Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Dendroecological forskning bruker informasjon som er lagret i årringer å forstå hvordan enkelttrær og selv hele skogøkosystemer svart på miljøendringer og til slutt rekonstruere slike endringer. Dette gjøres ved å analysere vekstvariasjoner tilbake i tid og samkjøre ulike plantespesifikke parametre (for eksempel) temperaturrekorder. Integrering tre anatomiske parametre i disse analysene vil styrke rekonstruksjoner, helt ned til intra-årlig oppløsning. Vi derfor presentere en protokoll om hvordan å prøve, forberede og analysere tre eksemplar for vanlige makroskopiske analyser, men også for påfølgende mikroskopiske analyser. Videre kan vi innføre en potensiell løsning for å analysere digitale bilder generert fra vanlige små og store prøver å støtte tidsserieanalyser. Protokollen viser de grunnleggende trinn som de i dag kan anvendes. Utover dette, er det et stadig behov for forbedring av de eksisterende teknikker og utvikling av nye techniques, å registrere og kvantifisere tidligere og pågående miljøprosesser. Tradisjonelle tre anatomisk forskning må utvides til å omfatte økologisk informasjon til dette forskningsfeltet. Dette ville støtte dendro forskere som har tenkt å analysere nye parametere og utvikle nye metoder for å forstå de kortsiktige og langsiktige effekter av spesifikke miljøfaktorer på anatomi av treaktige planter.
Trær, samt busker, dvergbusker, og selv urter, viser manifold reaksjonsmønstrene knyttet til endringer i deres miljø. Disse mønstrene har vært gjenstand for botanikk og plantefysiologi siden midten av 19-tallet. Tilbake da, forskning på treaktige planter fokusert mest på trær og en beskrivende analyse av struktur og variasjon av årringer i en økologisk sammenheng en. Når Andrew Ellicott Douglass oppfant cross-dating teknikk for tre-ring forskning 2, var dette økologisk sammenheng mer eller mindre undertrykt av den nye muligheten til å nøyaktig dato tre funn i arkeologi. Cross-dating for første gang aktivert nøyaktig datering av årringer til kalenderåret, og er til nå betraktet som ryggraden i tre-ring forskning innen alle felt av sin søknad en.
Parallelt siden slutten av 19-tallet, tre anatomi utviklet seg til et viktig forskningsdisiplin forholderd til mange andre felt av naturlige og anvendt vitenskap tre. To hovedområder etableres: den systema tre anatomi, noe som er grunnlaget for identifisering av tre i arkeologiske 4, og den anvendte trevirke anatomi, relatert til tre-teknologi, fysiologi, patologi og økologi 3,5.
I tre-ring forskning, dendroecology i dag er definert som et emne som omfatter årringer relaterte studier som fokuserer på miljøundersøkelser som geomorphic prosesser (dendrogeomorphology), temperatur og nedbør rekonstruksjoner (dendroklimatologi), vannstandsendringer (dendrohydrology) eller bre svingninger ( dendroglaciology) 6. Som denne definisjonen indikerer, har årringer analyser blitt stadig viktigere innen dating og rekonstruere miljøprosesser som (i) siste klimaforhold ved å analysere årlige variasjoner i ring-bredde 7,8, tre tetthet 9 eller isotoper 10, eller (ii) than tilbakefall intervaller på geomorphic prosesser 11. Disse meget detaljerte studier om ringbreddevariasjoner og deres isotoper innhold demonstrere behovet for å analysere ringer i nærmere detalj, dvs, for å studere den anatomiske strukturen av ringene. Men detaljerte studier av tre anatomiske trekk innenfor årringene knyttet til miljøendringer er sjeldne 12,13. Selv om disse mikroskopiske funksjonene er kjent 14, har de sjelden blitt brukt på et mikroskopisk nivå til dendroecological forskning. Videre nøyaktig timing av disse vekstreaksjoner i naturlig dyrket trær, avgjørende for eksakte dating formål, har sjelden blitt dokumentert nylig 15.
Når det gjelder virkningene av den globale oppvarmingen 16, til forbedring av eksisterende og utvikling av nye teknikker registrere og kvantifisere tidligere og pågående miljøprosesser er nødvendig, spesielt når det gjelder klimapåvirkning forskning 11.Ved å utvide tradisjonelle tre anatomisk forskning til en økologisk basert trevirke anatomi 17, kan dendro forskerne analysere nye parametere og utvikle nye metoder for å forstå de kortsiktige og langsiktige effekter av spesifikke miljøfaktorer på anatomi av treaktige planter 18. Detaljert kunnskap om variasjoner i ulike celleparametere innenfor de enkelte ringene knyttet til spesifikke drivere (f.eks mekaniske krefter, klimavariasjoner) er den grunnleggende forutsetning for å forstå variasjonen i treet ring formasjon. Sammenlignet med vanlige ring bredde målinger, identifisere tre anatomiske varianter krever mer komplekse og omfattende forberedelse teknikker som krever mye arbeid og tid. Detaljerte prosedyrer for prøven skjæring, farging, og innstøping er fordeleren og er alltid avhengig av Målet med studien 19.
For makroskopisk analyse av ringbredde i bartrær eller strukturer for antall, størrelse eller distribution av skip i hardtre, overflaten av en prøve vanlig polert med fint slipepapir eller spesielle slipemaskiner 20. En ulempe med denne prosedyren er at fyllingen av de individuelle cellene med støv som hindrer ytterligere halvautomatisk mikroskopisk analyse 21. De beste resultatene for makroskopisk prøveopparbeidelse oppnås når prøveflate er kuttet ved hjelp av et barberblad eller en annen skarp kniv.
Mens for små prøver, barberblader er et perfekt verktøy; større prøver som kjerner krever skjæring av plane flater over hele omfanget av kjerner. I motsetning til sliping, blir cellene ikke er fylt med støv, noe som muliggjør ytterligere forberedelse for den etterfølgende bildeanalyse. Videre er den åpne cellelumen, de skal kutte cellevegger, og den plane overflate av hele prøven muliggjøre anvendelsen av høyfrekvent densitometri 22 til hele omfanget av kjernen. For bildeanalyser, overflaten av prøvene (cellevegger) kan farges ved hjelp av mørk blekk og de åpne celle lumen kan senere bli fylt med hvitt kritt for å øke kontrasten mellom celleveggen og lumen området 19,23. Dette ganske enkel teknikk gjør en grunnleggende makroskopisk vurdering av større cellestrukturer for fartøy størrelse målinger.
Disse teknikkene for skjæring av plane flater er tilstrekkelig for makroskopiske analyser. For en detaljert tre anatomiske (dvs. mikroskopisk) analyse, er overført lysmikroskopi den vanligste metoden anvendt i dendro vitenskaper. Xylem celler differensierer gjennom komplekse prosesser som omfatter celletype bestemmelse, celledeling, celledifferensiering, og programmert celledød 24. Siden timing og hastigheten som disse prosessene oppstår bestemme celle anatomiske egenskaper, kan miljøforhold som påvirker disse prosessene generere anatomiske avvik i ringstrukturen. Som en viktig forutsetning for disse analyseres, mikro seksjoner må være forberedt med en mikrotom 19. Når du forbereder prøver for seksjonering, er synligheten av tracheid eller fiberretningen avgjørende. Bruken av hånddrevet skyve mikrotomer er det anbefalt å kutte mikro seksjoner, fordi denne teknikk muliggjør høy kvalitet seksjoner som er nødvendig for bildeanalyse 19. Avhengig av den spesifikke ønske om en viss studie, blir mikro seksjoner skåret vinkelrett eller parallelt med den langsgående utstrekning av cellene. Disse delene er så fotografert under et mikroskop og celle dimensjoner målt ved hjelp av spesialisert bilde analyserer programvare.
Inntil nylig var muligheten til å forberede mikro seksjoner begrenset til små utvalgsstørrelser bare (ca. 1 cm x 1 cm). Dette er akseptabelt å analysere enkelthendelser som forstyrrelser i spesifikke år, men denne teknikken ikke tillater lengre tidsserie analyse er nødvendig for miljø rekonstruksjoner. Dette arbeidet kan bare innsed gjennom utvikling av nye, effektive og økonomiske forberedelse prosedyrer og analytiske teknikker. I de senere årene har medlemmene av tre-ring lab på Swiss Federal Institute WSL i Sveits startet intensivt arbeid på dette emnet. Som et resultat, har nye enheter og analyse teknikker blitt utviklet for å støtte tanken om å integrere tre anatomiske trekk til et bredt spekter av miljøforskningstemaer.
Utfordringene for en vellykket og bærekraftig integrering av tre anatomi inn dendroecological forskning er, bortsett fra manifold analytiske problemer, hovedsakelig på grunn av tekniske aspekter. Disse utfordringene varierer fra prinsippet prøvetaking tilnærminger til å skape høy kvalitet mikro seksjoner og deres påfølgende analyse 19.
Ved første øyekast, er sampling av kjerner eller plater en enkel fremgangsmåte som har vært kjent i mange år. Det er mange ting som kan gjøres galt og en liten unøyaktighet i prøvetaking kan resultere i alvorlige problemer under de påfølgende forberedelse og analysefasene. Små unøyaktigheter som for eksempel kjerneboring som er ikke akkurat vinkelrett stammeaksen eller bruke et ufullkomment skjerpet corer er ikke et problem hvis målet med studien er begrenset til å ringe-breddemålinger. Når imidlertid sikte på mikroskopisk analyse av prøvene, kan en feilaktig samplingsretningen føre optiske forvrengninger avcellevegger, mens bruken av butte corers resultater i mikrosprekker i kjernen. Som et resultat, når man prøver å skjære mikro seksjoner av disse kjerner, de tynne seksjoner bare falle fra hverandre, og et effektivt preparat ikke lenger er garantert. Det samme gjelder for mikrokjernetaking. En butt tupp vil resultere i høye trykk når puncher er hamret inn i stammeveden. Følgelig cambial lag vil bli komprimert. De cambial celler (figur 5) blir følgelig presset og kan ikke bli analysert.
Disc prøvetaking er faktisk den beste strategien når analysere vekstvariasjoner å relatere dem til miljøendringer. Dessverre er det rett og slett umulig å ta plater fra alle trær som skal tas prøver for videre analyser. Ikke desto mindre, spesielt i tilfelle av tropisk dendrochronology, blir en viss mengde stilk disker nødvendig i kombinasjon med tilvekst kjerner. Diskene brukes som en base for å definere ring grenser og for å støtte grenselinjenkaper definert basert på analyse av tilvekst kjerner 12,27,28.
Fordeler og ulemper med sliping versus skjæring blir hyppig diskutert 1,11,21. Som det er nevnt ovenfor, er den beste fremgangsmåten avhenger alltid av problemstilling og parametrene som skal analyseres (makroskopisk eller mikroskopisk). Hvis isotopiske eller kjemiske analyser er projisert i et ytterligere arbeidstrinn, er det av største viktighet at det slipende støv dannet ved sliping som kan fylles inn i cellen lumina over hele prøven, blir nøye fjernet ved støvsuging eller trykkluft.
Cutting mikro seksjoner er for alle mikroskopiske analyser den mest hensiktsmessige måten å forberede prøver for videre analyser. Først av alt, er den delen avskåret prøven, som deretter kan holdes uten kontaminering for potensielle videre analyser. Second disse delene tillate for høye målinger av encellede parametere oppløsning. Videre unngår den tidkrevende innstøpingTeknikken ved hjelp av en maismel-løsning 26 for å stabilisere celler som er en stor fordel i mikro snitting.
En ulempe med mikro seksjonering er fortsatt begrenset utvalgsstørrelse som resulterer i lange forberedelser ganger. For sanntid serie analyser gå tilbake i tid over århundrer eller årtusener, er det behov for å videreutvikle eksisterende skjære enheter 17,19, men også bildebehandling og analyse 18. Et første skritt i denne retningen er utviklingen av kjerne mikrotom 21, opprinnelig produsert for å kutte plane flater på kjerner (figur 1). Tidligere tester viste at evnen til å skjære mikro seksjoner av hele kjerner ved hjelp av denne enhet (figur 1).
Høykvalitets mikro seksjoner gi grunnleggende prinsipp for en effektiv bildeanalyse. Tar bildene under et mikroskop er en vanlig prosedyre 19, men deres effektiv analyse er fortsatt en oppgave som måskal videreutvikles 17. Alle eksisterende bildeanalysesystemer er semi-automatisk, det vil si, de trenger å være mer eller mindre intenst kontrollert av tekniker. I mange tilfeller bildene må rettes eller til nye bilder må gjøres for å forbedre kontrasten for en bedre registrering av strukturene av programvare uten å endre celleveggtykkelse innenfor bildet.
Spesialiserte verktøy for bildeanalyse som Roxas 18, WinCell eller spesifikke skript for ImageJ 29 er i stand til å gi grunnleggende anatomiske data som celle nummer, celle dimensjon, celleveggtykkelse og celle posisjon innenfor den årlige ring. Mange flere anatomiske beregninger som er relevante i en dendroecological sammenheng kan beregnes fra disse grunnleggende målinger som størrelse av de største rør, størrelsesfordeling av rørledninger, størrelse på vårveden eller den første raden av rørledninger, (optisk) tre tetthet, intra-årlig profiler av kanal størrelse og celleveggentykkelse, og gruppering mønstre av rørledninger (enslig, multipler, etc.).
Ved hjelp av programvaren Roxas 18, blir konturene av rør lumina (dvs. vann gjennomføre celle) og årlige ring grenser automatisk gjenkjent og visuelt representert som overlegg over originalbildet. Algoritmer for rørledninger er basert på farge, størrelse og form informasjon, algoritmer for ring grenser til den lokale konteksten av hver kanal. En verktøykasse tillater oss å manuelt forbedre disse resultatene ved direkte redigering av overlay-funksjonene, dvs. slette, legge til og endre ring grenser og rør skisserer. Etter redigering, den endelige data utgang, inkludert celleveggtykkelse (bartrær), blir automatisk generert og lagret i et regneark. Fullt automatiserte systemer er for øyeblikket ikke tilgjengelig, ikke engang for bartrær som viser en relativt enkel struktur, men dette er et mål for fremtidig utvikling. Dette vil sterkt støtte full integrasjon av tre anatomiske parametre i tidsserieanalyse.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |