Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.
Dendroecological forskning använder information lagrad i trädringar att förstå hur enskilda träd och till och med hela skogsekosystem svarade på miljöförändringar och för att slutligen rekonstruera sådana förändringar. Detta görs genom att analysera tillväxtvariationer tillbaka i tiden och korrelera olika anläggningsspecifika parametrar (till exempel) temperaturrekord. Integrera trä anatomiska parametrar i dessa analyser skulle stärka rekonstruktioner, även ner till inom årliga resolution. Vi presenterar därför ett protokoll om hur prov, förbereda och analysera trä exemplar för vanliga makroskopiska analyser, men också för efterföljande mikroskopiska analyser. Dessutom introducerar vi en potentiell lösning för att analysera digitala bilder som genereras från vanliga små och stora exemplar för att stödja tidsserier analyser. Protokollet presenteras de grundläggande stegen som de för närvarande kan användas. Utöver detta finns det ett fortsatt behov av förbättring av befintliga tekniker, och utveckling av nya techniques, för att spela in och kvantifiera tidigare och pågående miljöprocesser. Traditionella trä anatomiska forskningen måste utvidgas till att omfatta ekologisk upplysningar till detta forskningsområde. Detta skulle stödja dendrodata-forskare som avser att analysera nya parametrar och utveckla nya metoder för att förstå de kort- och långsiktiga effekter av specifika miljöfaktorer på anatomi vedartade växter.
Träd, liksom buskar, dvärg buskar, och till och med örter, visar mångfaldiga svarsmönster relaterade till förändringar i sin miljö. Dessa mönster har varit föremål för botanik och växtfysiologi sedan mitten av 19-talet. Då, forskning om vedartade växter fokuserade mest på träd och en beskrivande analys av struktur och variabilitet årsringarna på ett ekologiskt sammanhang 1. När Andrew Ellicott Douglass uppfann tvär dejting teknik för trädringforskning 2, var detta ekologiska sammanhang mer eller mindre undertryckta av den nya förmågan att exakt datum trä fynd i arkeologi. Cross-dating för första gången möjliggjort exakt datering av trädringar till kalenderår och fram till nu betraktas som ryggraden i trädring forskning inom alla områden av dess tillämpning 1.
Parallellt sedan slutet av 19th century, trä anatomi utvecklats till ett viktigt forskningsdisciplin relaterad till många andra områden av naturliga och tillämpad vetenskap 3. Två huvuddomäner upprättas: systematisk trä anatomi, vilket är grunden för att identifiera trä i arkeologi 4, och den tillämpade trä anatomi, relaterat till träteknik, fysiologi, patologi, och ekologi 3,5.
I trädringforskning, dendroecology numera definieras som ett ämne som omfattar trädringsrelaterade studier som fokuserar på miljöstudier såsom geomorphic processer (dendrogeomorphology), temperatur och nederbörd rekonstruktioner (Dendroklimatologi), förändringar vatten nivå (dendrohydrology) eller till och med glaciär fluktuationer ( dendroglaciology) 6. Eftersom denna definition visar, har trädringsanalyser blivit allt viktigare inom dejting och rekonstruera miljöprocesser, såsom (i) tidigare klimatförhållanden genom att analysera de årliga variationerna i ringbredd 7,8, trä tätheten 9 eller isotop 10, eller (ii) than återfall intervall geomorphic processer 11. Dessa mycket detaljerade studier om ringbredd variationer och deras isotopinnehåll visar behovet av att analysera ringar mer i detalj, det vill säga, för att studera den anatomiska strukturen av ringarna. Men detaljerade studier av trä anatomiska funktioner i årsringarna rör miljöförändringar är sällsynta 12,13. Även om dessa mikroskopiska särdrag är kända 14, har de sällan tillämpats på en mikroskopisk nivå till dendroecological forskning. Dessutom exakt timing av dessa tillväxtreaktioner i naturligt odlade träd, essentiella för exakta dateringen, har sällan dokumenterats nyligen 15.
När det gäller effekterna av den globala uppvärmningen 16, till att förbättra befintliga och utveckling av nya tekniker registrera och kvantifiera tidigare och pågående miljöprocesser krävs, särskilt när det gäller klimatpåverkan forskning 11.Genom att utöka traditionella trä anatomiska forskningen till en ekologiskt baserad trä anatomi 17, kan dendrodata-forskarna analysera nya parametrar och utveckla nya metoder för att förstå kort- och långsiktiga effekter av specifika miljöfaktorer på anatomi vedartade växter 18. Detaljerad kunskap om variationer i olika cellparametrar inom enskilda ringar relaterade till specifika drivrutiner (t.ex. mekaniska krafter, klimatvariationer) är det grundläggande kravet för att förstå variationen i trädet ringbildning. Jämfört med vanliga ringbredd mätningar, identifiera trä anatomiska variationer kräver mer komplexa och expansiva beredningstekniker som kräver en hel del arbete och tid. Detaljerade förfaranden för prov skärning, färgning, och inbäddning är många och är alltid beroende på syftet med studien 19.
För makroskopisk analys av ringbredd i barrträd eller ens strukturer för antal, storlek eller distribution fartyg i lövträd, är ytan av ett prov som vanligen poleras med fin slippapper eller special slipmaskiner 20. En nackdel med detta förfarande är fyllningen av de enskilda cellerna med damm som förhindrar ytterligare halvautomatiska mikroskopisk analys 21. De bästa resultaten för makroskopisk provberedning uppnås när provytan skärs med ett rakblad eller annat vass kniv.
Även för små prover, rakblad är ett perfekt verktyg; större prov som kärnor kräver styckning av plana ytor över hela omfattningen av kärnor. I motsats till slipning, är cellerna inte fylld med damm, vilket möjliggör ytterligare förberedelse för successiv bildanalys. Vidare, de öppna celllumen, de korrekt skurna cellväggarna och den plana ytan av hela provet möjliggöra tillämpning av högfrekventa densitometri 22 till hela omfattningen av kärnan. För bildanalyser, ytan av prover (cellväggar) kan färgas med mörka bläck och de öppna cell lumen kan därefter fyllas med vit krita för att öka kontrasten mellan cellväggen och lumen området 19,23. Denna ganska enkel teknik möjliggör en grundläggande makroskopisk bedömning av större cellstrukturer för fartygets storleksmätningar.
Dessa tekniker för att skära plana ytor är tillräckliga för makroskopiska analyser. För en detaljerad trä anatomisk (dvs mikroskopisk) -analys, är överförd Ijusmikroskopi den vanligaste metoden tillämpas i dendrodata vetenskaper. Xylem celler differentierar genom komplexa processer som omfattar celltyp beslutsamhet, celldelning, celldifferentiering och programmerad celldöd 24. Eftersom tidpunkten och hastigheten med vilken dessa processer sker bestämma cell anatomiska egenskaper, kan miljöförhållanden som påverkar dessa processer generera anatomiska avvikelser i ringstrukturen. Som en viktig förutsättning för dessa analyserars, mikro sektioner måste vara beredd med en mikrotom 19. När man förbereder prover för sektione, är avgörande synlighet trakeid eller fiberriktning. Användningen av handdriven glid mikrotomer rekommenderas att skära mikro sektioner eftersom denna teknik underlättar högkvalitativa sektioner som behövs för bildanalyser 19. Beroende på det specifika syftet med en viss studie är mikro sektioner skärs vinkelrätt eller parallellt med längd utsträckning av cellerna. Dessa avsnitt är sedan fotograferas under ett mikroskop och celldimensioner som mäts med specialiserad bild analyser mjukvara.
Tills nyligen var förmågan att förbereda mikro sektioner begränsad till små provstorlekar bara (ca 1 cm x 1 cm). Detta är acceptabelt att analysera enstaka händelser som rubbad specifika år, men denna teknik tillåter inte den förlängda tidsserieanalys behövs för miljö rekonstruktioner. Denna insats kan bara insed genom utveckling av nya, effektiva och ekonomiska förberedelser och analysmetoder. Under senare år har medlemmarna i trädring lab vid den schweiziska federala Research Institute WSL i Schweiz startade ett intensivt arbete i denna fråga. Som ett resultat har nya enheter och analysera tekniker utvecklats för att stödja tanken på att integrera trä anatomiska funktioner till ett brett spektrum av miljö forskningsområden.
Utmaningarna i en framgångsrik och hållbar integrering av trä anatomi i dendroecological forskning är, förutom handa analytiska problem, främst på grund av tekniska aspekter. Dessa utmaningar allt från principen provtagning metoder för att skapa högkvalitativa mikro sektioner och deras efterföljande analys 19.
Vid första anblicken är provtagning av kärnor eller ens skivor en enkel procedur som har varit känt i många år nu. Det finns många saker som kan göras fel och en liten felaktighet i provtagningen kan resultera i allvarliga problem under de efterföljande beredning och analysfaser. Små felaktigheter såsom coring som inte är exakt vinkelrät mot stam axel eller med hjälp av en ofullständigt vässad corer är inte en fråga om syftet med studien är begränsad till ring-breddmått. Men när siktar på mikroskopisk analys av proverna, kanske en felaktig provtagning riktning resultera i optiska snedvridningar avcellväggar, medan användningen av trubbiga corers resulterar i mikrosprickor i härden. Som ett resultat, när man försöker skära mikro sektioner av dessa kärnor, de tunna sektionerna bara faller isär och en effektiv förberedelse ej garanteras. Detsamma gäller för mikrokärnprovtagning. En trubbig spets kommer att resultera i höga tryck när puncheren hamras in i stamved. Följaktligen cambial skiktet kommer att komprimeras. De cambial celler (Figur 5) följaktligen pressas och kan inte analyseras.
Skiv provtagning är verkligen den bästa strategin när man analyserar tillväxtvariationer att relatera dem till miljöförändringar. Tyvärr är det helt enkelt omöjligt att ta skivor från alla träd som är avsedda att provtas för vidare analyser. Ändå, speciellt i fall av tropiska dendrokronologi, behövs en viss mängd av stjälk diskar i kombination med tillväxtkärnor. Skivorna används som en bas för att definiera ringgränserna och för att detta skall stödja boundartalet definieras utifrån att analysera tillväxtkärnor 12,27,28.
För- och nackdelar med slipning kontra skärning ofta diskuteras 1,11,21. Som det nämns ovan, det bästa förfarandet beror alltid på frågeställningen och de parametrar som skall analyseras (makroskopisk eller mikroskopisk). Om isotop eller kemiska analyser projiceras i ett ytterligare arbetssteg, är det av yttersta vikt att slipdamm skapas genom slipning som kan fylla i cell lumina över hela provet, försiktigt avlägsnas genom dammsugning eller tryckluft.
Cutting mikro sektioner är för alla mikroskopiska analyser det lämpligaste sättet att förbereda prover för vidare analyser. Först av allt, är det avsnitt avskuren provet, som sedan kan hållas utan föroreningar för eventuella ytterligare analyser. Andra dessa avsnitt möjliggör högupplösta mätningar av encelliga parametrar. Vidare undviker den tidsödande inbäddningteknik med hjälp av en majsstärkelse lösning 26 för att stabilisera cellerna är en stor fördel i mikrosektione.
En nackdel med mikrosektione är fortfarande begränsade urvalet resulterar i långa förberedelsetider. På riktigt tidsserier analyser gå tillbaka i tiden under århundraden eller tom årtusenden, det finns ett behov av att vidareutveckla befintliga skäranordningar 17,19, men också bildbehandling och analys 18. Ett första steg i denna riktning är att utveckla kärn mikrotom 21, ursprungligen tillverkad för att skära plana ytor på kärnor (Figur 1). Nya tester visade förmågan att skära mikro sektioner av hela kärnor som använder den här enheten (figur 1).
Högkvalitativa mikro sektioner fastställa grundläggande principer för en effektiv bildanalys. Med bilderna i mikroskop är ett vanligt förfarande 19, men deras effektiv analys är fortfarande en uppgift som behöverutvecklas ytterligare 17. Alla befintliga bildanalysutrustningen är halvautomatisk, dvs., de måste vara mer eller mindre intensivt kontrolleras av teknikern. I många fall, bilderna måste korrigeras eller ens nya bilder måste göras för att öka kontrasten för en bättre registrering av strukturerna av programvaran utan att ändra cellväggtjocklek i bilden.
Specialiserade bildanalys verktyg som Roxas 18, WinCell eller särskilda skript för ImageJ 29 möjlighet att erbjuda grundläggande anatomiska data såsom cellantal, celldimension, cellväggtjocklek och cell position inom årsring. Många ytterligare anatomiska mått som är relevanta i ett dendroecological sammanhang kan beräknas från dessa grundläggande mätningar som storleken på de största kanalerna, storleksfördelning av ledningar, storlek earlywood eller den första raden i ledningar, (optisk) trä densitet, intra årig profiler av ledningsstorlek och cellväggentjocklek, och gruppering mönster ledningar (solitära, multiplar, etc.).
Med hjälp av programvaran Roxas 18, är konturerna av lednings lumina (dvs vatten genomför cell) och årliga ringgränserna automatiskt igen och visuellt representerade som överlägg över originalbilden. Detekteringsalgoritmer för ledningar är baserade på färg, storlek och form informationen, detekteringsalgoritmer för ring gränsar det lokala sammanhanget för varje kanal. En verktygslåda ger oss möjlighet att manuellt förbättra dessa resultat genom att direkt redigera overlay funktioner, dvs ta bort, lägga till och ändra ringgränser och lednings konturer. Efter redigering, den sista datautgång, inklusive cellväggtjocklek (barrträd), automatiskt genereras och sparas i ett kalkylblad. Fullt automatiserade system finns inte tillgängliga, inte ens för barrträd som visar en relativt enkel struktur, men detta är ett mål för den framtida utvecklingen. Detta skulle starkt stödja full integration av trä anatomiska parametrar i tidsserieanalyser.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Zürich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.
Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |