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Neuroscience

Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice

Published: January 20, 2015 doi: 10.3791/52329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, The University of Melbourne

Abstract

Mudanças duradouras no cérebro ou "plasticidade cerebral" subjazem o comportamento adaptativo e reparação cerebral após doença ou lesão. Além disso, as interações com o meio ambiente pode induzir plasticidade cerebral. Cada vez mais, a pesquisa está tentando identificar quais ambientes estimular a plasticidade cerebral benéfica para o tratamento de desordens cerebrais e comportamentais. Duas modificações ambientais que são descritos aumentar ou diminuir o número de tirosina-hidroxilase imunopositivas (TH +, a enzima limitante da velocidade de dopamina (DA síntese)) neurónios do mesencéfalo do rato adulto. O primeiro inclui o emparelhamento masculino e camundongos fêmeas juntos continuamente durante uma semana, o que aumenta TH mesencéfalo + neurônios em aproximadamente 12% no sexo masculino, mas diminui TH mesencéfalo + neurônios em aproximadamente 12% no sexo feminino. A segunda compreende ratos habitação continuamente por 2 semanas em "ambientes enriquecidos" (EE) contendo rodas de corrida, brinquedos, cordas, material de nidificação, etc., que increases TH mesencéfalo + neurônios em cerca de 14% no sexo masculino. Além disso, um protocolo é descrito por concomitantemente infundindo drogas diretamente no mesencéfalo durante estas manipulações ambientais para ajudar a identificar os mecanismos subjacentes a plasticidade do cérebro por motivos ambientais. Por exemplo, EE-indução de mais TH mesencéfalo + neurônios é abolida pelo bloqueio simultâneo de entrada sináptica em neurônios do mesencéfalo. Juntos, estes dados indicam que a informação sobre o meio ambiente é retransmitida via de entrada sináptica nos neurônios do mesencéfalo para ligar ou desligar a expressão de genes 'da'. Assim, a estimulação ambiental adequada, ou droga segmentação dos mecanismos subjacentes, pode ser útil para o tratamento de distúrbios cerebrais e comportamentais associados com desequilíbrios no mesencéfalo DA (por exemplo, doença de Parkinson, déficit de atenção e hiperatividade, esquizofrenia e dependência de drogas).

Introduction

Sinalização DArgic pelos neurônios na área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNC) do mesencéfalo é pensado para ser importante para os comportamentos cognitivos, emotivos e motoras motivou-recompensa. No entanto, muita ou pouca sinalização DA mesencéfalo causa muitos sintomas incapacitantes em uma variedade de distúrbios neurológicos (por exemplo, doença de Parkinson, déficit de atenção e hiperatividade, esquizofrenia e dependência de drogas). Drogas que aumentam ou diminuem a sinalização DA aliviar estes sintomas, no entanto, eles também produzem efeitos colaterais atribuíveis à sinalização desregulada e efeitos fora do alvo. A eficácia do fármaco também diminui ao longo do tempo, devido a respostas compensatórias do cérebro. Por isso, o desafio é restaurar a sinalização DA mesencéfalo normal em uma forma mais direccionada e fisiológico, e uma abordagem favorecido é aumentando ou diminuindo o número de neurônios DA mesencéfalo.

A evidência foi acumulando para several décadas que a expressão de genes e proteínas envolvidas no metabolismo e DA tráfico e outras catecolaminas em células de adulto é modificável (revisto em 1). No mesencéfalo, o número de tirosina-hidroxilase imunopositivas (TH +, a enzima limitante da velocidade na síntese de DA), em seguida, diminui, aumenta neurónios após a administração da neurotoxina 2,3, enquanto que o número de TH immunonegative (TH) neurónios mostra o padrão oposto (isto é, aumenta em seguida, diminui 3). Isto é consistente com a perda, em seguida, ganhar do "DA fenótipo 'por algumas células. O número de neurónios TH + TH e SNc também foi mostrado para mudar em direcções iguais mas opostos na sequência de vários tratamentos que alteram a actividade eléctrica destas células 4,5. Por exemplo, a infusão de pequeno-condutância, potássio activados por cálcio (SK) canal antagonista apamina em mesencéfalo durante 2 semanas, diminui o número de TH + e aumentos (pela mesma quantidade) o number de TH SNc neurônios 4,5. Em contraste, a infusão do agonista do canal SK-1 EBIO aumenta o número de TH + e diminui (pela mesma quantidade) o número de neurónios TH SNc 4,5. Alterações semelhantes foram vistos na sequência de uma variedade de tratamentos que visam a atividade neuronal do SNC, incluindo alguns que visava inputs aferentes 4. Esta aparente de regulação do número de neurónios SNc DArgic por actividade neuronal aferente e entrada levanta a possibilidade de que o ambiente ou comportamento pode influenciar o número de neurónios SNc. Na verdade ratos adultos expostos a diferentes ambientes têm mais ou menos mesencéfalo (SNc e VTA) TH + neurônios, e pelo menos algumas dessas mudanças induzidas pelo meio ambiente são abolidas pelo bloqueio simultâneo de entrada sináptica no mesencéfalo 6. Os objectivos desta comunicação são os seguintes: (1) fornecer mais detalhes sobre como implementar nossas manipulações ambientais e infusões de drogas; e (2) fornecer mais dados de apoio a nossa afirmação de que o environment regula o número de neurônios DA mesencéfalo, através da entrada de aferentes.

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Protocol

NOTA: Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Instituto Florey do Comitê de Ética Animal Health Neuroscience & Mental e em conformidade com da Austrália Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho publicou código de boas práticas para o cuidado e uso de animais para fins científicos (7 ª edição, 2004).

1. As manipulações ambientais

  1. O emparelhamento de Gênero
    1. Use sexualmente maduros (> 8 semanas de idade), os ratos machos e fêmeas pareados por idade.
      NOTA: Normalmente usamos camundongos C57BL / 6, mas tiveram os mesmos resultados usando camundongos Swiss neste protocolo. Normalmente usamos n = 8 machos e fêmeas n = 8 para cada experimento, dividido em n = 2 pares macho-macho (n = 4 machos), n = 2 pares fêmea-fêmea (n = 4 mulheres), e n = 4 pares macho-fêmea (n = 4 machos e 4 fêmeas = n).
    2. Após a chegada no animal instalação de detenção, casa-grupo dos camundongos por sexo para> 3 dias para se aclimatar. Aqui e througHout o emparelhamento sexo, manter estímulos ambientais externos (por exemplo, temperatura ambiente, a luz: ciclo escuro, comida, água, manuseio e limpeza) constante ou distribuir igualmente a todos os ratos.
    3. Aleatoriamente atribuir a cada rato a um par macho-macho, um par fêmea-fêmea, ou um par macho-fêmea. Colocar cada par em uma gaiola limpa em isolamento (2 ratos / gaiola) com acesso ad libitum à comida e água, e simplesmente os alojar deste modo continuamente durante 7 dias.
      NOTA: pecuária rotina é OK, durante este período, mas deve ser distribuída igualmente para todos os ratos. Tome cuidado para evitar o emparelhamento da ninhada masculinos e femininos.
  2. Enriquecimento Ambiental
    1. Use sexualmente maduros (> 8 semanas de idade), do sexo masculino ou feminino ratos da mesma idade.
      NOTA: Normalmente usamos n = 18 ratos para cada experimento, divididas em grupo n = 6 / tratamento.
    2. Após a chegada na zona de exploração de animais mantê-los alojados em padrão idêntico alojados em grupo (SH) (por exemplo, (por exemplo, temperatura ambiente, a luz: ciclo escuro, comida, água, manuseio e limpeza) constante ou distribuir igualmente a todos os ratos.
    3. Para começar o enriquecimento ambiental, atribuir aleatoriamente cada mouse para um dos 3 grupos: SH; roda de corrida (RW), ou ambiente enriquecido (EE) e colocar cada grupo de ratinhos em conjunto numa gaiola limpa idêntico com acesso ad libitum a comida e água.
      NOTA: Aqui, maiores gaiolas de retenção de ratos de todos os grupos, medindo 27 cm de largura, 42 cm de comprimento e 16 cm de profundidade foram usados.
      1. Além disso, fornecer as seguintes condições ambientais para cada grupo: SH compreendendo apenas maca (pelotas de papel ou serragem) no chão; RW SH compreendendo mais 2 rodas de correr; EE compreendendo RW além de brinquedos (cordas, escadas, túneis, e objetos como vazios rolos de papel toalha e pedaços de papel de seda) com os quais a explore, brincar, escalar, esconder, e ninho.
      2. Abrigá-los desta forma continuamente por 14 dias.
        NOTA: pecuária rotina é OK, durante este período, mas deve ser distribuída igualmente para todos os ratos.
    4. Camundongos EE sujeita a adicional 'super-enriquecimento' (SE), colocando-os juntos em uma grande gaiola contendo novas brinquedos para uma hora / dia (mesma hora todos os dias), 5 dias / semana.
      NOTA: Aqui, a 46 centímetros de largura, 69 centímetros de comprimento e 40 cm de profundidade banheira de plástico foi utilizado.
      1. Manter a novidade por apresentar um conjunto diferente de brinquedos cada sessão. Brinquedos que são limpos para ser re-apresentado à ratinhos com água e sabão e etanol a 80% para remover odores.
      2. Após cada sessão de SE, retornar os ratos para sua gaiola EE. SH Handle e RW camundongos o mesmo que os ratos SE (exceto para si SE) ao longo deste período (por exemplo, remover e voltar cada SH e RW rato de e para a sua gaiola).

  1. Preparação
    1. Use bombas osmóticas estéreis e de infusão de cérebro kits, que estão disponíveis comercialmente. O dia antes da implantação, utilizando uma técnica asséptica, primos dos implantes, preenchendo cada bomba, tubo de ligação e de uma cânula com uma solução de droga ou veículo estéril (tal como descrito nas instruções fornecidas com as bombas). Ligá-los juntos e incubar em solução salina estéril durante a noite a 37 ° C. Incubar implantes drogas e cheio de veículos separadamente para evitar a contaminação cruzada.
  2. Cirurgia.
    NOTA: Dependendo do país do experimentador, licenças especiais de experimentação animal ou dos subsídios são necessários para perseguir esses tipos de cirurgia e experiências pós-operatório.
    1. Esterilizar todos os equipamentos cirúrgicos e empregar uma técnica asséptica por toda parte. Anestesiar um mouse (por exemplo, usando 1-2% isoflurano no ar) e colocá-lo em um stereheadframe otaxic. Verifique a profundidade da anestesia durante o processo e administrar mais anestésico como necessário (por exemplo, ausência de retirada do membro de aperto nocivo pata é indicativo de anestesia adequada). Garantir a olhos são protegidos de dessecação por pomada lubrificante ocular, e que a temperatura corporal do rato permanece normal durante todo o procedimento.
    2. Fazer uma incisão na linha média através da pele a partir de entre os olhos e terminada 2cm posterior para a extremidade traseira do crânio. Blunt dissecar a pele longe da fáscia para baixo a parte de trás do mouse para criar uma 'bolsa' subcutânea grande o suficiente para caber confortavelmente a bomba e tubo de ligação uma vez que a cânula é implantado (o tubo que liga não deve ser dobrado após a conclusão). Raspe limpar a fáscia de sobre a face dorsal do crânio.
    3. Usando um diâmetro burr dental aproximadamente 1,5 mm, drill down no crânio no estereotáxica apropriado coordenadas uté uma camada fina, flexível de osso continua. Peel esta camada de distância usando uma pinça fina (isso evita danos a dura-máter subjacente e do cérebro com a rebarba dental). Verifique se o crânio é limpo de quaisquer fragmentos de sangue e osso, e não que haja sangramento ainda mais.
    4. Com a cânula realizada por um detentor de uma cânula, colocar a bomba e tubo de ligação para o 'bolso' subcutâneo que recobre as costas do mouse. Em seguida, posicionar a ponta da cânula nas coordenadas estereotáxicas adequadas e sobre a superfície do cérebro. Baixe cuidadosamente a cânula para o cérebro, mas parar de aproximadamente 1 mm de profundidade necessária.
      NOTA: A profundidade restante será negociado após a aplicação da primeira camada de acrílico dental.
    5. Certifique-se de novo a superfície do crânio está limpa e seca, em seguida, preparar um pequeno volume de acrílico dental e use um palito para alisá-lo em toda a área exposta do crânio, inclusive no burr-buraco no crânio em torno the cânula. Antes do acrílico endurece, abaixe a cânula ponta a profundidade restante no alvo.
    6. Prepare um pequeno volume de acrílico dental e camada esta em relação ao primeiro, bem como sobre o suporte de plástico branco para a cânula, para fixar a cânula no lugar. Repita com camadas adicionais de acrílico como necessário.
    7. Uma vez que o acrílico tem endurecido, retire cuidadosamente o suporte da cânula e cortar o plástico guia cânula removível branco usando uma lâmina de bisturi aquecida com uma chama de gás butano. Por último, suturar a pele fechada durante todo o implante.
  3. O tratamento pós-cirúrgico de Animais
    1. Aplicar pomada anti-séptico para as margens de pele, e administrar um agente anti-inflamatório para o rato (por exemplo meloxicam, 3 mg / kg sc). Remover o mouse do quadro, coloque-o sob uma lâmpada de calor, e observar até que ele recupere a consciência. Não devolva um rato que foi submetido a cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
      NOTA: Expmanipulações erimental como emparelhamento de gênero e meio ambiente enriquecido pode ser iniciada ou retomada no dia seguinte a cirurgia, no mínimo.
    2. Monitore seu peso corporal, comportamento geral e aparência diária. Trate sinais de infecção (por exemplo, inchaço, vermelhidão, pus) ao redor de incisões cirúrgicas com pomada anti-séptico tópico. Trate quaisquer sinais de doença, dor, stress ou desconforto (por exemplo, perda de> 10% do peso corporal, retraimento social, a falta de preparação, "amaciamento", disfunção do movimento, convulsões) com analgésicos e / ou antibióticos sistêmicos como necessário.
    3. Eutanásia ratos se> 15% de perda de peso ou sintomas da doença, dor, stress ou desconforto são não-reembolsáveis ​​no prazo de 1 semana de tratamento curativo.

3. tecido cerebral preparação, transformação imunohistoquímica, e estereologia

  1. Perfusão
    1. Imediatamente após manipulações / drogas ambientais, preparar o cérebro para o estudo.
    2. Primeiro administrar uma sobredose de anestésico para matar os ratos (por exemplo, 100 mg / kg ip de sódio pentobarbitona). Uma vez anestesiados, mas antes o coração pára de bater, coloque o mouse sobre as suas costas e gravata ou de definir ambos os membros.
    3. Usando um bisturi de cortar a pele que recobre o tórax, em seguida, uma incisão através do músculo logo abaixo da caixa torácica para dentro da cavidade abdominal. Coloque um grampo no apêndice xifóide da caixa torácica e levante as costelas para cima e longe do fígado expondo o diafragma.
    4. Corte através do diafragma e através das costelas lateralmente em ambos os lados utilizando tesouras grandes até a caixa torácica pode ser dobrada para trás sobre a cabeça para expor os pulmões e coração. Usando uma tesoura fina fazer uma pequena incisão no átrio direito como um ponto de saída de sangue e soluções perfundidos, em seguida, cortar a base do Ventri esquerdacle e colocar uma cânula-se através do ventrículo esquerdo, o átrio esquerdo e na aorta.
    5. Fixar a cânula no lugar depois a bomba quente (37 ° C) heparinizados e 0,1 M de fosfato de solução salina tamponada fisiológica (PBS) através da vasculatura até que a solução que sai do átrio direito é totalmente livre de sangue. Em seguida, a bomba de frio (4 ° C) a solução fixadora (tal como 4% de paraformaldeído em PBS) através da vasculatura, até que todo o rato está bem fixado. Remover o cérebro e o lugar em PBS com 30% de sacarose durante 2-3 dias até os dissipadores cerebrais.
      NOTA: Outros tipos de preparação do tecido pode ser aplicada dependendo da experiência no laboratório correspondente.
  2. Preparação de Cortes congelados de livre flutuação
    1. Corte cortes seriados através das regiões do cérebro de interesse e recolher estes em PBS.
      NOTA: Nós cortamos 40 mm de espessura, utilizando um criostato. Outros tipos de corte de tecido pode ser aplicada dependendo da especialização no correslaboratório ng.
  3. A imuno-histoquímica
    1. Execute imunohistoquímica padrão para proteínas de interesse. Incubar secções em 5% de soro normal de cabra e 0,3% de triton X-100 em PBS à temperatura ambiente durante 30 min, em seguida imunorreagem com anticorpo policlonal de coelho anti-TH (1: 400) a 4 ° C durante 48 hr, em seguida, policlonal biotinilado de cabra anti -rabbit (1: 1000) à temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Em seguida, incuba-se avidina-peroxidase (1: 500) à temperatura ambiente durante 1 hora, em seguida, em cobalto-níquel e intensificou-diamino- benzidina (0,5 mg / ml) à temperatura ambiente durante 18-20 min; para a última 3-5 min de incubação a diamino-benzidina adicionar peróxido de hidrogénio (0,01%) para catalisar a precipitação cromagénio. Lave os cortes três vezes para cada 10 min em PBS antes, depois, e entre cada uma das etapas anteriores.
    3. Monte as secções em lâminas de microscópio gelatinizadas, ar secá-las, então Nissl stain (vermelho neutro), desidratar em álcool, claro (X-3B), e lamela.
  4. Estimar o número total de neurônios TH + e TH SNc (LC e VTA) e utilizando métodos estereológicos imparciais. Certifique-se de que o stereologist é cego para o tratamento recebido. Excluir células gliais com base na soma diâmetro <5 um e contam apenas as células com um núcleo visível.
  5. Identificar o SNc (e VTA e LC) pelas localizações espaciais de células TH + e as estruturas anatómicas / limites de acordo com o atlas do cérebro de Paxinos e Watson 7. Contagem de células TH + no interior de um quadro de contagem (55 x 55 mm = 3,025 uM 2) em intervalos pré-determinados regularmente (x = 140 mm, y = 140 uM para SNc; x = 100 um, y = 100 mm para VTA e LC) ao longo de cada núcleo em cada quarta secção.

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Representative Results

Ratos adultos submetidos a essas manipulações ambientais alteraram número de mesencéfalo (SNC e VTA), mas não LC, TH + neurônios, e EE mais infusão mesencéfalo simultânea de picrotoxin ou bicuculina (GABA os antagonistas do receptor) abole EE-indução de mais SNc TH + neurônios. Estes dados foram previamente publicados em 6. Os presentes dados foram compilados em experiências duplicadas realizados como parte desse estudo anterior, mas não foram publicados em outros lugares.

Especificamente, os ratos machos adultos que foram emparelhados com camundongos fêmeas adultas têm mais TH + SNc e VTA (mesencéfalo) neurônios do que os machos emparelhados com machos, enquanto as fêmeas pareadas com machos têm menos TH + SNC ea VTA neurônios do que as fêmeas pareadas com as fêmeas (Figura 1 em 6). Outro exemplo disso é fornecido aqui na Figura 1, que mostra a média ± SE número de neurônios TH + SNc em macho e fêmeas imediatamente following emparelhamento de gênero. Os machos emparelhados com as fêmeas durante 7 dias tem cerca de 12% mais TH + SNc neurônios do que os machos emparelhados com machos (duas colunas azuis na Figura 1). Por outro lado, as fêmeas pareadas com machos têm cerca de 12% menos TH + SNc neurônios do que as fêmeas pareadas com as fêmeas (duas colunas vermelhas na Figura 1).

O número de TH + SNc e VTA neurónios também aumenta em ratinhos macho adultos sujeitos a EE (Figura 2 em 6), e EE-indução de mais SNc neurónios TH + é abolido pelo bloqueio concomitante de receptores GABA A do mesencéfalo (Figura 3 em 6). Outro exemplo disso é fornecido aqui na Figura 2, onde EE com infusão veículo resultou em aproximadamente 14% a mais de TH + SNc neurônios do que SH com a infusão de veículo (esquerda duas colunas na Figura 2). No entanto, com EE GABA A infusão de antagonistas do receptor (quer 10 mM ou 5 picrotoxina1; M bicuculina) completamente abolida este aumento (direita duas colunas na Figura 2). Note-se, a partir destes dados são a SNc contralateral à cânula de infusão, e são quase idênticos aos efeitos observados no SNc ipsilateral que foi relatada em seis.

Figura 1
Figura 1:. Efeitos do emparelhamento de gênero sobre o número de SNc TH + neurônios Imediatamente após 7 dias de emparelhamento de gênero (protocolo 1.1) ratos adultos foram perfundidos (3.1), a sua mesencéfalo foi seccionado (3.2), os cortes foram processados ​​para a tirosina hidroxilase (TH , a taxa de enzima limitante na síntese de DA) imuno-histoquímica (3.3), e os números de neurónios TH + SNc foram estimados utilizando estereologia (3.4). Plotados aqui são a média ± SE número da SNC TH + neurônios em camundongos machos emparelhados com os ratos do sexo masculino (n = 4 ratos machos a partir de n = 2 pares macho-macho, luz col azulUMN), os machos emparelhado com fêmeas (n = 6 camundongos machos de pares 6 macho-fêmea, escuro coluna azul), fêmeas pareadas com as fêmeas (n = 8 camundongos fêmeas de n = 4 pares de fêmea-fêmea, coluna de luz vermelha), e fêmeas pareadas com machos (n = 6 camundongos fêmeas de n = 6 pares do sexo masculino-feminino, coluna vermelho escuro). O emparelhamento com o sexo oposto resultou em um aumento no número de SNc TH + neurônios no sexo masculino, mas uma diminuição no número da SNC neurónios TH + no sexo feminino (p <0,001 One-way ANOVA; * p <0,05 Tukey múltiplas comparações de pares).

Figura 2
Figura 2: Efeitos do meio de enriquecimento com GABA mesencéfalo Um bloqueio do receptor sobre o número de neurónios TH + SNc Imediatamente após 14 dias de enriquecimento ambiente (protocolo 1.2) com infusão simultânea de qualquer veículo, o antagonista do receptor de GABA A p.icrotoxin (10 uM), ou o antagonista de receptor GABA A bicuculina (5 uM) para a esquerda mesencéfalo (protocolo 2), adultos, machos, foram perfundidos (3.1), a sua mesencéfalo foi seccionada (3.2), as secções foram processadas para a tirosina hidroxilase ( TH, a enzima limitante da taxa no DA síntese) imuno-histoquímica (3.3), e os números de TH + neurônios no direito (contralateral) SNc foram estimadas usando estereologia (3.4). Plotados aqui são a média ± número SE da SNC TH + neurônios no padrão alojados (SH) camundongos machos com infusão de veículo (n = 6, luz coluna azul), ambiente enriquecido (EE) machos com infusão de veículo (n = 6, primeiro azul escuro coluna), EE machos com infusão picrotoxin (n = 6, segunda coluna azul escuro), e os machos de EE com infusão bicuculina (n = 6, terceira coluna azul escuro). EE resultou em um aumento no número de SNc neurónios TH +, mas esta foi abolida por infusão de picrotoxina ou bicuculina no mesencéfalo contralateral (p <0,001 ANOVA one-way; * P <0,001 Tukey múltiplas comparações de pares).

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Discussion

Manipulações ambientais

A motivação por trás do design dessas manipulações ambientais (emparelhamento de gênero e de enriquecimento ambiental) foi determinar se o meio ambiente, e / ou comportamento solicitado pelo ambiente, está associado a alterações no número de neurônios DA mesencéfalo. O foco foi, portanto, no fornecimento de ambientes e estimular comportamentos que são propensos a se envolver sinalização DA mesencéfalo. Estes emparelhamento incluído com o sexo oposto, e enriquecimento ambiental que compreende o acesso a correr rodas, cordas, escadas, túneis, e objetos para explorar, brincar, subir, ocultar e ninho. Ambos os ambientes devem favorecer cognitivas, emotivas e motoras comportamentos motivados-recompensa, que têm sido associados com o aumento agudas na descarga neuronal mesencéfalo DA e liberação de dopamina (por exemplo, 8). Nossa hipótese era que eles também estão associados a mudanças mais duradouras no mesencéfalo DA br sinalizaçãodeve por mudanças no número de neurônios DA mesencéfalo. Aqui e em outros lugares 6, é apresentada evidência de que este é realmente o caso.

Nossas investigações começaram a usar o protocolo de emparelhamento de gênero (1,1), porque ele compreende um comportamento núcleo primordial e essencial motivou-recompensa (ou seja, a cópula). Além disso, reprodutivo, de ajustamento do casal, e os comportamentos sociais são conhecidos por induzir mudanças análogos em outros sistemas neuroquímicos (por exemplo, alterações na densidade de oxitocina, vasopressina e células de hormônio liberador de corticotropina no hipotálamo 9). De fato, após 7 dias de emparelhamento contínua com o sexo oposto, mostramos aqui e em outros lugares 6 que os homens têm cerca de 10% mais TH + neurônios do mesencéfalo enquanto que as fêmeas têm cerca de 10% menos TH + neurônios do mesencéfalo [Nota: Estes efeitos compreendem SNc (presente estudo e 6) VTA e 6, mas não o locus coeruleus 6, onde TH ajuda a sintetizar noradrenalina].Isso apóia a idéia de que o número de neurônios DA mesencéfalo no cérebro adulto não é fixo, mas muda de acordo com as interações ambiente, comportamento, ou ambiente / comportamento. Outra evidência argumenta essas mudanças são provocadas por alterações na expressão do gene TH e proteína nos neurônios do mesencéfalo existentes, ao contrário DA neurogênese ou degeneração. (1) DA neurogênese no mesencéfalo do rato adulto ocorre tanto não em todos 10-14, ou a preços muito mais baixos do que pode dar conta da adição de cerca de 500 novos neurônios SNc AD em uma semana 15,16. (2) estudos que quantificam mudanças no número de neurônios SNc seguintes 2 infusões semanais de várias drogas que alvejam a atividade elétrica dos neurônios do mesencéfalo têm consistentemente revelado mudanças iguais (mais uma vez cerca de 10%), mas opostas TH + células e TH, resultando em nenhuma mudança na net o total de 4,5 número de células. Isto é consistente com a regulação dos níveis de proteína TH acima ou abaixo immunohistochemically detníveis ectable sem adição ou subtração de neurônios. (3) Muitos estudos têm relatado alterações dependentes de atividade no gene TH e expressão de proteínas dentro das células através de uma escala de tempo de várias horas 17-23, e o mesmo foi relatado em mesencéfalo 4.

A questão que se coloca, portanto, quais são os mecanismos de mudanças na expressão do gene TH e proteína nos neurônios do mesencéfalo existentes subjacentes. As possibilidades incluem esteróides sexuais, que podem fundamentar tanto as diferenças basais em número de TH + neurônios do mesencéfalo em homens e mulheres, como as alterações específicas do gênero bem (aumentos nos machos e nas fêmeas) diminui seguintes emparelhamento aqui relatado anteriormente e 6. Outra possibilidade é dependente de atividade regulação da expressão de TH. SNC ea VTA neurônios (ambos DA e não-DA) receber a entrada sináptica predominantemente do striatum, hipotálamo, núcleo subtalâmico, e frontal dos córtices 24. No contexto de emparelhamento género, essas entradaspoderia ser regulada por comportamento sensório-motor, o olfato, os feromônios, estresse, metabolismo ou reprodução. Regulação dependente de atividade de expressão TH pode ser mediada através de cálcio ou de sinalização neuropeptídeo vias que afetam a expressão de genes e de proteínas (por exemplo, 1).

Para ajudar a distinguir entre esteróides sexuais contra mecanismos dependentes de atividade subjacentes aos efeitos da emparelhamento de gênero sobre o número de neurônios DA mesencéfalo foi aplicado o protocolo de ambiente de enriquecimento (1,2), que melhores controles contra a influência potencial de esteróides sexuais e talvez também outros hormônios ( por exemplo, os feromônios, estresse, reprodução), e para a influência potencial da atividade neuronal-driven aferentes. O fator relevante aqui é os diferentes grupos foram muito mais semelhante em termos de gênero (todos do sexo masculino), hormônios, status social e stress. Apesar de status social e estresse ainda pode ser diferente entre os grupos (por exemplo, um macho mais dominante e agressivoem um grupo), é improvável que este será sempre o mesmo grupo (por exemplo, EE), e os efeitos de EE agora foram replicados múltiplos 6 vezes. Na EE, a magnitude do aumento em neurónios TH + do mesencéfalo foi o mesmo que no protocolo de emparelhamento género (comparar os machos das Figuras 1 e 2 apresentam estudo, e as Figuras 1 e 2 em 6). Além disso, o aumento induzido por EE na SNc TH + neurônios induzida por enriquecimento ambiental foi completamente abolida pelo bloqueio simultâneo de receptores GABA A mesencéfalo (Figura 2 estudo e na Figura 3 em 6), que fornecem cerca de 70% de toda a entrada de aferentes a mesencéfalo DA neurônios 25. Juntos, estes dados indicam atividade neural-driven aferentes é pelo menos tão potente influência sobre o número de neurônios DA mesencéfalo como hormônios.

Mais conhecimentos sobre o meio ambiente factors regulam o número de neurónios TH + do mesencéfalo vem da comparação entre os efeitos de RW e EE. RW compreende uma atividade motora bem aprendida ou banal (correndo nas rodas), enquanto EE compreende uma quantidade similar de tal atividade, ainda que de uma maior variedade (ou seja, vários brinquedos, mas inalterada ao longo dos 14 dias), além de exposição contínua a novos brinquedos em SE o componente (1.2.4). Nossos dados publicados anteriormente 6 revelou nenhum ou pequenos aumentos nos neurônios SNC ea VTA TH + RW em comparação com camundongos SH, mas aumenta muito maiores em EE (+ SE) camundongos. Isso destaca a estimulação sensorial, cognição, novidade e / ou aprendizagem e memória como reguladores mais potentes do número de neurônios DA mesencéfalo que a atividade física banal sozinho.

EE tem sido amplamente utilizado para induzir efeitos terapêuticos e melhorar a reparação do cérebro em diversos modelos animais de desordens cerebrais, tais como a doença de Alzheimer, doença de Huntington e doença de Parkinson 26. A ndtura de tais manipulações ambientais é que eles variam amplamente entre laboratórios (como fazem as condições 'alojados-padrão "), no entanto, existem aspectos fundamentais de protocolos de EE que são notáveis ​​e foram previamente discutidas 27. EE fornece maior novidade ambiental e complexidade em relação à caixa padrão, de modo a aumentar os níveis de estimulação sensorial, actividade cognitiva e exercício físico. Ao projetar experimentos EE, é preciso considerar fatores etológicas, incluindo as habilidades sensoriais e cognitivas dos animais e seus impulsos instintivos. Como ratos (e ratos) são noturnos, com habilidades visuais inferiores aos seres humanos, mas excelente somatossensorial e acuidades olfativos, os objetos de enriquecimento deve refletir os instintos inatos e capacidades dos animais experimentais. Portanto, é novidade, forma, textura e odor dos objectos que podem ser particularmente importantes para os ratos. Avaliações da força relativa do moti dos roedoresvações para uma variedade de objetos de enriquecimento foram feitas recomendações para a inclusão de objetos mastigáveis ​​para permitir a oportunidade de exercer fundamentais, comportamentos típicos da espécie 28,29. O fornecimento de material de nidificação é considerada uma componente fundamental do protocolo e camundongos enriquecimento instintivamente rasgar todos os objetos feitos de papel ou papelão, proporcionando oportunidade para as atividades sensoriais, cognitivas e motoras 30,31. É importante também que em um experimento com várias gaiolas EE, a novidade equivalente e complexidade dos objetos é fornecido, para minimizar a variância dentro do grupo EE, e controle semelhante de parâmetros ambientais deve ser exercido para o grupo SH. O ideal é que o número de ratos por gaiola deve ser o mesmo entre EE e grupos SH (a não ser que os efeitos do tamanho do grupo social está a ser investigado especificamente), e não há 'guloseimas' deve ser usado em EE, como todas as diferenças alimentares entre os grupos poderia confundem tele interpretação dos efeitos da actividade cognitiva e exercício físico que aumenta EE 12. Outras considerações importantes são a duração da exposição a um ambiente enriquecido e da idade em que se inicia o enriquecimento. Embora a expressão diferencial de genes tem sido mostrado apenas após 3 horas em um ambiente enriquecido de 32, maiores períodos de exposição podem ser necessárias para alterações estruturais e funcionais a ocorrer 33,34. Além disso, a plasticidade induzida por enriquecimento pode ser aumentada durante períodos críticos do desenvolvimento pós-natal 35.

Bomba de infusão de cérebro e implantes osmóticos cânula para infusões de drogas

Os implantes e da cânula da bomba osmótica são muito eficazes para a entrega de drogas directamente no cérebro. Com a experiência, a cirurgia de implante demora cerca de 1 hora por mouse. Acrílico Dental por si só é suficiente para fixar a cânula no lugar por longos períodos (Nota: Temos ido até 28 dias em oexperimentos utros); não há necessidade de hardware adicional de fixação tais como parafusos ósseos. É importante garantir que há uma abundância de folga no tubo que liga a bomba e cânula para permitir a cabeça máxima e flexão do pescoço, sem colocar muito estresse sobre as conexões. Isto é particularmente verdade para as infusões de longo prazo, em que o crescimento de tecido conjuntivo em torno da bomba pode ancorar-lo no lugar, reduzindo assim a flexibilidade do implante. Sempre que possível, os ratos também são alojados individualmente após a cirurgia para evitar companheiros prejudicando o implante através de arranhar, puxar ou morder. A dose de medicamento é em grande parte determinada pela quantidade adicionada à bomba. No entanto, em atenção este respeito, também deve ser pago para a taxa de fluxo da bomba, a estabilidade química da droga a 37 ° C, e a taxa de difusão da droga a partir da cânula através do cérebro. Atualmente bombas disponíveis do nosso fornecedor pode manter infusão por até 6 semanas em um caudal de 0,15 l / h; o jejumest disponível vazão é de 10 l / h, mas com duração de apenas uma semana. Tempos mais longos de infusão pode ser alcançada através da realização de pequenas cirurgias adicionais para substituir as bombas de esgotados com bombas cheias na parte de trás do tubo de ligação (ou seja, sem perturbar a cânula implantada). A extensão espacial do azul de metileno (1% de azul de metileno, PM 320, em 0,9% de NaCl) de difusão a partir de uma ponta de cânula implantada 0,3 milímetros acima do intermediário SNc esquerda ao longo do seu aspecto médio-lateral foi medida para estender-se desde a borda lateral do mesencéfalo apenas através da linha média mediolaterally, e ao longo de toda a extensão do dorso-ventral mesencefálico (após 2 semanas de infusão). Isso é muito mais amplo do que um pequeno núcleo como SNc, ea disseminação de drogas pode ser maior (ou menor), dependendo da sua MW, a estabilidade química, buffering, etc. Na verdade, pode-se inferir a partir dos dados atuais (Figura 2) que tanto picrotoxin e bicuculina atingiu o SNc contralateral em concentrati biologicamente ativaons.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluorane Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia AHN3640
ALZET Osmotic pump 1002 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0004317
ALZET Brain infusion kit 1 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0004760
ALZET cannula holder 1 DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 0008860
Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands n/a
Vertex Self Curing (dental acrylic powder) Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands n/a
METACAM (Meloxicam) Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia L10100
Sodium Pentobarbitone Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia 571177
Normal goat serum chemicon-temecula, CA S26-Litre
Triton X-100 Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 1.08603.1000
Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 AB152
Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 EO432
Avidin peroxidase Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU A3151-1mg
Diamino-benzidine Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU D-5637
Stereo Investigator MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 n/a

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References

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Neurociência Edição 95 Behavior mesencéfalo tirosina hidroxilase dopamina plasticidade substantia nigra pars compacta
Modulações Ambientais do número de Midbrain dopamina Neurônios no Adulto Mice
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Tomas, D., Prijanto, A. H., Burrows, … More

Tomas, D., Prijanto, A. H., Burrows, E. L., Hannan, A. J., Horne, M. K., Aumann, T. D. Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice. J. Vis. Exp. (95), e52329, doi:10.3791/52329 (2015).

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