (vänster två kolumner i figur 2). Men EE med GABA A-receptorantagonist infusion (antingen 10 iM pikrotoxin eller 51; M bikukullin) helt avskaffat denna ökning (höger två kolumner i figur 2). Observera, dessa uppgifter är från SNC kontra till infusionskanyl, och är nästan identiska med de effekter som observerats i ipsilaterala SNC, som rapporterades i 6.
Figur 1:. Effekter av könsihopkoppling av antalet SNC TH + nervceller Omedelbart efter 7 dagar av köns pairing (protokoll 1.1) vuxna möss perfusion (3,1), var deras mitthjärnan sektion (3,2), var sektioner behandlas för tyrosin hydroxylas (TH , det hastighetsbegränsande enzymet i DA-syntes) immunohistokemi (3,3), och antalet TH + SNC nervceller uppskattades med hjälp stereology (3,4). Plottad Här är medelvärdet ± SE antal SNC TH + nervceller i hanmöss parade med hanmöss (n = 4 hanmöss från n = 2 mans manliga par, ljusblå colUMN), män parat med kvinnor (n = 6 hanmöss från 6 manliga kvinnliga par, mörkblå spalten), honor parade med kvinnor (n = 8 honmöss från n = 4 kvinnliga kvinnliga par, ljusröd kolumn), och honor parade med män (n = 6 honmöss från n = 6 män och kvinnor par, mörkröd kolumnen). Parning med motsatt kön resulterade i en ökning av antalet SNC TH + neuroner hos män men en minskning i antal SNC TH + -neuroner hos honor (p <0,001 Envägs ANOVA, * p <0,05 Tukeys parvisa multipla jämförelser).
Figur 2: Effekter av miljöberikning med mitthjärnan GABA A-receptorblockad på antalet SNC TH + nervceller Omedelbart efter 14 dagar miljöberikning (protokoll 1.2) med samtidig infusion av antingen fordonet, GABA A-receptorantagonisten p.icrotoxin (10 M), eller GABA A-receptorantagonisten bikukullin (5 M) i den vänstra mitthjärnan (protokoll 2), var vuxna hanmöss perfusion (3,1), var deras mitthjärnan sektion (3,2), var sektioner behandlas för tyrosin hydroxylas ( TH, det hastighetsbegränsande enzymet i DA-syntes) immunohistokemi (3,3), och antalet TH + nervceller i den högra (kontra) SNC uppskattades med hjälp stereology (3,4). Plottad Här är medelvärdet ± SE antal SNC TH + nervceller i standard inrymt (SH) hanmöss med fordons infusion (n = 6, ljusblå kolumn), miljö berikad (EE) hanar med fordons infusion (n = 6, första mörkblå kolumn), hanar EE med pikrotoxin infusion (n = 6, andra mörkblå kolumn), och EE hanar med bicucullin infusion (n = 6, tredje mörkblå kolumnen). EE resulterade i en ökning av antalet SNC TH + neuroner, men detta upphävdes genom infusion av pikrotoxin eller bikukullin i den kontralaterala mitthjärnan (p <0,001 Envägs ANOVA; * P <0,001 Tukeys parvisa multipla jämförelser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miljö manipulationer
Motiveringen bakom utformningen av dessa miljö manipulationer (kön ihopparning och miljöberikning) var att fastställa om miljön, och / eller beteende föranletts av miljön, är förknippad med förändringar i antalet mitthjärnan DA nervceller. Fokus låg därför på att ge miljöer och stimulerande beteenden som sannolikt kommer att engagera mitthjärnan DA signalering. Dessa inkluderade parningen med det motsatta könet, och miljöberikning omfattande tillgång till rinnande hjul, rep, stegar, tunnlar och objekt att utforska, lek, klättra, gömma, och boet. Båda dessa miljöer bör främja belöningsmotiverade kognitiva, emotionella och motoriska beteenden, som har förknippats med akuta ökningar i mitthjärnan DA neuronal urladdning och DA frisättning (t.ex. 8). Vår hypotes var att de också förknippade med längre livslängd förändringar i mitthjärnan DA signalering brborde, genom förändringar av antalet mitthjärnan DA nervceller. Här och på andra ställen 6, är bevis presenteras att detta verkligen är fallet.
Våra undersökningar började använda köns pairing protokollet (1,1) eftersom den omfattar en kärna primal och väsentlig belöning motiverade beteende (dvs parning). Dessutom är reproduktiv, par-bindning, och sociala beteenden vet inducerar analoga förändringar i andra neurokemiska system (t.ex. förändringar i täthet av oxytocin, vasopressin och kortikotropin-frisättande hormon celler i 9 hypotalamus). Ja, efter 7 dagars kontinuerlig ihopkoppling med det motsatta könet, visar vi här och annorstädes 6 att män har ungefär 10% mer TH + mitthjärnan nervceller medan honorna har ungefär 10% färre TH + mitthjärnan nervceller [OBS: Dessa effekter omfattar SNC (aktuella studien och 6) och VTA 6, men inte locus coeruleus 6, där TH hjälper syntetisera noradrenalin].Detta stöder uppfattningen att antalet mitthjärnan DA nervceller i den vuxna hjärnan inte är fast, men förändringar beroende på miljö, beteende, eller miljö / beteendeinteraktioner. Andra bevis hävdar dessa förändringar till följd av förändringar i uttrycket av TH-genen och protein i bevarade mitthjäman neuroner, i motsats till DA neurogenes eller degenerering. (1) DA neurogenes i vuxen mus mitthjärnan sker antingen inte alls 10-14, eller i en takt mycket lägre än vad som kan stå för tillägg av cirka 500 nya SNC DA nervceller i en vecka 15,16. (2) Studier kvantifiera förändringar i antalet SNC neuroner Följande 2 veckors infusioner av olika läkemedel riktade den elektriska aktiviteten i mitthjärnan nervceller har konsekvent visat lika (igen ungefär 10%) men motsatta förändringar TH + och TH-celler, vilket resulterar i ingen nettoförändring det totala antalet celler 4,5. Detta överensstämmer med regleringen av TH proteinnivåer över eller under immunohistokemiskt Detectable nivåer utan addition eller subtraktion av neuroner. (3) Många studier har rapporterat aktivitetsberoende förändringar i TH gen- och proteinuttryck inom celler över en tidsskala av flera timmar 17-23, och detsamma har rapporterats i mitthjärnan 4.
Man frågar sig därför vad är mekanismerna bakom förändringarna i uttryck av TH-genen och protein i bevarade mitthjärnan nervceller. Möjligheter inkluderar könshormoner, vilket kan ligga bakom båda baslinjen skillnaderna i antalet TH + mitthjärnan nervceller i hanar och honor, liksom könsspecifika förändringar (ökning av män och minskar hos kvinnor) efter ihopkoppling rapporteras här och tidigare 6. En annan möjlighet är aktivitetsberoende reglering av TH uttryck. SNC och VTA neuron (både DA och icke-DA) får synaptiska input främst från striatum, hypotalamus, nucleus subthalamicus och frontala cortex 24. I samband med könsihopkopplingen dessa ingångarkan regleras genom sensomotorisk beteende, olfaction, feromoner, stress, metabolism eller reproduktion. Aktivitet beroende reglering av TH uttryck kunde förmedlas via kalcium eller neuropeptid signalvägar påverkar gen- och proteinuttryck (t.ex. 1).
För att hjälpa skilja mellan könshormoner kontra aktivitetsberoende mekanismerna bakom effekterna av genus parkoppling på antalet mitthjärnan DA nervceller vi anställda miljön anrikningsprotokoll (1,2), vilket bättre kontroller mot den potentiella påverkan av könshormoner och kanske också andra hormoner ( t.ex. feromoner, stress, reproduktion), och för den potentiella inverkan av afferenta drivna nervaktivitet. Den relevanta faktorn här är de olika grupperna var mycket mer lika i termer av kön (alla män), hormoner, social status och stress. Även social status och stress fortfarande kan skilja mellan grupper (t.ex. en mer dominant och aggressiv hanei en grupp), är det osannolikt detta alltid skulle vara samma grupp (t.ex. EE), och effekterna av EE har nu replike flera gånger 6. I EE, storleken på ökningen i mitthjärnan TH + neuroner var densamma som i den könshoppar protokollet (jämför män i figurerna 1 och 2 föreliggande studie, och Figurerna 1 & 2 i 6). Vidare EE-inducerad ökning av SNC TH + neuroner inducerad av miljöberikning var helt avskaffades genom samtidig blockad av mitthjärnan GABA A-receptorer (Figur 2 aktuella studien och figur 3 i 6), som ger cirka 70% av all afferenta input till mitthjärnan DA neuroner 25. Tillsammans har dessa data indikerar afferenta drivna neural aktivitet är minst lika potent inflytande över antalet mitthjärnan DA nervceller som hormoner.
Närmare inblick i miljö factors reglerar antalet mitthjärnan TH + nervceller kommer från jämförde effekterna av RW och EE. RW består av en väl lärt eller banal motorisk aktivitet (som körs på hjulen), medan EE består av en liknande mängd sådan aktivitet, om än med större variation (dvs. olika leksaker men oförändrad under de 14 dagar), plus löpande exponering för nya leksaker i SE-komponenten (1.2.4). Våra tidigare publicerade data 6 visade antingen ingen eller små ökningar i SNC och VTA TH + nervceller i RW jämfört med SH-möss, men mycket större ökningar i EE (+ SE) möss. Detta belyser sensorisk stimulering, kognition, nyhet och / eller inlärning och minne som mer potenta regulatorer av antalet mitthjärnan DA nervceller än banala fysisk aktivitet ensam.
EE har använts i stor utsträckning för att inducera terapeutiska effekter och förbättra hjärnans reparation i olika djurmodeller av sjukdomar i hjärnan såsom Alzheimers, Huntingtons och Parkinsons sjukdom 26. Den naning av sådana miljö manipulationer är att de varierar i stor utsträckning mellan laboratorier (som gör "standard-inrymt" villkor), men det finns viktiga aspekter av EE protokoll som är anmärkningsvärt och har varit tidigare diskuterade 27. EE ger ökad nyhet och komplexitet i förhållande till standard bostäder miljö, i syfte att öka nivåerna av sensorisk stimulering, kognitiv aktivitet och fysisk träning. Vid utformningen EE experiment, måste man överväga etologiska faktorer, bland annat de sensoriska och kognitiva förmågor hos djuren och deras instinktiva drifter. Som möss (och råttor) är nattdjur, med sämre visuella förmågor till människor men utmärkt somatosensoriska och lukt acuities bör anriknings objekten spegla medfödda instinkter och kapaciteten hos de försöksdjur. Därför är det nyhet, form, konsistens och lukt av de objekt som kan vara särskilt framträdande för möss. Bedömningar av den relativa styrkan hos gnagare "Motivationer för olika anriknings föremål har lett till rekommendationer för införande av tugg föremål att tillåta möjligheten att utöva grundläggande, art-typiska beteenden 28,29. Tillhandahållandet av bomaterial anses vara en grundläggande beståndsdel i anriknings protokoll och möss kommer instinktivt riva några föremål tillverkade av papper eller kartong, vilket ger möjlighet till sensoriska, kognitiva och motoriska aktiviteter 30,31. Det är viktigt också att i ett experiment med flera EE burar, motsvarande nyhet och komplexitet grupp är, för att minimera variansen inom EE gruppen, och liknande kontroll av miljöparametrar bör utövas för SH-gruppen. Helst bör antalet möss per bur vara samma mellan EE och SH-grupper (om inte effekterna av sociala gruppstorlek håller specifikt undersökts), och ingen "mat behandlar" bör användas i EE, eftersom några kost skillnader mellan grupperna kunde FÖRVÄXLA tHan tolkning av effekterna av den kognitiva aktivitet och motion som EE ökar 12. Andra viktiga faktorer är exponeringstiden för en berikad miljö och vid vilken ålder anrikning påbörjas. Även differentiell uttryck av gener har visats efter bara 3 timmar i en berikad miljö 32, kan längre perioder av exponering krävas för strukturella och funktionella förändringar inträffa 33,34. Vidare kan anrikning-inducerad plasticitet förbättras under postnatal kritiska utvecklingsperioder 35.
Osmotisk pump och hjärninfusionskanyl implantat för läkemedelsinfusioner
De osmotiska pump- och kanyl implantat är mycket effektiva för att leverera läkemedel direkt in i hjärnan. Med erfarenhet, tar implantatkirurgi ca 1 timme per mus. Dental akryl ensam är tillräcklig för att fixera kanylen på plats under längre perioder (Obs: Vi har gått upp till 28 dagar i other experiment); finns det inget behov av ytterligare fastsättningsanordning såsom benskruvar. Det är viktigt att se till att det finns gott om slack i röret som förbinder pumpen och kanylen för att möjliggöra maximal huvud och hals böjning utan att för mycket stress på anslutningarna. Detta är särskilt fallet för långfristiga infusioner, där tillväxten av bindväv runt pumpen kan förankra den på plats och därigenom minska flexibiliteten av implantatet. Om möjligt, möss är också enkel inrymt efter operation för att förhindra housemates skadar implantatet genom att skrapa, dra eller bita. Dosen av läkemedlet är till stor del bestäms av den mängd som tillsättes till pumpen. Men i detta avseende uppmärksamhet bör också ägnas åt pumpflödeshastighet, den kemiska stabiliteten av läkemedlet vid 37 ° C, och graden av diffusion av läkemedlet från kanylen genom hjärnan. För närvarande tillgängliga pumparna från vår leverantör kan upprätthålla infusion under upp till 6 veckor vid en flödeshastighet av 0,15 | il / h; den snabbaest tillgängliga flödeshastigheten är 10 pl / tim men varar bara 1 vecka. Längre infusionstider kan uppnås genom att utföra ytterligare mindre operationer för att ersätta utarmade pumpar med full pumpar på baksidan av anslutningsröret (dvs utan att störa den implanterade kanylen). Den rumsliga utsträckningen av metylenblått (1% metylenblått, MW 320, i 0,9% NaCl) diffusion från en kanylspets implanterad 0,3 mm över den vänstra SNC halvvägs längs dess mediolateral aspekt mättes för att sträcka sig från den laterala kanten av mitthjärnan till bara tvärs mittlinjen mediolaterally, och genom hela dorsoventral utsträckningen av mitthjärnan (efter två veckors infusion). Detta är mycket mer utbrett än en liten kärna som SNC, och spridningen av läkemedlet kan vara större (eller mindre) beroende på dess MW, kemisk stabilitet, buffring, etc. I själva verket kan man sluta sig från nuvarande uppgifter (Figur 2) som både pikrotoxin och bikukullin nådde kontra SNC i biologiskt aktiv concentrations.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
- Aumann, T., Horne, M. Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons. Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).
- Sauer, H., Oertel, W. H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience. 59, 401-415 (1994).
- Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat. The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).
- Aumann, T. D., et al. Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons. Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).
- Aumann, T. D., et al. SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta. Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).
- Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice. Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic Press. (2001).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).
- Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry. Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).
- Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).
- Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).
- Lie, D. C., et al. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).
- Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor. Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).
- Yoshimi, K., et al. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).
- Shan, X., et al. Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice. Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).
- Zhao, M., et al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).
- Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).
- Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion. Brain research. 339, 151-153 (1985).
- Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).
- Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).
- Richard, F., et al. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).
- Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).
- Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons. Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).
- Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 74, 858-873 (2012).
- Tepper, J. M., Lee, C. R. GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons. Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).
- Hannan, A. J. Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity. Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Chmiel, D. J., Noonan, M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).
- Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects. Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).
- Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).
- Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).
- Rampon, C., et al. Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).
- Eckert, M. J., Abraham, W. C. Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus. Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).
- Sztainberg, Y., Chen, A. An environmental enrichment model for mice. Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).
- Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy. Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).
