Abstract
Des changements durables dans le cerveau ou «plasticité cérébrale» sous-tendent le comportement adaptatif et la réparation du cerveau après les maladies ou des blessures. En outre, les interactions avec notre environnement peuvent induire la plasticité du cerveau. De plus en plus, la recherche tente d'identifier les environnements stimuler la plasticité cérébrale bénéfique pour traiter les troubles cérébraux et comportementaux. Deux manipulations de l'environnement qui sont décrits augmenter ou diminuer le nombre de tyrosine hydroxylase immunopositif (TH +, l'enzyme limitant la vitesse dans la dopamine (DA) synthèse) des neurones dans le mésencéphale de souris adulte. La première comprend appariement souris mâles et femelles de façon continue pendant 1 semaine, ce qui augmente TH mésencéphale + neurones d'environ 12% chez les hommes, mais diminue TH mésencéphale + neurones d'environ 12% chez les femmes. La seconde comprend les souris de logement en continu pendant deux semaines dans des «environnements enrichis» (EE) contenant roues de roulement, des jouets, des cordes, des matériaux de nidification, etc., qui increases TH mésencéphale + neurones d'environ 14% chez les hommes. En outre, un protocole est décrite pour infuser simultanément des médicaments directement dans le mésencéphale au cours de ces manipulations de l'environnement pour aider à identifier les mécanismes sous-jacents de l'environnement induite par la plasticité du cerveau. Par exemple, EE-induction de plus TH mésencéphale + neurones est abolie par le blocage simultané de l'entrée synaptique sur les neurones du mésencéphale. Ensemble, ces données indiquent que l'information sur l'environnement est relayé via l'entrée synaptique des neurones du mésencéphale pour allumer ou éteindre l'expression de gènes «DA». Ainsi, la stimulation environnementale appropriée, ou le ciblage de médicaments des mécanismes sous-jacents, peut être utile pour le traitement de troubles cérébraux et comportementaux associés à des déséquilibres dans le mésencéphale DA (par exemple la maladie de Parkinson, déficit de l'attention et hyperactivité, la schizophrénie et la toxicomanie).
Introduction
DArgic la signalisation par les neurones dans la région tegmentale ventrale (VTA) et substantia nigra pars compacta de (SNC) du mésencéphale est considéré comme important pour les comportements cognitifs, émotionnels et moteurs récompense motivés. Cependant, la signalisation de DA trop ou trop peu mésencéphale provoque de nombreux symptômes invalidants dans une variété de troubles neurologiques (par exemple la maladie de Parkinson, déficit de l'attention et hyperactivité, schizophrénie et la toxicomanie). Médicaments qui augmentent ou diminuent DA signalisation soulager ces symptômes, mais ils produisent également des effets secondaires attribuables à la signalisation dérégulée et les effets hors-cible. L'efficacité du médicament diminue également au fil du temps en raison des réponses compensatoires du cerveau. Le défi est donc de rétablir la signalisation DA mésencéphale normale, de façon plus ciblée et physiologique, et une approche favorisée est en augmentant ou en diminuant le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale.
La preuve a été accumulé pendant sevsieurs décennies que l'expression des gènes et des protéines impliquées dans le métabolisme et le trafic DA et d'autres catécholamines dans les cellules adultes matures est modifiable (examinés dans une). Dans le mésencéphale, le nombre de tyrosine hydroxylase immunopositif (TH +, l'enzyme limitant la vitesse à Da synthèse) neurones diminue puis augmente suite à l'administration de la neurotoxine 2,3, tandis que le nombre de TH immunonegative (TH) neurones montre la tendance inverse (ce est à dire des augmentations puis diminue 3). Ceci est cohérent avec la perte ensuite gain du «phénotype DA 'par certaines cellules. Le nombre de neurones TH TH + et CNS a également été démontré que le changement dans des directions égales mais opposées suivant divers traitements qui modifient l'activité électrique de ces cellules à 4,5. Par exemple, la perfusion de la petite conductance, de potassium activé par le calcium (SK) dans le canal antagoniste apamine mésencéphale pendant 2 semaines diminue le nombre de TH + et augmente (par la même quantité) à la numbre de TH- SNc neurones 4,5. En revanche, la perfusion de l'agoniste des canaux SK-1 EBIO augmente le nombre de TH + et diminue (par le même montant) le nombre de neurones TH SNc 4,5. Des changements similaires ont été observés suite à une variété de traitements ciblant SNc activité neuronale, y compris certains qui visait entrées afférentes 4. Ce règlement apparente du nombre de neurones SNc DArgic par l'activité neuronale et entrée afférente soulève la possibilité que l'environnement ou le comportement peuvent influer sur le nombre de neurones de SNC. En effet, des souris adultes exposés à des environnements différents ont plus ou moins mésencéphale (SNC et VTA) TH + neurones, et au moins certains de ces changements induits par l'environnement sont abolis par le blocage simultané de l'entrée synaptique dans le mésencéphale 6. Les objectifs de cette communication sont les suivants: (1) fournir plus de détails sur la façon de mettre en œuvre nos manipulations de l'environnement et des perfusions de médicaments; et (2) fournir des données à l'appui de notre affirmation selon laquelle le environnement régule le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale, via l'entrée afférente.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures expérimentales sur les animaux ont été approuvés par l'Institut Florey du comité d'éthique de la santé animale Neuroscience & mentale et conformes aux Conseil de recherches médicales national de santé et de l'Australie a publié un code de pratique pour le soin et l'utilisation des animaux à des fins scientifiques (7 e édition, 2004).
1. manipulations de l'environnement
- Sexe Pairing
- Utilisez sexuellement matures (> ancienne 8 semaines), mâle appariés pour l'âge et les souris femelles.
NOTE: Nous utilisons généralement souris C57BL / 6, mais avons eu les mêmes résultats en utilisant des souris Swiss dans ce protocole. Nous utilisons généralement n = 8 hommes et n = 8 femelles pour chaque expérience, divisé en n = 2 paires de mâles-mâle (n = 4 hommes), n = 2 femelle-femelle paires (n = 4 femmes), et n = 4 paires hommes-femmes (n = 4 mâles et 4 femelles n =). - À l'arrivée dans le centre de détention des animaux, groupe-maison, les souris par sexe pour> 3 jours pour se acclimater. Ici et throughout l'appariement entre les sexes, garder stimuli environnementaux extérieurs (par exemple la température ambiante, la lumière: cycle d'obscurité, de la nourriture, de l'eau, la manipulation et le nettoyage) constante ou distribuer également à toutes les souris.
- Affecter aléatoirement chaque souris à une paire de mâle-mâle, une paire de femelle-femelle, ou une paire de mâle-femelle. Placez chaque paire dans une cage propre dans l'isolement (2 souris / cage) avec accès ad libitum à la nourriture et de l'eau, et il suffit de les accueillir de cette manière continue pendant 7 jours.
NOTE: Routine l'élevage est OK cours de cette période, mais doit être répartie également entre toutes les souris. Prenez soin d'éviter appariement des congénères masculins et féminins.
- Utilisez sexuellement matures (> ancienne 8 semaines), mâle appariés pour l'âge et les souris femelles.
- Enrichissement de l'environnement
- Utilisez, mâles ou femelles souris appariés selon l'âge sexuellement matures (> ancienne 8 semaines).
NOTE: Nous utilisons généralement n = 18 souris pour chaque expérience, répartis en groupe n = 6 / de traitement. - À l'arrivée dans le centre de détention des animaux garder logé dans la norme identique hébergé en groupe (SH) (par exemple, (par exemple la température ambiante, la lumière: cycle d'obscurité, de la nourriture, de l'eau, la manipulation et le nettoyage) constante ou répartir équitablement à toutes les souris.
- Pour commencer l'enrichissement de l'environnement, d'attribuer au hasard chaque souris à l'un des trois groupes: SH; roue en cours d'exécution (RW), ou de l'environnement enrichi (EE) et placer chaque groupe de souris ainsi que dans une cage propre identiques avec un accès ad libitum à la nourriture et de l'eau.
REMARQUE: Ici, de plus grandes cages de rats-tenant pour tous les groupes, mesure 27 cm de large, 42 cm de long et 16 cm de profondeur ont été utilisés.- En outre, fournir les conditions suivantes environnementales à chaque groupe: SH comprenant seulement la litière (boulettes de papier ou de la sciure) sur le sol; RW comprenant SH plus 2 roues fonctionnement; EE comprenant RW ainsi que les jouets (cordes, échelles, tunnels, et des objets tels que vides rouleaux de serviettes en papier et des morceaux de papier de soie) avec lequel explore, jeu, grimper, se cacher, et le nid.
- Les loger dans cette façon continue pendant 14 jours.
NOTE: Routine l'élevage est OK cours de cette période, mais doit être répartie également entre toutes les souris.
- EE souris soumises à des super-enrichissement 'additionnel (SE) en les plaçant ensemble dans une cage plus grande contenant de nouveaux jouets pour 1 heure / jour (même heure chaque jour), 5 jours / semaine.
NOTE: Voici, un 46 cm de large, 69 cm de long et 40 cm de profondeur baignoire en plastique a été utilisé.- Maintenir la nouveauté en présentant un ensemble différent de jouets chaque session. Jouets propres qui doivent être re-présentées à des souris avec de l'eau savonneuse et 80% d'éthanol pour éliminer les odeurs.
- Après chaque séance SE, retourner les souris dans leur cage d'EE. Poignée SH et souris RW même que les souris SE (sauf pour SE lui-même) tout au long de cette période (par exemple, retirer et restituer chaque SH et RW souris depuis et vers sa cage).
- Utilisez, mâles ou femelles souris appariés selon l'âge sexuellement matures (> ancienne 8 semaines).
- Préparation
- Utilisation des pompes osmotiques et des kits stériles de perfusion du cerveau, qui sont disponibles dans le commerce. Le jour avant l'implantation, en utilisant une technique aseptique, les premiers implants en remplissant chaque pompe, tube et de raccordement de canule avec une solution stérile de médicament ou de véhicule (comme décrit dans les instructions fournies avec les pompes). Branchez-les ensemble et incuber dans une solution saline stérile nuit à 37 ° C. Incuber implants drogue et de véhicules remplis séparément pour éviter la contamination croisée.
- Surgery.
REMARQUE: Selon le pays de l'expérimentateur, permis ou de quotas de l'expérimentation animale spéciaux sont nécessaires pour poursuivre ces types de chirurgie et expériences post-opératoires.- Stériliser tous les équipements chirurgicaux et d'employer une technique aseptique pendant. Anesthésier la souris (par exemple en utilisant 1-2% isofluorane dans l'air) et le placer dans un stèrechevalement otaxic. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie pendant toute la procédure et administrer en outre anesthésique nécessaire (par exemple absence de retrait des membres de la patte nocive pincée est indicative de l'anesthésie adéquate). Se assurer que les yeux sont protégés de la dessiccation par onguent lubrifiant oculaire, et que la température du corps de la souris reste normale tout au long de la procédure.
- Faire une incision médiane à travers la peau à partir d'entre les yeux et de finition 2 cm en arrière du bord arrière du crâne. Blunt disséquer la peau loin de l'aponévrose sous-jacente à l'arrière de la souris pour créer une «poche» sous-cutanée assez grand pour accueillir confortablement la pompe et tube de liaison une fois la canule est implanté (le tube de liaison ne doit pas être plié à la fin). Grattez effacer le fascia de plus de la face dorsale du crâne.
- Utiliser un diamètre fraise dentaire environ 1,5 mm, descendre dans le crâne à la stéréotaxique appropriée coordonne uusqu'à une couche mince, souple des restes osseux. Peel cette couche loin en utilisant une pince fine (cela évite d'endommager la dure-mère sous-jacente et le cerveau avec le fraise dentaire). Assurer le crâne est nettoyé de tous les fragments de sang et d'os, et qu'il n'y a pas de saignement plus loin.
- Avec la canule détenu par un porte-canule, placer la pompe et le tube de raccordement dans la «poche» sous-cutanée recouvrant le dos de la souris. Ensuite, placez la pointe de la canule aux coordonnées stéréotaxiques appropriées et sur la surface du cerveau. Abaisser avec précaution la canule dans le cerveau, mais arrêter environ 1 mm de moins que la profondeur requise.
NOTE: La profondeur restante sera négocié après l'application de la première couche de l'acrylique dentaire. - Vérifiez à nouveau la surface du crâne est propre et sec, puis préparer un petit volume de l'acrylique dentaire et utiliser un cure-dent pour lisser sur toute la surface exposée du crâne, y compris dans le trou de trépan à travers le crâne autour èmee canule. Avant durcit l'acrylique, abaisser la canule basculer la profondeur reste dans la cible.
- Préparer un autre petit volume de l'acrylique dentaire et cette couche sur le premier, ainsi que sur le support de plastique blanc pour la canule, de fixer la canule en place. Répéter l'opération avec des couches supplémentaires de acrylique que nécessaire.
- Une fois l'acrylique a durci, retirer délicatement le porte-canule et de couper la languette blanche en plastique amovible de la canule en utilisant une lame de scalpel chauffé avec une flamme de butane. Enfin, suturer la peau fermée sur toute implant.
- Traitement post-opératoire des animaux
- Appliquer une pommade antiseptique pour les marges de la peau, et d'administrer un anti-inflammatoire à la souris (par exemple le méloxicam, 3 mg / kg sc). Débranchez la souris de la trame, le placer sous une lampe chauffante, et observer jusqu'à ce qu'il reprenne conscience. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
REMARQUE: Experimental manipulations telles que le jumelage entre les sexes et à l'enrichissement de l'environnement peuvent être lancés ou repris le jour suivant la chirurgie au plus tôt. - Surveiller leur poids corporel, le comportement général et l'apparence quotidienne. Traiter les signes d'infection (gonflement, rougeur, pus) autour des incisions chirurgicales avec une pommade topique antiseptique. Traiter tous les signes de maladie, la douleur, le stress ou d'inconfort (par exemple perte de poids corporel> 10%, retrait social, absence de toilettage, "bouffer", le dysfonctionnement de mouvement, convulsions) avec des analgésiques et / ou des antibiotiques systémiques que nécessaire.
- Euthanasier les souris si> 15% de perte ou de symptômes de la maladie, la douleur, le stress ou d'inconfort poids sont non-recouvrables à moins 1 semaine de traitement curatif.
- Appliquer une pommade antiseptique pour les marges de la peau, et d'administrer un anti-inflammatoire à la souris (par exemple le méloxicam, 3 mg / kg sc). Débranchez la souris de la trame, le placer sous une lampe chauffante, et observer jusqu'à ce qu'il reprenne conscience. Ne retournez pas une souris qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète.
3. tissu cérébral préparation, la transformation immunohistochimique et Stéréologie
- Perfusion
- Immédiatement après manipulations / de drogue environnementaux, préparer le cerveau pour l'étude.
- Première administrer une surdose d'anesthésique pour tuer les souris (par exemple, 100 mg / kg ip pentobarbital sodique). Une fois anesthésié, mais avant que le cœur cesse de battre, mettre la souris sur son dos et cravate ou épingler les deux pattes avant.
- En utilisant un scalpel découpé la peau recouvrant le thorax incise ensuite à travers le muscle juste en dessous de la cage thoracique dans la cavité abdominale. Placez une pince sur la pointe du sternum de la cage thoracique et soulever la cage thoracique et loin de le foie exposer le diaphragme.
- Couper à travers la membrane et à travers les nervures latéralement des deux côtés à l'aide de grands ciseaux jusqu'à la cage thoracique peut être replié sur la tête pour exposer les poumons et le cœur. Avec des ciseaux fins font une petite incision dans l'oreillette droite comme un point de sortie pour le sang et les solutions perfusés, puis couper à travers la base du ventricule gauchecle et placer une canule à travers le ventricule gauche, l'oreillette gauche, et dans l'aorte.
- Fixer la canule en place puis pomper chaude (37 ° C) héparine et 0,1 M tampon phosphate salin physiologique (PBS) à travers le système vasculaire jusqu'à ce que la solution sortant de l'oreillette droite est entièrement libre de sang. Ensuite, la pompe à froid (4 ° C) une solution de fixateur (tels que 4% de paraformaldehyde dans du PBS) à travers le système vasculaire jusqu'à ce que l'ensemble souris est bien fixé. Retirez le cerveau et dans PBS avec 30% de saccharose pendant 2-3 jours jusqu'à ce que les puits de cerveau.
NOTE: D'autres types de préparation de tissu pourraient être appliquées en fonction de l'expertise en laboratoire correspondant.
- Immédiatement après manipulations / de drogue environnementaux, préparer le cerveau pour l'étude.
- Préparation de cryosections flottant
- Couper des sections en série à travers les régions du cerveau d'intérêt et de recueillir ceux-ci dans PBS.
NOTE: Nous avons réduit de 40 sections um d'épaisseur en utilisant un cryostat. Autres types de sectionnement de tissu pourraient être appliquées en fonction de l'expertise dans le corresponding laboratoire.
- Couper des sections en série à travers les régions du cerveau d'intérêt et de recueillir ceux-ci dans PBS.
- Immunohistochimie
- Effectuer immunohistochimie standard pour des protéines d'intérêt. Incuber les coupes dans 5% de sérum de chèvre normal et 0,3% de Triton X-100 dans du PBS à température ambiante pendant 30 min, puis immunoréagissent avec polyclonal de lapin anti-TH (1: 400) à 4 ° C pendant 48 heures, puis polyclonal biotinylé de chèvre anti -rabbit (1: 1000) à la température ambiante pendant 2 heures.
- Ensuite, laisser incuber à l'avidine-peroxydase (1: 500) à la température ambiante pendant 1 heure, puis dans de cobalt et de diamino-benzidine de nickel intensifié (0,5 mg / ml) à la température ambiante pendant 18 à 20 min; pour le dernier 5/3 min d'incubation de la diamino-benzidine ajouter du peroxyde d'hydrogène (0,01%) pour catalyser la précipitation chromogène. Laver les sections trois fois pendant 10 minutes chacune dans du PBS avant, après, et entre chacune des étapes ci-dessus.
- Montez les sections sur des lames de microscope gélatinisées, l'air de les sécher, puis Nissl tache (rouge neutre), déshydrater dans l'alcool, clair (X-3B), et lamelle.
- Estimer le nombre total de neurones TH + et TH- SNC (LC et VTA) et en utilisant des méthodes stéréologiques impartiales. Assurez-vous que l'stereologist est aveugle au traitement reçu. Exclure glie sur la base du diamètre de soma <5 um et compter que les cellules avec un noyau visible.
- Identifier le SNC (et VTA et LC) par les emplacements spatiaux de cellules TH + et anatomiques Monuments / limites selon l'atlas du cerveau de Paxinos et Watson 7. Comptez TH + cellules dans un cadre de comptage (55 x 55 um = 3,025 um 2) à des intervalles prédéterminés réguliers (x = 140 um, y = 140 um pour SNC; x = 100 um, y = 100 um pour VTA et LC) tout au long de chaque noyau dans chaque quatrième section.
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Representative Results
Les souris adultes soumis à ces manipulations de l'environnement ont modifié nombre de mésencéphale (SNC et VTA), mais pas LC, neurones TH +, et EE plus perfusion mésencéphale concurrente soit picrotoxine ou bicuculline (GABA A antagonistes des récepteurs) abolit EE-induction de plus SNc TH + neurones. Ces données ont déjà été publiés dans les six. Les présentes données ont été compilées dans des expériences répétées effectuées dans le cadre de cette étude précédente, mais ne ont pas été publiés ailleurs.
Plus précisément, les souris mâles adultes qui ont été jumelés avec des souris femelles adultes ont plus de TH + SNC et VTA (mésencéphale) neurones que les hommes appariés avec des hommes, alors que les femelles accouplées avec des mâles ont moins TH + neurones SNc et VTA que les femelles appariés avec des femelles (figure 1 dans 6). Un autre exemple de cela est prévu ici à la figure 1, qui représente la moyenne ± SE nombre de neurones TH + SNC de souris mâles et femelles immédiatement following sexes appariement. Les mâles appariés avec des femelles pendant 7 jours ont environ 12% de plus de TH + SNC neurones que les hommes appariés avec des hommes (deux colonnes bleues dans la figure 1). En revanche, les femelles accouplées avec des mâles ont environ 12% moins de TH + SNC neurones que les femelles accouplées avec des femelles (deux colonnes rouges dans la figure 1).
Le nombre de neurones TH + SNC et VTA augmente également chez les souris mâles adultes soumis à EE (Figure 2 à 6), et EE-induction de la suite SNC neurones TH + est abolie par le blocage simultané de mésencéphale récepteurs GABA A (figure 3 à 6). Un autre exemple de cela est prévu ici à la figure 2, où EE perfusion avec des véhicules a abouti à environ 14% de plus de neurones TH + SNC que SH avec perfusion du véhicule (deux colonnes de gauche de la figure 2). Cependant, avec EE GABA A infusion antagoniste des récepteurs (soit 10 pM ou 5 picrotoxine1; M bicuculline) complètement aboli cette augmentation (deux colonnes de droite de la figure 2). Remarque, ces données proviennent de la controlatéral SNc à la canule de perfusion, et sont presque identiques aux effets observés dans le SNc ipsilatéral qui ont été rapportés dans les six.
Figure 1:. Effets de genre appariement sur le nombre de SNC TH + neurones Immédiatement après sept jours d'appariement entre les sexes (protocole 1.1) souris adultes ont été perfusés (3,1), leur mésencéphale a été sectionné (3,2), les sections ont été traitées pour la tyrosine hydroxylase (TH , ont été estimés enzyme limitant la vitesse dans la synthèse DA) de l'immunohistochimie (3,3), et le nombre de neurones TH + SNC utilisant stéréologie (3,4). Représentés sont la moyenne ± SE nombre de SNC neurones TH + chez les souris mâles appariés avec des souris mâles (n = 4 souris mâles à partir de n = 2 paires de mâles-mâle, col bleu clairUMN), les hommes jumelé avec les femmes (n = 6 souris mâles de 6 paires hommes-femmes, colonnes bleu foncé), les femelles accouplées avec des femelles (n = 8 souris femelles à partir de n = 4 paires femelle-femelle, colonne rouge clair), et les femelles accouplées avec des mâles (n = 6 souris femelles de n paires = 6 hommes-femmes, la colonne rouge foncé). Jumelage avec le sexe opposé est traduite par une augmentation du nombre de SNC TH + neurones chez les hommes, mais une diminution du nombre de SNC neurones TH + chez les femmes (p <0,001 L'analyse de variance; * p <0,05 Tukey multiples comparaisons par paires).
Figure 2: Effets de l'enrichissement de l'environnement avec GABA mésencéphale Un blocage des récepteurs sur le nombre de SNC neurones TH + Immédiatement après 14 jours d'enrichissement de l'environnement (protocole 1.2) avec une perfusion simultanée de deux véhicules, le GABA A antagoniste des récepteurs p.icrotoxin (10 uM), ou GABA A antagoniste du récepteur de la bicuculline (5 uM) dans le mésencéphale gauche (protocole 2), les souris mâles adultes ont été perfusées (3,1), leur mésencéphale a été sectionné (3.2), les coupes ont été traitées pour la tyrosine hydroxylase ( TH, l'enzyme limitant la vitesse dans la synthèse DA) immunohistochimie (3,3), et le nombre de neurones TH + dans le droit (controlatéral) SNc ont été estimées en utilisant stéréologie (3,4). Représentés sont la moyenne ± nombre SE de SNC neurones TH + de la norme logé (SH) de souris mâles avec une perfusion de véhicule (n = 6, la colonne bleu clair), l'environnement enrichi (EE) Hommes ayant perfusion du véhicule (n = 6, premier bleu foncé colonne), EE mâles avec Picrotoxine perfusion (n = 6, deuxième colonne bleu foncé), et les mâles d'EE avec bicuculline perfusion (n = 6, troisième colonne bleu foncé). EE a entraîné une augmentation du nombre de SNC TH + neurones, mais cela a été aboli par infusion de picrotoxine ou bicuculline dans le mésencéphale controlatéral (p <0,001 L'analyse de variance; * P <0,001 Tukey multiples comparaisons par paires).
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Discussion
Manipulations de l'environnement
La motivation derrière la conception de ces manipulations de l'environnement (d'appariement entre les sexes et d'enrichissement de l'environnement) était de déterminer si l'environnement, et / ou le comportement suscité par l'environnement, est associée à des changements dans le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale. L'accent est donc sur la fourniture d'environnements et de stimuler des comportements qui sont susceptibles de se engager signalisation DA mésencéphale. Ce jumelage inclus avec le sexe opposé, et l'enrichissement de l'environnement comprenant l'accès à l'exécution de roues, des cordes, des échelles, des tunnels et des objets à explorer, jouer, grimper, se cacher, et le nid. Ces deux environnements devrait favoriser les comportements cognitifs, émotionnels et moteurs récompense-motivés, qui ont été associés à des augmentations de courte durée dans la décharge neuronale mésencéphale DA et la libération de DA (par exemple 8). Notre hypothèse est qu'ils sont également associés à des changements plus durables dans le mésencéphale DA br signalisationdevrait par des changements dans le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale. Ici et ailleurs 6, la preuve est présentée que ce est effectivement le cas.
Nos enquêtes ont commencé à utiliser le protocole de jumelage entre les sexes (1,1), car il comprend un comportement du cœur primitive et essentielle récompense motivés (ce est à dire la copulation). En outre, la reproduction, l'union monogame, et les comportements sociaux sont connus pour induire des changements analogues dans d'autres systèmes neurochimiques (par exemple changements dans la densité de l'ocytocine, la vasopressine et les cellules de l'hormone de libération de corticotrophine dans l'hypothalamus 9). En effet, après sept jours d'appariement continu avec le sexe opposé, nous montrons ici et d'ailleurs 6 que les hommes ont environ 10% de plus TH + neurones du mésencéphale tandis que les femmes ont environ 10% de moins TH + neurones du mésencéphale [Note: Ces effets comprennent SNC (présente étude et 6) VTA et 6, mais pas le locus coeruleus 6, où TH permet de synthétiser la noradrénaline].Cela soutient l'idée que le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale dans le cerveau adulte ne est pas fixe, mais des changements en fonction des interactions entre l'environnement, le comportement, ou de l'environnement / comportement. Autres preuves soutient ces changements sont provoqués par des changements dans l'expression du gène et de la protéine TH dans les neurones du mésencéphale existants, par opposition à la neurogenèse DA ou la dégénérescence. (1) DA neurogenèse dans le mésencéphale de souris adulte se soit pas du tout de 10 à 14, ou à des taux beaucoup plus faibles que ce qui peut rendre compte de l'ajout d'environ 500 nouveaux neurones SNc DA en une semaine 15,16. (2) Études quantifier les changements du nombre de neurones SNc suivantes deux semaines perfusions de divers médicaments ciblant l'activité électrique des neurones du mésencéphale ont constamment révélé des changements égales (à nouveau environ 10%), mais opposées cellules TH + et TH, ne entraînant aucun changement net dans le total de 4,5 du nombre de cellules. Cela est compatible avec la régulation des taux de protéine TH au-dessus ou au-dessous immunohistochimique detectable niveaux sans addition ou soustraction des neurones. (3) De nombreuses études ont signalé des changements dépendants de l'activité dans le gène TH et l'expression des protéines dans les cellules sur une échelle de temps de plusieurs heures de 17 à 23, et même a été rapportée chez 4 mésencéphale.
La question se pose donc quels sont les mécanismes sous-jacents changements dans l'expression du gène et de la protéine TH dans les neurones du mésencéphale existantes. Les possibilités incluent des stéroïdes sexuels, qui peuvent sous-tendre à la fois les différences de base dans nombre de neurones TH + mésencéphale chez les mâles et les femelles, ainsi que des changements sexospécifiques (augmentation chez les hommes et chez les femmes) diminue suivantes appariement rapportée ici et auparavant 6. Une autre possibilité est la régulation dépendant de l'activité d'expression TH. SNc neurones et VTA (DA et au non-DA) reçoivent entrée synaptique principalement du striatum, l'hypothalamus, le noyau sous-thalamique, et frontal cortex 24. Dans le cadre de l'appariement entre les sexes, ces entréespourrait être réglementé par le comportement sensori-moteur, l'olfaction, les phéromones, le stress, le métabolisme ou la reproduction. régulation dépendant de l'activité d'expression TH pourrait être médié via calcium ou de signalisation de neuropeptide affectant les voies gène et expression de la protéine (par exemple 1).
Pour aider à distinguer les stéroïdes sexuels contre des mécanismes dépendants de l'activité sous-jacents aux effets du sexe appariement sur le nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale nous employer le protocole d'enrichissement de l'environnement (1,2), qui mieux lutter contre l'influence potentielle des stéroïdes sexuels et peut-être aussi d'autres hormones ( par exemple, des phéromones, le stress, la reproduction), et de l'influence potentielle de l'activité neuronale conduit afférente. Le facteur pertinent ici, ce est les différents groupes étaient beaucoup plus semblables en termes de genre (tous les hommes), les hormones, le statut social et le stress. Bien que le statut social et le stress peuvent encore différer entre les groupes (par exemple, un homme plus dominant et agressifdans un groupe), il est peu probable que ce soit toujours le même groupe (par exemple, EE), et les effets de EE ont maintenant été reproduit plusieurs fois six. En EE, l'ampleur de l'augmentation de TH mésencéphale + neurones était le même que dans le protocole de jumelage entre les sexes (comparer les hommes dans les figures 1 et 2 présente étude, et les figures 1 et 2 sur 6). En outre, l'augmentation induite par EE-SNC neurones TH + induits par l'enrichissement de l'environnement a été complètement abolie par le blocage simultané du mésencéphale récepteurs GABA A (figure 2 présente étude et la figure 3 sur 6), qui fournissent environ 70% de toutes les entrées afférente à mésencéphale DA 25 neurones. Ensemble, ces données indiquent l'activité neuronale conduit afférente est au moins aussi puissant une influence sur le nombre de neurones du mésencéphale DA que les hormones.
Un autre éclairage sur l'environnement factors régissant le nombre de neurones TH + mésencéphale vient de comparer les effets de RW et EE. RW comprend une activité motrice bien appris ou banale (en cours d'exécution sur les roues), tandis que EE comprend une quantité similaire de cette activité, bien que de plus grande variété (c.-à divers jouets, mais inchangée tout au long des 14 jours), plus l'exposition continue à de nouveaux jouets le composant SE (1.2.4). Nos données publiées précédemment six révélé aucun ou de faibles augmentations dans les neurones SNc et VTA TH + RW en rapport à des souris SH, mais beaucoup plus grandes augmentations de EE (+ SE) souris. Cela met en évidence la stimulation sensorielle, la cognition, la nouveauté et / ou de l'apprentissage et de la mémoire en tant que régulateurs plus puissants du nombre de neurones dopaminergiques du mésencéphale que l'activité physique banal seul.
EE a été largement utilisée pour induire des effets thérapeutiques et améliorer la réparation du cerveau dans différents modèles animaux de troubles du cerveau, comme la maladie d'Alzheimer, la chorée de Huntington et la maladie de Parkinson 26. Le nature de ces manipulations de l'environnement, ce est qu'ils varient considérablement entre les laboratoires (comme le font les conditions «standard logés»), mais il ya des aspects clés de protocoles d'EE qui sont remarquables et ont été discutés précédemment 27. EE permet d'accroître la nouveauté et de la complexité de l'environnement par rapport à un logement standard, de manière à améliorer les niveaux de stimulation sensorielle, l'activité cognitive et l'exercice physique. Dans la conception d'expériences d'EE, il faut tenir compte de facteurs éthologiques, y compris les capacités sensorielles et cognitives des animaux et de leurs tendances instinctives. Comme les souris et les rats () sont nocturnes, avec des capacités visuelles inférieures à l'homme mais excellente somatosensoriel et acuités olfactifs, les objets d'enrichissement devraient refléter les instincts innés et les capacités des animaux de laboratoire. Par conséquent, ce est la nouveauté, la forme, la texture et l'odeur des objets qui peuvent être particulièrement saillant à des souris. Les évaluations de la force relative de la moti de rongeursvations pour une variété d'objets d'enrichissement ont conduit à des recommandations pour l'inclusion des objets à croquer pour permettre la possibilité d'exercer, typiques de l'espèce comportements fondamentaux 28,29. La fourniture de matériel de nidification est considéré comme un élément fondamental du protocole d'enrichissement et de souris instinctivement arracher tous les objets en papier ou en carton, offrant ainsi l'occasion pour les activités sensorielles, cognitives et motrices 30,31. Il est important aussi que dans une expérience avec plusieurs cages d'EE, la nouveauté et la complexité équivalente d'objets sont fournis, afin de minimiser la variance au sein du groupe de EE, et le contrôle des paramètres environnementaux similaire devrait être exercée pour le groupe SH. Idéalement, le nombre de souris par cage devraient être les mêmes entre EE et les groupes SH (à moins que les effets de la taille de groupe social sont spécifiquement étudiés), et pas de «friandises» devrait être utilisé en EE, que toutes les différences alimentaires entre les groupes pourrait confondre til interprétation des effets de l'activité cognitive et l'exercice physique améliore EE 12. Autres considérations clés sont la durée d'exposition à un environnement enrichi et l'âge auquel commence l'enrichissement. Bien que l'expression différentielle des gènes a été montré après seulement trois heures dans un environnement enrichi 32, les périodes d'exposition plus longues peuvent être nécessaires pour des changements structurels et fonctionnels pour produire 33,34. En outre, la plasticité induite par l'enrichissement peut être améliorée pendant les périodes critiques du développement postnatal 35.
Et la pompe de perfusion cérébrale osmotiques implants de canule pour infusion de médicaments
Les pompes osmotiques et canule implants sont très efficaces pour délivrer des médicaments directement dans le cerveau. Avec l'expérience, la chirurgie d'implant dure environ 1 h par la souris. Acrylique dentaire seul est suffisant pour fixer la canule en place pendant des périodes prolongées (Note: Nous sommes allés jusqu'à 28 jours à l'oexpériences ther); il n'y a pas besoin de pièces de fixation supplémentaires, telles que des vis à os. Il est important de se assurer il ya beaucoup de mou dans le tube reliant la pompe et la canule pour permettre tête maximale et la flexion du cou sans mettre trop de stress sur les connexions. Cela est particulièrement vrai pour les perfusions à long terme, où la croissance du tissu conjonctif autour de la pompe peut ancrer en place, réduisant ainsi la flexibilité de l'implant. Lorsque cela est possible, les souris sont également hébergés individuellement après une chirurgie pour empêcher colocataires endommager l'implant à travers rayer, tirer ou mordre. La dose de médicament est largement déterminée par la quantité ajoutée à la pompe. Cependant, à cet égard, l'attention doit également être accordée à la vitesse d'écoulement de la pompe, la stabilité chimique du médicament à 37 ° C, et la vitesse de diffusion du médicament à partir de la canule à travers le cerveau. Actuellement pompes disponibles de notre fournisseur peuvent maintenir perfusion jusqu'à six semaines à un débit de 0,15 ul / h; le jeûneis disponibles débit est de 10 ul / h, mais durable pour seulement 1 semaine. Plus de temps de perfusion peuvent être atteints en effectuant des chirurgies mineures supplémentaires pour remplacer les pompes appauvri ayant pompes pleins à l'arrière du tube de liaison (ce est à dire sans perturber la canule implantée). L'étendue spatiale de bleu de méthylène (1% de bleu de méthylène, MW 320, dans 0,9% de NaCl) diffusion à partir d'une extrémité de la canule implantée 0,3 mm au-dessus du mi-chemin SNc gauche le long de son côté médio-latérale a été mesurée pour se étendre depuis le bord latéral du mésencéphale juste mediolaterally travers la ligne médiane, et dans toute l'étendue dorso-ventrale du mésencéphale (après 2 semaines de perfusion). Ce est beaucoup plus répandue que un petit noyau comme SNC, et la propagation de médicament peut être plus grand (ou plus petit) en fonction de son MW, stabilité chimique, tampon, etc. En effet, on peut déduire à partir des données actuelles (Figure 2) deux picrotoxine et bicuculline atteint le SNc controlatérale chez concentrations d biologiquement activeons.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
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