Isolering av individuelle dopaminneuroner eller ventral tegmentale område med direkte eller indirekte immunhistokjemi er demonstrert ved hjelp av laser capture mikrodisseksjon. Parametere for isolering av vev fra en glassplate ved hjelp av en infrarød laser og fra membranplater under anvendelse av en kombinasjon av en infrarød og ultrafiolett laser blir diskutert.
Laser fangst mikrodisseksjon (LCM) brukes til å isolere en konsentrert populasjon av individuelle celler eller presise anatomiske regioner av vev fra vevssnitt på et objektglass. Når det kombineres med immunhistokjemi, kan LCM brukes til å isolere enkelte celletyper basert på et bestemt protein markør. Her blir LCM teknikken beskrevet for oppsamling av en bestemt populasjon av dopaminneuroner direkte merket med tyrosinhydroksylase immunhistokjemi og for isolering av det dopamin-neuron inneholdende regionen i det ventrale tegmentale område ved hjelp av indirekte tyrosinhydroksylase immunhistokjemi på et avsnitt ved siden av de som brukes for LCM. Et infrarødt (IR) fangst laser brukes til både dissekere enkelte nevroner samt ventral tegmentale området utenfor glassplater og på en LCM cap for analyse. Komplett dehydrering av vevet med 100% etanol og xylen er kritisk. Kombinasjonen av IR-fangst laser og ultrafiolett (UV) cutting laser brukes til å isolere enkelt dopaminneuroner eller ventral tegmentale området når du bruker PEN membran lysbilder. En PEN membran slide har betydelige fordeler over et glass lysbilde som det gir bedre konsistens i å fange og samle celler, er raskere å samle inn store biter av vev, er mindre avhengige av dehydrering og resultater i fullstendig fjerning av vev fra raset. Selv om fjerning av store områder av vev fra en glassplate som er mulig, er det betydelig mer tidkrevende og ofte etterlater noen rester av vev bak. Data som er vist her viser at RNA av tilstrekkelig mengde og kvalitet kan oppnås ved hjelp av disse prosedyrer for kvantitative målinger PCR. Selv om RNA og DNA er de mest isolerte molekyler fra vev og celler samlet inn med LCM, isolasjon og måling av mikroRNA, protein og epigenetiske forandringer i DNA kan også dra nytte av forbedret anatomisk og cellulær oppløsning oppnådd ved bruk av LCM.
Alle vev består av en heterozygot populasjon av celler. Dette er spesielt relevant for hjernevev, som består av forskjellige morfologisk og / eller neurochemically forskjellige neuroner omgitt av ulike typer av gliaceller (oligodendrocytter, astrocytter og microglia). I tillegg er forskjellige regioner i hjernen, slik som områder av hjernebarken eller hjernestammen kjerner, har bestemte funksjoner. Derfor er evnen til å isolere spesifikke populasjoner av celler eller svært små anatomisk forskjellige områder, når de kombineres med analytiske teknikker (dvs. Q-PCR, mikromatriser, RNA-sekvensering, og proteomikk), kan betydelig forbedre forståelsen av forskjellige biologiske prosesser. LCM er en teknologi som gir mulighet for å isolere meget diskrete anatomiske områder eller spesifikke celler fra vev på et objektglass som gir et mye mer homogen kilde for ytterligere analyse av diverse molekyler, slik som RNA, mikroRNA, DNA og proteiner.
t "> Siden LCM først ble introdusert, har flere forskjellige tilnærminger blitt brukt til å microdissect celler fra vev 1-3. De tidligste metoder inkludert direkte binding av vev på et objektglass ved hjelp av en infrarød (IR) laser og en termoplastisk film, og et ikke- kontaktmetode ved bruk av en ultrafiolett (UV) skjære laser for å løsne en celle eller vev og samling inn i et rør. Deretter har LCM blitt brukt på en rekke forskjellige vev og celletyper og vist å være kompatibel med isolering av forskjellige molekyler for genetisk analyse inkludert RNA, mikroRNA, DNA og proteiner, inkludert enzymatisk aktivitet 1,4-7. Her LCM er demonstrert ved hjelp av en LCM system som bruker en cutting UV laser og en fange IR laser for å kutte rundt celler eller vev og knytter den til en LCM lokket, henholdsvis. Dette LCM-systemet bruker både IR fangst laser for å smelte en plastfilm på en hette over cellen eller vevet av interesse som festes cellene til plastfilmen og fjerner den fra tHan vev med fjerning av hetten (figur 1). I tillegg, i kombinasjon med den infrarøde laser, er en UV-laser tilgjengelig for å skjære ut vev eller celler av interesse fra vev som er montert på objektglass med en membran og deretter isolert ved å feste til vev LCM hetten ved hjelp av IR-laser (figur 2). En kort oversikt over disse metoder finnes i figurene 1 og 2.Flere variasjoner av denne teknikken er beskrevet i enten isolere spesifikke celler ved hjelp av direkte fluorescerende immunhistokjemi og en indirekte immunhistokjemi styrt teknikk som brukes for isolering av en region av vev basert på ekspresjonen av et spesifikt protein. Nærmere bestemt, er isoleringen av dopamin-neuroner fra substantia nigra og isolering av det ventrale tegmentale område og den påfølgende isolering av RNA fra ferske, frosne hjernevev vist. Når RNA er den mest labile av molekyler målt (i forhold til DNA eller protein), steps å bidra til å bevare RNA integritet er inkludert og data vises på kvantitet og kvalitet av RNA oppnådd.
LCM er en kraftfull teknikk for disseksjon av adskilte populasjoner av celler eller områder av vev fra vevssnitt på et objektglass, og den påfølgende isolering av RNA, mikroRNA, DNA og proteiner. Bruken av LCM i kombinasjon med analyse ved hjelp av høy-throughput teknologier som microarray, neste generasjon RNA-sekvensering, epigenetisk analyse av DNA og proteomforskning blir mer og mer vanlig da følsomheten av disse teknikkene øker og mengden av utgangsmateriale som trengs blir redusert 8-12. Med LCM, er en bedre anatomisk oppløsning oppnådd for en prøve, og forståelsen fra nedstrøms tiltak av disse prøvene er kraftig forbedret. En påminnelse med LCM er at den gir en konsentrert prøve av celler av interesse, men ikke nødvendigvis en ren populasjon av celler. Grensene for presisjons betyr at det vil bli en viss forurensning fra tilstøtende vev. Men gjør denne teknikken konsentrere cellene av interessefor å minimalisere effekter forbundet med omgivende vev og celler og maksimere de eksperimentelle effekter på cellene av interesse.
Direkte versus indirekte Immunohistokjemi
Siden LCM er for tiden anvendes hovedsakelig for isolering og måling av RNA, holde intakt RNA er et meget viktig kriterium. Opprettholdelse RNA integritet er hoved begrunnelsen bak bruken av indirekte immunhistokjemi for å lede vev disseksjon som fjerner nødvendigheten av å sette flekker vevet direkte som kan nedbryte RNA (figur 10). Når den eksperimentelle spørsmålet imidlertid krever isolering av en spesifikk populasjon av celler, så som dopamin-neuroner, er direkte fluorescerende immunhistokjemi nødvendig. Ved hjelp av en hurtig immunhistokjemi merking protokollen kan minimalisere degradering av RNA under prosedyren. De korte inkubasjonstider er på grunn av anvendelsen av høye konsentrasjoner av primær og sekundær antiorganer, konsentrasjoner som er rundt 10-20 ganger høyere enn det som er nødvendig for konvensjonell immunhistokjemi med en 2 timers inkubasjon. Hvis derimot, er lengre inkubasjonstid nødvendig, Brown og Smith brukte høye salt buffere for å hemme RNA degradering og få god kvalitet RNA med lange inkubasjonstid (opptil 20 timer) 13. Denne fremgangsmåten kan også brukes hvis det er betydelig tid som er nødvendig mellom merking av vev og få tilgang til et system LCM.
Valget av lysbilder – PEN-membran, silan-prep og ubestrøket glassplater
Bruken av ubelagte glassplater for LCM er blitt rapportert 14. I vårt laboratorium har Silan-prep lysbilder blitt funnet å være et optimalt valg, da dette belegg settes tilstrekkelig vevet til sleiden for immunhistokjemi uten tap av vev, men likevel gjør det mulig for feste av vevet til LCM caps og fjerning fra sleiden . Ubestrøket glassplater harviste noen vev tap med immunhistokjemi prosedyren. Hvis indirekte immunhistokjemi er brukt, men blir vevet oppbevaring mindre av et problem. Med riktig dehydrering, fange celler eller vev av av silan-prep lysbilder har ikke vært et problem. Hver av de ulike tilnærminger til å isolere nevroner eller områder av hjernen som er beskrevet i denne artikkelen har fordeler og ulemper. For isolering av de enkelte dopaminneuroner, har bruken av Silan-prep lysbilder fordelen av bedre optikk og er mindre kostbart enn de PEN membran lysbilder. Ulempen er at noen ganger fange celler kan være vanskelig hvis det ikke er tilstrekkelig dehydrering (se nedenfor) og noen vev kan stå på lysbildet. Fordelen av pennen membraner lysbilder er at ved å bruke en kombinasjon av IR-laser og UV-laser sikrer at dopaminneuroner vil bli oppsamlet. Unnlatelse av å samle celler fra en penn membran lysbilder nesten aldri forekommer, da det er mindre avhengig av dehydrering enn glassplater. En ytterligere fordel er at den UV-laser kan anvendes for nærmere å tilnærme formen av neuroner av interesse, sammenlignet med en sirkel for å fange neuroner av av glassplater med IR-laser. For isolering av regioner av vev, pennen membran lysbildene er langt overlegen og rettferdiggjøre den ekstra kostnaden. Dette resulterer i fullstendig fjerning av alt vev skåret ut på membranen, er mye raskere enn å fange opp et stort område av vev ved bruk av IR-laser alene og tykkere vevssnitt kan samles. Bare ved hjelp av IR-laseren krever at LCM hetten membranen er helt smeltet over hele vevsområdet. I tillegg er ufullstendig samling av vevet typisk og vanligvis krever flere forsøk. Selv om dette tar lengre tid enn å isolere vev fra PEN membran slide, hvis den tilgjengelige vev er allerede på et objektglass eller en UV-laser ikke er tilgjengelig, dette er et levedyktig alternativ i de fleste vev kan oppsamles (fig 8J).
ove_content "> Kritiske trinnDe 100% etanol inkubasjoner er en av de viktigste trinnene. For å samle celler fra Silan-prep slides kreves fullstendig dehydrering av vev. Derfor vil en hvilken som helst vann ikke fjernes, noe som er forbundet hovedsakelig med 100% etanol inkubering, påvirke evnen til å plukke opp celler fra skinnene. For å løse dette problemet, ofte endre de 100% etanol løsninger som absorpsjon av vann fra luften eller overføring fra tidligere vasketrinn kan påvirke dehydrering. I tillegg er molekylsikter anvendes for å absorbere noe vann forurensning. LCM-systemet bør ideelt sett være plassert i et lite rom med en avfukter for å opprettholde lav luftfuktighet.
Gode kryostatsnitt er avgjørende for riktig LCM. Seksjoner må være flat med folder i vev minimaliseres. Folder i vev vil øke avstanden mellom LCM lokket og hindre den fra å kontakte than vev. Det blir da vanskelig å smelte tilstrekkelig membranhetten på vevet. For glassplater, typisk seksjon tykkelse må være mellom 6 og 12 mikrometer. Tykkere seksjoner kan fanges med pennen membran lysbilder.
LCM tilbyr en teknisk kapasitet til å gjøre svært presise disseksjoner av vev og celler fra objektglass. Dette øker dramatisk oppløsningen av videre analyse i forhold til brutto disseksjon av vev stykker. Selv, LCM kan være tids- og arbeidskrevende, krever det ikke omfattende opplæring eller kompetanse og, når kombinert med andre high-throughput teknologier, kan i stor grad forbedre forståelsen av en biologisk prosess når diskrete celler eller anatomiske regioner blir brukt.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Institute of Mental Health (1R15MH084209 – 01A1), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R21NS058375-01A2) and the National Science Foundation (DBI0723080 07070646).
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Numer | Comments |
Veritas Laser Capture Microdissection System | Life Technologies, Grand Island, NY | Newer model is now sold | |
CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0211 | |
CapSure HS LCM Caps | Life Technologies, Grand Island, NY | LCM0213 | |
PEN Membrane slides | Life Technologies, Grand Island, NY | s4651 | |
Silane prep-slides | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S4651 | |
95% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7148 | |
100% Ethanol-RNase Free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | |
Rnase Free Triton | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8787 | |
Molecular Sieve | EDM Millipore, Billerica, MA | MX1583D | |
Anti-Tyrosine hydroxyase antibody | EDM Millipore, Billerica, MA | Ab152 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies, Grand Island, NY | A-11008 | |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2939AA | |
Stratagene MX 3005P | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 401513 | |
Nanodrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ||
Quant-iT RiboGreen | Life Technologies, Grand Island, NY | R11490 | |
RNaseZap | Life Technologies, Grand Island, NY | AM9780 |