Abstract
Varige endringer i hjernen eller 'hjernens plastisitet' grunn for adaptiv atferd og hjerne reparasjon etter sykdom eller skade. Videre kan interaksjoner med miljøet vårt indusere hjernens plastisitet. I økende grad er forskning forsøker å identifisere hvilke miljøer stimulerer hjernens plastisitet gunstig for å behandle hjernen og atferdsforstyrrelser. To miljø manipulasjoner er beskrevet som øker eller reduserer antall tyrosinhydroksylase immunopositive (TH +, det hastighetsbegrensende enzym i dopamin (DA) syntese) nevroner i den voksne mus midthjernen. Den første består av sammenkoblingen mannlige og kvinnelige mus sammen sammenhengende i en uke, noe som øker midthjernen TH + nevroner med ca 12% hos menn, men reduserer midthjernen TH + nevroner med ca 12% hos kvinner. Den andre består av boliger mus kontinuerlig i to uker i 'beriket miljøer' (EE) som inneholder kjører hjul, leker, tau, reirmateriale, etc., som jegncreases midthjernen TH + nevroner med ca 14% hos menn. I tillegg er en protokoll som er beskrevet for samtidig infusjon av legemidler direkte inn i midthjernen under disse miljø manipulasjoner for å identifisere mekanismene bak miljømessig induserte hjerne plastisitet. For eksempel, er EE-induksjon av mer midthjernen TH + nevroner avskaffet ved samtidig blokade av synaptiske innspill på midthjernen nerveceller. Sammen utgjør disse dataene indikerer at informasjon om miljøet er videreformidlet via synaptic innspill til midthjernen nerveceller til å slå på eller av uttrykk for 'DA' gener. Dermed forsvarlig miljø stimulering, eller narkotika målretting av de underliggende mekanismene, kan være nyttig for behandling av hjernen og atferdsforstyrrelser forbundet med ubalanser i midthjernen DA (f.eks Parkinsons sykdom, oppmerksomhetssvikt og hyperaktivitet, schizofreni, og narkotikaavhengighet).
Introduction
DArgic signalering av nevroner i ventral tegmentale området (VTA) og substantia nigra pars comp (SNC) av midthjernen er tenkt å være viktig for belønning-motivert kognitive, emosjonelle og motoriske atferd. Men for mye eller for lite midthjernen DA signalering fører til mange invalidiserende symptomer i en rekke nevrologiske lidelser (f.eks Parkinsons sykdom, oppmerksomhetssvikt og hyperaktivitet lidelse, schizofreni, og narkotikaavhengighet). Legemidler som øker eller reduserer DA signale lindre disse symptomene, men de produserer også bivirkninger som skyldes feilregulert signale og off-target effekter. Legemidlets effekt avtar også over tid på grunn av kompenserende responser i hjernen. Utfordringen er derfor å gjenopprette normal midthjernen DA signalisering i en mer målrettet og fysiologisk måte, og et yndet tilnærming er ved å øke eller redusere antall midthjernen DA nevroner.
Bevis har vært samler for sevtater tiår at uttrykket av gener og proteiner som er involvert i metabolizing og trafficking DA og andre katekolaminer i modne voksne celler er modifiserbar (anmeldt i 1). I midthjernen, synker antall tyrosinhydroksylase immunopositive (TH +, det hastighetsbegrensende enzym i DA syntese) nevroner deretter øker etter neurotoxin administrasjon 2,3, mens antall TH immunonegative (TH-) nevroner viser motsatt mønster (dvs. opp- deretter avtar 3). Dette er konsistent med tap så få av "DA-fenotypen 'av enkelte celler. Antallet TH + jern og gjengetappholder SNC neuroner har også vist seg å endre seg i like, men motsatte retninger etter forskjellige behandlinger som endrer den elektriske aktiviteten i disse cellene 4,5. For eksempel infusjon av små-konduktans, kalsiumaktiverte kalium- (SK) kanal antagonist apamin inn i midthjernen i 2 uker reduserer antallet TH + og øker (med samme beløp) Number av TH- SNC nevroner 4,5. I motsetning til dette infusjon av SK-kanal-agonist 1-EBIO øker antallet TH + og avtar (med samme beløp) antall TH- SNC neuroner 4,5. Tilsvarende endringer ble sett etter en rekke behandlinger rettet mot SNC neuronal aktivitet, inkludert noen som målrettet afferente innganger 4. Denne åpenbare regulering av antall SNC DArgic neuroner ved neuronal aktivitet og afferent inngang øker muligheten for at miljøet eller oppførsel kan påvirke antallet SNC neuroner. Faktisk voksne mus eksponert for forskjellige miljøer har mer eller mindre midthjernen (SNC og VTA) TH + neuroner, og minst noen av disse miljøinduserte endringer oppheves ved samtidig blokade av synaptisk inngang i midthjernen 6. Målene med denne kommunikasjonen er å: (1) gi ytterligere detaljer om hvordan å gjennomføre våre miljø manipulasjoner og narkotika infusjoner; og (2) gi ytterligere data som støtter vår påstand at environment regulerer antall midthjernen DA nevroner, via afferent inngang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer på dyr ble godkjent av Florey Institute of Neuroscience og mental helse Animal etisk komité og i samsvar med Australias National Health and Medical Research Council publisert anbefaling for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål (7 th edition, 2004).
1. Miljø manipulasjoner
- Kjønn Paring
- Bruk kjønnsmoden (> 8 uker gammel), alder-matchet mannlige og kvinnelige mus.
MERK: Vi bruker vanligvis C57BL / 6 mus, men har hatt de samme resultater med Swiss mus i denne protokollen. Vi bruker vanligvis n = 8 menn og n = 8 hunner for hvert eksperiment, oppdelt i n = 2 hann hann-parene (n = 4 hanner), n = 2-hunn parene (n = 4 hunner) og n = 4 hann-kvinne par (n = 4 hanner og n = 4 tisper). - Ved ankomst i dyret holding anlegget, gruppe-huset musene etter kjønn for> tre dager å akklimatisere. Her og througHout kjønns sammenkobling, holde uvedkommende miljømessige stimuli (f.eks omgivelsestemperatur, lys: mørke syklus, mat, vann, håndtering og rengjøring) konstant eller fordele likt for alle mus.
- Tilfeldig tildele hver mus til en manns mannlig par, en hunn-kvinne par, eller en mannlig-kvinnelig par. Plassere hvert par i en ren merd i isolasjon (2 mus / bur) med ad libitum tilgang til mat og vann, og bare huse dem på denne måte kontinuerlig i 7 dager.
MERK: Rutine husdyrhold er OK i denne perioden, men må fordeles likt til alle mus. Ta vare å unngå sammenkobling av mannlige og kvinnelige kullsøsken.
- Bruk kjønnsmoden (> 8 uker gammel), alder-matchet mannlige og kvinnelige mus.
- Miljø Enrichment
- Bruk kjønnsmodne (> 8 uker gammel), alderstilpassede mannlige eller kvinnelige mus.
MERK: Vi bruker vanligvis n = 18 mus for hvert forsøk, fordelt på n = 6 / behandlingsgruppen. - Ved ankomst i dyret holding anlegget holde dem gruppe ligger i identisk standard plassert (SH) (f.eks (for eksempel omgivelsestemperatur, lys: mørke syklus, mat, vann, håndtering og rensing) konstant eller fordele likt til alle mus.
- Til å begynne miljøberikelse, tilfeldig tilordne hver mus til en av tre grupper: SH; kjører hjulet (RW), eller miljø beriket (EE) og plassere hver gruppe mus sammen til en identisk rent bur med ad libitum tilgang til mat og vann.
MERK: Her, større rotte-holding bur for alle grupper, som måler 27 cm bred, 42 cm lang og 16 cm dype ble brukt.- I tillegg gir de følgende miljøforhold til hver gruppe: SH som omfatter bare søppel (papir pellets eller sagflis) på gulvet; RW bestående SH pluss to løpehjul; EE bestående RW pluss leker (tau, stiger, tunneler, og objekter som tomme tørkepapir ruller og biter av silkepapir) som til explore, leke, klatre, gjemme seg, og hekker.
- Huse dem på denne måte kontinuerlig i 14 dager.
MERK: Rutine husdyrhold er OK i denne perioden, men må fordeles likt til alle mus.
- Lagt EE-mus til ekstra "super-berikelse" (SE) ved å plassere dem sammen til et større bur som inneholder nye leker for 1 time / dag (samme time hver dag), 5 dager / uke.
MERK: Her ble en 46 cm bred, 69 cm lang, og 40 cm dyp plast badekar brukes.- Opprettholde nyhet ved å presentere et annet sett med leker hver økt. Rene leker som skal re-presentert for mus med såpevann og 80% etanol for å fjerne luktene.
- Etter hvert SE økt, returnere musene til deres EE bur. Håndtaket SH og RW mus den samme som SE mus (bortsett SE seg selv) i hele denne perioden (f.eks fjerne og tilbake hver SH og RW mus fra og til buret sitt).
- Bruk kjønnsmodne (> 8 uker gammel), alderstilpassede mannlige eller kvinnelige mus.
- Forberedelse
- Bruk sterile osmotiske pumper og hjerneinfusjonssett, som er tilgjengelig kommersielt. Dagen før implantasjon, ved bruk av aseptisk teknikk, prime implantater ved å fylle hver pumpe, kobler rør og kanyle med sterilt legemiddel eller kjøretøy løsning (som beskrevet i instruksjonene som følger med pumpene). Koble dem sammen og inkuberes i sterilt saltvann over natten ved 37 ° C. Ruge narkotika og kjøretøy fylt implantater separat for å unngå krysskontaminering.
- Kirurgi.
MERK: Avhengig av hvilket land eksperimentator, er spesielle dyr eksperimentering tillatelser eller kvoter kreves for å forfølge slike typer kirurgi og postoperative eksperimenter.- Sterilisere all kirurgisk utstyr og ansette aseptisk teknikk hele. Bedøve en mus (f.eks ved hjelp av 1-2% isofluorane i luften) og plassere den i en stereotaxic headframe. Kontroller anestesidybden gjennom prosedyren og administrere ytterligere bedøvelsesmiddel som er nødvendig (for eksempel fravær av lem uttak til skadelige pote klype er indikativ for adekvat anestesi). Sørg for øynene er beskyttet mot uttørking av smøremiddel øye salve, og at musen kroppstemperatur forblir normal gjennom hele prosedyren.
- Lag en midtlinjen snitt gjennom huden fra mellom øynene og etterbehandling 2 cm posterior i bakkant av skallen. Blunt dissekere huden bort fra den underliggende fascia ned på baksiden av musen for å skape en subkutan lomme dannes store nok til å passe komfortabelt i pumpen og forbindelsesrøret når kanylen er implantert (forbindelsesrøret bør ikke være bøyd ved gjennomføring). Skrape fjerne fascia fra over dorsal del av hodeskallen.
- Ved hjelp av en 1,5 mm diameter dental Burr, bore ned i skallen på riktig stereotaxic koordinater until et tynt, fleksibelt lag av beinrester. Peel dette laget unna ved hjelp fine tang (dette unngår å skade den underliggende dura mater og hjerne med tann Burr). Sikre skallen er renset av blod- og bein fragmenter, og at det ikke er ytterligere blødning.
- Med kanylen holdt av en kanyle holder, plasser pumpen og koble slangen inn i subkutan "lomme" liggende musens tilbake. Deretter plasserer spissen av kanylen på de hensiktsmessige stereotaksiske koordinater og på overflaten av hjernen. Senk kanylen inn i hjernen, men stopper ca 1 mm kort av den nødvendige dybden.
MERK: De resterende dybde vil bli forhandlet etter påføring av det første laget av dental akryl. - Sikre igjen overflaten av skallen er ren og tørr, og deretter utarbeide et lite volum av dental akryl og bruker en tannpirker til å glatte over det hele eksponert område av skallen, inkludert inn i Burr-hull gjennom skallen rundt the kanyle. Før akryl stivner, senke kanylen tippe de resterende dybde inn i målet.
- Tilbered en annen lite volum av dental akryl og dette lag over det første, så vel som over den hvite plast støtte for kanylen, for å feste kanylen på plass. Gjenta med flere lag med akryl som er nødvendig.
- Når akryl har herdet, fjern forsiktig kanyleholderen og kuttet av den hvite plast avtagbar kanyle fane ved hjelp av en skalpell blad oppvarmet med en butan flamme. Endelig sutur huden lukket over hele implantatet.
- Post-kirurgisk behandling av dyr
- Påfør antiseptisk salve på huden marginer, og administrere en anti-inflammatorisk til musen (f.eks Meloksikam, 3 mg / kg sc). Fjern musen fra rammen, plasserer det under en varmelampe, og observere til det gjenvinner bevisstheten. Ikke returnere en mus som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert.
MERK: Experimental manipulasjoner som kjønn sammenkobling og miljø berikelse kan igangsettes eller gjenopptatt dagen etter operasjonen tidligst. - Overvåke deres kroppsvekt, generell oppførsel og utseende daglig. Behandle tegn på infeksjon (f.eks hevelse, rødhet, puss) rundt kirurgiske snitt med aktuell antiseptisk salve. Behandle noen tegn sykdom, smerte, stress eller ubehag (f.eks tap av> 10% av kroppsvekten, sosial tilbaketrekning, mangel på stell, "fluffing", bevegelse dysfunksjon, kramper) med systemiske analgetika og / eller antibiotika som nødvendig.
- Avlive mus hvis> 15% vekttap eller symptomer på sykdom, smerte, stress eller ubehag er uopprettelige innen 1 uke utbedrings behandling.
- Påfør antiseptisk salve på huden marginer, og administrere en anti-inflammatorisk til musen (f.eks Meloksikam, 3 mg / kg sc). Fjern musen fra rammen, plasserer det under en varmelampe, og observere til det gjenvinner bevisstheten. Ikke returnere en mus som har gjennomgått kirurgi til selskap med andre dyr før fullt restituert.
3. Brain Vevspreoarerlng, Immunhistokjemisk Processing, og Stereology
- Perfusjon
- Umiddelbart etter miljø / narkotika manipulasjoner, forberede hjernen for studien.
- Administrere først en overdose bedøvelse for å drepe mus (f.eks 100 mg / kg ip natriumpentobarbiton). Når bedøvet men før hjertet slutter å slå, lå musen på ryggen og slips eller peke ut begge forbein.
- Ved hjelp av en skalpell skåret bort huden som ligger over brystkassen og et langsgående snitt gjennom muskelen like nedenfor brystkassen inn i bukhulen. Plasser en klemme på xifoid prosessen av brystkasse og løfter brystkassen opp og bort fra leveren utsette membranen.
- Skjær gjennom membranen og gjennom ribbeina lateralt på begge sider ved hjelp av store saks inntil brystkasse kan brettes tilbake over hodet for å utsette lungene og hjertet. Ved hjelp av gode saks lage et lite snitt i høyre atrium som en utgang for blod og perfuserte løsninger, deretter skjære gjennom bunnen av venstre ventricle og plassere en kanyle opp gjennom venstre hjertekammer, venstre atrium, og inn i aorta.
- Klem av kanylen på plass og deretter pumpe varm (37 ° C) heparinisert og 0,1 M fosfat-bufret fysiologisk saltvann (PBS) inn i vaskulaturen til løsningen som kommer ut av høyre atrium er helt fri for blod. Deretter pumpe kaldt (4 ° C) fikserløsning (for eksempel 4% paraformaldehyd i PBS) gjennom vaskulaturen inntil hele mus er godt festet. Fjern hjernen og plasser i PBS med 30% sukrose i 2-3 dager før hjernen synker.
MERK: Andre typer vev forberedelse kan brukes avhengig av kompetanse i tilsvarende laboratorium.
- Umiddelbart etter miljø / narkotika manipulasjoner, forberede hjernen for studien.
- Utarbeidelse av frittflytende frysesnitt
- Skjær seriesnitt gjennom hjernen regioner av interesse og samle disse i PBS.
MERK: Vi kuttet 40 mikrometer tykke seksjoner ved hjelp av en kryostat. Andre typer vev seksjonering kan brukes avhengig av kompetanse på tilsvarende krng laboratorium.
- Skjær seriesnitt gjennom hjernen regioner av interesse og samle disse i PBS.
- Immunhistokjemi
- Utføre standard immunhistokjemi for proteiner av interesse. Inkuber seksjoner i 5% normalt geiteserum og 0,3% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur i 30 minutter, og deretter reagere immunologisk med polyklonalt kanin-anti-TH (1: 400) ved 4 ° C i 48 timer, deretter biotinylert polyklonalt geit anti -kanin (1: 1000) ved romtemperatur i 2 timer.
- Deretter inkuberes i avidin-peroksidase (1: 500) ved romtemperatur i 1 time, deretter i kobolt og nikkel-forsterket diamino-benzidin (0,5 mg / ml) ved romtemperatur i 18 til 20 min; for de siste 3-5 min av diamino-benzidin inkubasjon legge hydrogenperoksyd (0,01%) for å katalysere chromagen utfelling. Vask seksjoner tre ganger i 10 minutter hver i PBS før, etter, og mellom hver av de ovennevnte trinn.
- Monter delene på gelatinobjektglass, luft tørke dem, så Nissl flekken (nøytral rød), dehydrerer i alkohol, klart (X-3B), og dekkglass.
- Anslå den totale antallet TH + jern og gjengetappholder SNC (og VTA og LC) nevroner ved bruk av objektive stereological metoder. Kontroller at stereologist er blind for den behandlingen de hadde fått. Ekskludere gliaceller på grunnlag av soma diameter <5 um, og telle bare de celler med en synlig kjerne.
- Identifisere SNC (og VTA og LC) av de romlige plasseringen av TH + celler og anatomiske landemerker / grenser i henhold til hjerne atlas av Paxinos og Watson 7. Count TH + celler i en telleramme (55 x 55 um = 3,025 um 2) med jevne forhåndsbestemte intervaller (x = 140 nm, y = 140 um for SNC, x = 100 nm, y = 100 um for VTA og LC) gjennom hver kjerne i hver fjerde avsnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne mus utsatt for disse miljø manipulasjoner har endret antall midthjernen (SNC og VTA), men ikke LC, TH + nevroner, og EE pluss samtidig midthjernen infusjon av enten pikrotoksin eller bicuculline (GABA A-reseptorantagonister) opphever EE-induksjon av mer SNC TH + nevroner. Disse dataene ble tidligere publisert i seks. De nåværende Dataene ble samlet i replikere eksperimenter utført som en del av det tidligere studie, men har ikke blitt offentliggjort andre steder.
Spesielt voksne mannlige mus som har blitt sammenkoblet med voksne hunnmus har mer TH + SNC og VTA (midthjernen) nevroner enn menn forbundet med menn, mens kvinner forbundet med menn har færre TH + SNC og VTA nevroner enn hunnene forbundet med kvinner (figur 1 i 6). Et annet eksempel på dette er gitt her i figur 1, som viser gjennomsnitt ± SE antall TH + SNC nevroner i mannlige og kvinnelige mus umiddelbart following kjønn sammenkobling. Hanner forbundet med kvinner i 7 dager har ca 12% flere TH + SNC nevroner enn menn forbundet med menn (to blå søyler i Figur 1). I motsetning kvinner forbundet med menn har om lag 12% færre TH + SNC nevroner enn kvinner forbundet med kvinner (to røde søyler i Figur 1).
Antallet TH + SNC og VTA neuroner øker også i voksne mannlige mus underlagt EE (figur 2 i 6), og EE-induksjon av flere SNC TH + neuroner oppheves ved samtidig blokade av midthjernen GABAA-reseptorer (figur 3 i 6). Et annet eksempel på dette er gitt her i figur 2, hvor EE med kjøretøy infusjon resulterte i ca 14% flere TH + SNC nevroner enn SH med kjøretøy infusjon (venstre to kolonner i figur 2). Imidlertid, EE med GABA A reseptor-antagonist infusjon (enten 10 pM pikrotoksin eller 51; M bicuculline) fullstendig avskaffet denne økningen (høyre to kolonner i figur 2). Merk deg at disse dataene er fra SNC kontralateral til infusjonskanyle, og er nesten identisk med de effektene som observeres i den ipsilaterale SNC som ble rapportert i seks.
Figur 1:. Effekter av kjønn sammenkobling på antall SNC TH + nevroner Umiddelbart etter 7 dager med kjønn sammenkobling (protokoll 1.1) voksne mus ble dynket (3.1), ble deres midthjernen seksjonert (3.2), ble seksjonene behandlet for tyrosinhydroksylase (TH , det hastighetsbegrensende enzym i DA syntese) immunhistokjemi (3.3), og antallet TH + SNC nevronene ble estimert ved hjelp stereology (3.4). Plottet her er gjennomsnitt ± SE antall SNC TH + nevroner i hannmus paret med hannmus (n = 4 hannmus fra n = 2 manns mannlig par, lys blå colUMN), hanner sammen med kvinner (n = 6 hannmus fra 6 manns kvinnelige par, mørk blå kolonne), kvinner forbundet med kvinner (n = 8 hunnmus fra n = 4 kvinne-kvinne par, lys rød kolonne), og hunner forbundet med menn (n = 6 hunnmus fra n = 6 mann-kvinne par, mørk rød kolonne). Sammenkobling med det motsatte kjønn resulterte i en økning i antall SNC TH + nevroner hos menn, men en nedgang i antall SNC TH + nevroner hos kvinner (p <0,001 Enveis ANOVA; * p <0,05 Tukey parvise multiple sammenligninger).
Figur 2: Effekt av miljøet anrikning med midthjernen GABA A reseptor blokade av antallet TH + neuroner SNC Umiddelbart Etter 14 dagers miljø anrikning (protokoll 1.2) ved samtidig infusjon av enten bærer, GABA A reseptor-antagonist s.icrotoxin (10 uM), eller GABA A reseptor-antagonist bicucullin (5 uM) i den venstre midthjernen (fremgangsmåte 2), ble voksne hannmus perfusert (3.1), deres midthjernen seksjonert (3.2), ble delene behandlet for tyrosin hydroksylase ( TH, det hastighetsbegrensende enzym i DA syntese) immunhistokjemi (3.3), og antallet TH + nevroner i høyre (motsatt) SNC ble estimert ved hjelp stereology (3.4). Plottet her er gjennomsnitt ± SE antall SNC TH + nevroner i standard plassert (SH) hannmus med kjøretøy infusjon (n = 6, lys blå søyle), miljø beriket (EE) hanner med kjøretøy infusjon (n = 6 første mørk blå kolonne), menn med pikrotoksin infusjon (n = 6, andre mørk blå søyle), og EE-hanner med bicuculline infusjon (n = 6 tredje mørk blå søyle) EE. EE resulterte i en økning i antall SNC TH + nevroner, men dette ble avskaffet ved infusjon av pikrotoksin eller bicuculline inn kontralaterale midthjernen (p <0,001 Enveis ANOVA; * P <0,001 Tukey parvise multiple sammenligninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Miljø manipulasjoner
Motivasjonen bak utformingen av disse miljø manipulasjoner (kjønn sammenkobling og miljø berikelse) var å avgjøre om miljøet, og / eller oppførsel bedt av miljøet, er assosiert med endringer i antall midthjernen DA nevroner. Fokuset var derfor på å gi miljøer og stimulere atferd som er egnet til å engasjere midthjernen DA signalering. Disse inkluderte sammenkobling med det motsatte kjønn, og miljøberikelse bestående tilgang til å kjøre hjul, tau, stiger, tunneler, og objekter til å utforske, leke, klatre, gjemme seg, og hekker. Begge disse miljøene burde fremme belønning-motivert kognitive, emosjonelle og motoriske atferd, noe som har vært forbundet med akutte økninger i midthjernen DA neuronal utslipp og DA frigjøring (f.eks 8). Vår hypotese var at de er også assosiert med mer holdbare endringer i midthjernen DA signale brburde om endringer i antall midthjernen DA nevroner. Her og andre steder 6, er bevisene presentert at dette faktisk er tilfelle.
Våre undersøkelser begynte å bruke kjønns sammenkobling protokollen (1.1) fordi det består av en kjerne primal og viktig belønning-motivert atferd (dvs. copulation). Dessuten er reproduktiv, par-binding, og sosial atferd kjent for å indusere analoge endringer i andre nevrokjemiske systemer (f.eks endringer i tetthet av oxytocin, vasopressin og Corticotrophin-frigjørende hormon celler i hypothalamus 9). Faktisk, etter syv dager med sammenhengende sammenkobling med det motsatte kjønn, viser vi her og andre steder 6 at menn har om lag 10% mer TH + midthjernen nevroner, mens kvinner har ca 10% færre TH + midthjernen nevroner [Merk: Disse effektene omfatter SNC (denne studien og 6) og VTA 6, men ikke i locus coeruleus 6, hvor TH hjelper syntetisere noradrenalin].Dette underbygger at antall midthjernen DA nevroner i den voksne hjernen ikke er fast, men endringer avhengig av miljø, atferd, eller miljø / atferds interaksjoner. Andre bevis argumenterer disse endringene er forårsaket av endringer i uttrykk av TH-genet og protein i de eksisterende midthjernen nevroner, i motsetning til DA neurogenesis eller degenerasjon. (1) DA nevrogenesen i voksen musehjernen skjer enten ikke i det hele tatt 10 til 14, eller ved hastigheter vesentlig lavere enn det som kan gjøre rede for tilsetning av ca. 500 nye SNC DA nevroner i en uke 15,16. (2) Studier kvantifisere endringer i antall SNC nevroner følgende 2 ukers infusjoner av ulike medikamenter rettet mot den elektriske aktiviteten i midthjernen nevroner har konsekvent avslørte like (igjen ca 10%), men motsatte endringer TH + jern og gjengetappholder celler, noe som resulterer i ingen netto endring i det totale celletallet 4,5. Dette er konsistent med regulering av TH protein nivåer over eller under immunohistochemically Fondetectable nivåer uten tillegg eller subtraksjon av nerveceller. (3) Mange studier har rapportert aktivitetsavhengige endringer i TH gen og protein uttrykk i cellene enn en tidsskala på flere timer 17-23, og det samme har blitt rapportert i midthjernen 4.
Spørsmålet dermed oppstår hva er mekanismene bak endringer i uttrykk av TH-genet og protein i de eksisterende midthjernen nerveceller. Mulighetene inkluderer kjønnshormoner, som kan ligger til grunn både baseline forskjeller i antall TH + midthjernen nevroner hos menn og kvinner, samt kjønnsspesifikke endringer (økninger i hanner og avtar hos kvinner) etter paring rapportert her og tidligere seks. En annen mulighet er aktiviteten avhengig regulering av TH ekspresjon. SNC og VTA nevroner (både DA og ikke-DA) mottar synaptiske innspill hovedsakelig fra striatum, hypothalamus, subthalamic kjernen, og frontal cortex 24. I sammenheng med kjønn sammenkobling, disse inngangenekunne være regulert av sensorisk-oppførsel, luktesans, feromoner, stress, stoffskifte, eller reproduksjon. Aktivitet avhengig regulering av TH ekspresjon kunne være formidlet via kalsium- eller neuropeptid signalveier som påvirker gen og protein ekspresjon (for eksempel 1).
Å bidra til å skille mellom sex steroid versus aktivitetsavhengige mekanismene bak effekten av kjønn sammenkobling på antall midthjernen DA nevroner vi ansatt miljøet berikelse protokollen (1.2), som bedre kontroller mot den potensielle påvirkning av kjønnshormoner og kanskje også andre hormoner ( f.eks feromoner, stress, reproduksjon), og for mulig påvirkning av afferent drevet neuronal aktivitet. Den relevant faktor her er de ulike gruppene var mye mer like med hensyn til kjønn (alle menn), hormoner, sosial status og stress. Selv om sosial status og stress kan likevel variere mellom grupper (f.eks en mer dominant og aggressiv manni en gruppe), er det lite sannsynlig at dette ville alltid være den samme gruppen (f.eks EE), og effektene av EE har nå blitt kopiert flere ganger 6. I EE, størrelsen av økningen i midthjernen TH + neuroner var den samme som i den kjønns sammenkobling protokoll (sammenlign hanner i figurene 1 og 2 foreliggende studie, og figurene 1 og 2 i 6). Videre EE-indusert økning i SNC TH + neuroner indusert av miljø anrikning ble fullstendig opphevet ved samtidig blokade av midthjernen GABAA-reseptorer (figur 2 foreliggende studie, og figur 3 i 6), som gir ca. 70% av alt afferente inngang til midthjernen DA nevroner 25. Sammen indikerer disse data afferent nevral aktivitet drevet er minst like sterk innflytelse på det antall midthjernen DA-nevroner som hormoner.
Ytterligere innsikt i miljø factors regulerer antallet midthjernen TH + neuroner kommer fra å sammenligne virkningene av RW og EE. RW omfatter en godt lært eller banale motorisk aktivitet (som kjøres på hjulene), mens EE omfatter en tilsvarende mengde av en slik aktivitet, om enn i større variasjon (dvs. forskjellige leker, men uforandret i løpet av de 14 dager), i tillegg til kontinuerlig eksponering for nye leketøy i SE komponent (1.2.4). Våre tidligere publiserte data 6 avslørt enten ingen eller små økninger i SNC og VTA TH + nevroner i RW forhold til SH mus, men mye større økninger i EE (+ SE) mus. Dette understreker sansestimulering, kognisjon, nyhet og / eller læring og hukommelse som mer potente regulatorer av antall midthjernen DA nevroner enn banal fysisk aktivitet alene.
EE har vært brukt mye til å indusere terapeutiske effekter og forbedre hjernen reparasjon i ulike dyremodeller av hjernen lidelser som Alzheimers, Huntingtons og Parkinsons sykdom 26. Den nature av slike miljø manipulasjoner er at de varierer i stor grad mellom laboratorier (som gjør 'standard-huset' forhold), men det er viktige aspekter av EE-protokoller som er verdt å merke seg, og har vært tidligere omtalte 27. EE gir økt miljø nyhet og kompleksitet i forhold til standard bolig, slik som å forbedre nivåer av sansestimulering, kognitiv aktivitet og fysisk trening. I utformingen EE eksperimenter, må man vurdere etologiske faktorer, inkludert de sensoriske og kognitive evner av dyr og deres instinktive stasjoner. Som mus (og rotter) er nattaktive, med dårligere visuelle evner til mennesker, men utmerket somatosensoriske og olfactory acuities bør berikelse gjenstander reflektere de medfødte instinkter og kapasiteter for forsøksdyr. Derfor er det nyheten, form, tekstur og lukt av objektene som kan være spesielt fremtredende til mus. Vurderinger av den relative styrken av gnagere 'motisjoner for en rekke berikelse gjenstander har ført til anbefalinger for inkludering av tygge objekter for å tillate muligheten til å utøve grunnleggende, arts typiske atferd 28,29. Bestemmelsen av reirmateriale anses å være en grunnleggende del av den berikelse protokollen og mus vil instinktivt rive gjenstander laget av papir eller papp, og dermed gi mulighet for sensoriske, kognitive og motoriske aktiviteter 30,31. Det er viktig også at i et eksperiment med flere EE-bur, tilsvarende nyhet og kompleksitet av objekter er gitt, for å minimere variansen i EE-gruppen, og lignende kontroll av miljøparametre bør utvises for SH-gruppen. Ideelt sett bør antallet mus per bur være den samme mellom EE og SH grupper (med mindre effekten av sosial gruppestørrelse blir spesielt undersøkt), og ingen "mat godbiter 'bør brukes i EE, som noen kosttilskudd forskjeller mellom gruppene kunne forvirre tHan tolkning av virkningene av kognitiv aktivitet og fysisk trening som EE forsterker 12. Andre viktige hensyn er varigheten av eksponering for et beriket miljø og ved hvilken alder berikelse starter. Mens differensial uttrykket av gener har vist seg etter bare tre timer i en beriket miljø 32, kan lengre perioder av eksponering være nødvendig for strukturelle og funksjonelle endringer å skje 33,34. Videre kan berikelse-indusert plastisitet bli styrket i løpet av postnatal kritiske utviklings perioder 35.
Osmotiske pumpe og hjerne infusjonskanyle implantater for narkotika infusjoner
De osmotisk pumpe og kanyle implantater er meget effektive for avgivelse av legemidler direkte inn i hjernen. Med erfaring, tar implantat kirurgi ca 1 time per mus. Dental akryl alene er tilstrekkelig til å fikse kanylen på plass for lengre perioder (Merk: Vi har gått opp til 28 dager i other eksperimenter); det er ikke behov for ekstra feste maskinvare som bein skruer. Det er viktig å sikre at det er nok av slakk i røret som forbinder pumpen og kanylen for å tillate maksimal hode og nakke fleksjon uten å legge for mye stress på tilkoblingene. Dette er særlig tilfellet for langsiktige infusjoner, hvor vekst av bindevev rundt pumpen kan forankre den på plass og derved reduserer fleksibiliteten av implantatet. Der det er mulig, mus er også single-huset etter operasjonen for å hindre deltagerne skadelige implantatet gjennom skrape, trekke eller biting. Dosen av stoffet er i stor grad bestemt av mengden lagt til pumpen. Men i denne henseende oppmerksomhet bør også tas hensyn til pumpestrømningshastighet, den kjemiske stabilitet av medikamentet ved 37 ° C, og hastigheten for diffusjon av medikament fra kanylen gjennom hjernen. For tiden tilgjengelige pumper fra vår leverandør kan opprettholde infusjon i opptil seks uker med en strømningsrate på 0,15 mL / t; den raskeest tilgjengelig flow-rate er 10 pl / t, men som varer i bare en uke. Lengre infusjonstider kan oppnås ved å utføre flere mindre operasjoner for å erstatte utarmet pumper med full pumper på baksiden av forbindelsesrøret (dvs. uten å forstyrre den implanterte kanyle). Den romlige utstrekning av metylenblått (1% metylenblått, MW 320, i 0,9% NaCl) diffusjon fra en kanyle spiss implantert 0,3 mm over den venstre SNC midtveis langs sin mediolateral aspekt ble målt til å strekke seg fra den laterale kant av midthjernen til bare over midtlinjen mediolaterally, og gjennom hele dorsoventral grad av mellomhjernen (etter 2 uker med infusjon). Dette er mye mer omfattende enn en liten kjerne som SNC, og spredning av medikamentet kan være større (eller mindre), avhengig av sin MW, kjemisk stabilitet, bufring, etc. Faktisk kan man utlede fra de foreliggende data (figur 2) som både pikrotoksin og bicuculline nådd kontralaterale SNC i biologisk aktiv concentrations.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
- Aumann, T., Horne, M. Activity-dependent regulation of the dopamine phenotype in substantia nigra neurons. Journal of neurochemistry. 121, 497-515 (2012).
- Sauer, H., Oertel, W. H. Progressive degeneration of nigrostriatal dopamine neurons following intrastriatal terminal lesions with 6-hydroxydopamine: a combined retrograde tracing and immunocytochemical study in the rat. Neuroscience. 59, 401-415 (1994).
- Stanic, D., Finkelstein, D. I., Bourke, D. W., Drago, J., Horne, M. K. Timecourse of striatal re-innervation following lesions of dopaminergic SNpc neurons of the rat. The European journal of neuroscience. 18, 1175-1188 (2003).
- Aumann, T. D., et al. Neuronal activity regulates expression of tyrosine hydroxylase in adult mouse substantia nigra pars compacta neurons. Journal of neurochemistry. 116, 646-658 (2011).
- Aumann, T. D., et al. SK channel function regulates the dopamine phenotype of neurons in the substantia nigra pars compacta. Experimental neurology. 213, 419-430 (2008).
- Aumann, T. D., Tomas, D., Horne, M. K. Environmental and behavioral modulation of the number of substantia nigra dopamine neurons in adult mice. Brain and behavior. 3, 617-625 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , 2nd, Academic Press. (2001).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends in neurosciences. 30, 203-210 (2007).
- Sun, P., Smith, A. S., Lei, K., Liu, Y., Wang, Z. Breaking bonds in male prairie vole: long-term effects on emotional and social behavior, physiology, and neurochemistry. Behavioural brain research. 265, 22-31 (2014).
- Aponso, P. M., Faull, R. L., Connor, B. Increased progenitor cell proliferation and astrogenesis in the partial progressive 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. Neuroscience. 151, 1142-1153 (2008).
- Frielingsdorf, H., Schwarz, K., Brundin, P., Mohapel, P. No evidence for new dopaminergic neurons in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10177-10182 (2004).
- Lie, D. C., et al. The adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6639-6649 (2002).
- Chen, Y., Ai, Y., Slevin, J. R., Maley, B. E., Gash, D. M. Progenitor proliferation in the adult hippocampus and substantia nigra induced by glial cell line-derived neurotrophic factor. Experimental neurology. 196, 87-95 (2005).
- Yoshimi, K., et al. Possibility for neurogenesis in substantia nigra of parkinsonian brain. Ann Neurol. 58, 31-40 (2005).
- Shan, X., et al. Enhanced de novo neurogenesis and dopaminergic neurogenesis in the substantia nigra of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced Parkinson's disease-like mice. Stem Cells. 24, 1280-1287 (2006).
- Zhao, M., et al. Evidence for neurogenesis in the adult mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7925-7930 (2003).
- Baker, H., Kawano, T., Margolis, F. L., Joh, T. H. Transneuronal regulation of tyrosine hydroxylase expression in olfactory bulb of mouse and rat. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 3, 69-78 (1983).
- Black, I. B., Chikaraishi, D. M., Lewis, E. J. Trans-synaptic increase in RNA coding for tyrosine hydroxylase in a rat sympathetic ganglion. Brain research. 339, 151-153 (1985).
- Zigmond, R. E., Chalazonitis, A., Joh, T. Preganglionic nerve stimulation increases the amount of tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 20, 61-65 (1980).
- Biguet, N. F., Rittenhouse, A. R., Mallet, J., Zigmond, R. E. Preganglionic nerve stimulation increases mRNA levels for tyrosine hydroxylase in the rat superior cervical ganglion. Neuroscience letters. 104, 189-194 (1989).
- Richard, F., et al. Modulation of tyrosine hydroxylase gene expression in rat brain and adrenals by exposure to cold. Journal of neuroscience research. 20, 32-37 (1988).
- Schalling, M., Stieg, P. E., Lindquist, C., Goldstein, M., Hokfelt, T. Rapid increase in enzyme and peptide mRNA in sympathetic ganglia after electrical stimulation in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4302-4305 (1989).
- Liaw, J. J., He, J. R., Barraclough, C. A. Temporal changes in tyrosine hydroxylase mRNA levels in A1, A2 and locus ceruleus neurons following electrical stimulation of A1 noradrenergic neurons. Brain research. Molecular brain research. 13, 171-174 (1992).
- Watabe-Uchida, M., Zhu, L., Ogawa, S. K., Vamanrao, A., Uchida, N. Whole-brain mapping of direct inputs to midbrain dopamine neurons. Neuron. 74, 858-873 (2012).
- Tepper, J. M., Lee, C. R. GABAergic control of substantia nigra dopaminergic neurons. Progress in brain research. 160, 189-208 (2007).
- Hannan, A. J. Environmental enrichment and brain repair: harnessing the therapeutic effects of cognitive stimulation and physical activity to enhance experience-dependent plasticity. Neuropathology and applied neurobiology. 40, 13-25 (2014).
- Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system. Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).
- Chmiel, D. J., Noonan, M. Preference of laboratory rats for potentially enriching stimulus objects. Laboratory animals. 30, 97-101 (1996).
- Hanmer, L. A., Riddell, P. M., Williams, C. M. Using a runway paradigm to assess the relative strength of rats' motivations for enrichment objects. Behavior research methods. 42, 517-524 (2010).
- Burrows, E. L., McOmish, C. E., Hannan, A. J. Gene-environment interactions and construct validity in preclinical models of psychiatric disorders. Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry. 35, 1376-1382 (2011).
- Van de Weerd, H. A., Van Loo, P. L. P., Van Zutphen, L. F. M., Koolhaas, J. M., Baumans, V. Strength of preference for nesting material as environmental enrichment for laboratory mice. Applied Animal Behaviour Science. 55, 369-382 (1998).
- Rampon, C., et al. Effects of environmental enrichment on gene expression in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 12880-12884 (2000).
- Eckert, M. J., Abraham, W. C. Effects of environmental enrichment exposure on synaptic transmission and plasticity in the hippocampus. Current topics in behavioral neurosciences. 15, 165-187 (2013).
- Sztainberg, Y., Chen, A. An environmental enrichment model for mice. Nature protocols. 5, 1535-1539 (2010).
- Sale, A., Berardi, N., Maffei, L. Environment and brain plasticity: towards an endogenous pharmacotherapy. Physiological reviews. 94, 189-234 (2014).
