Abstract
Dendroekolojik araştırma tek ağaçlar ve hatta tüm orman ekosistemleri çevresel değişikliklere cevap verdi ve nihayet bu değişiklikleri yeniden nasıl anlamak için ağaç halkaları depolanan bilgileri kullanır. Bu zamanda geri büyüme varyasyonları analiz ve (örneğin) sıcaklık kayıtlarına çeşitli bitki özgü parametreleri ilişkilendirilerek yapılır. Bu analizlerde ahşap anatomik parametreleri entegre bile içi yıllık çözünürlük aşağı, rekonstrüksiyon güçlendirecektir. Bu nedenle daha sonraki mikroskobik analizler için de, örnek hazırlamak ve ortak makroskopik analizler için numune analiz ahşap, ama nasıl bir protokol mevcut. Ayrıca biz zaman serisi analizleri desteklemek için ortak küçük ve büyük örneklerden elde edilen dijital görüntüler analiz için potansiyel bir çözüm tanıtmak. şu anda kullanılabilir gibi protokol temel adımları sunar. Bunun ötesinde, devam eden bir mevcut tekniklerin geliştirilmesi için bir ihtiyaç ve yeni t gelişimi bulunmuyortekniki, kayıt ve geçmiş ve devam eden çevre süreçleri ölçmek için. Geleneksel ahşap anatomik araştırmalar araştırma bu alanda ekolojik bilgileri içerecek şekilde genişletilmesi gerekir. Bu yeni parametreleri analiz ve odunsu bitkilerin anatomisi belirli çevresel faktörlerin kısa ve uzun vadeli etkilerini anlamak için yeni yöntemler geliştirmek niyetinde DENDRO-bilim adamlarını desteklemek istiyorum.
Introduction
Ağaçlar, yanı sıra çalılar, bodur çalılar, otlar ve hatta kendi ortamındaki değişikliklere ilişkin manifoldu tepki kalıplarını göstermektedir. Bu desenler orta-19 yüzyıldan beri botanik ve bitki fizyolojisi konu olmuştur. O, odunsu bitkiler üzerinde araştırmalar çoğunlukla ağaçları ve ekolojik bağlamda 1 yapı ve yıllık halkaların değişkenlik tanımlayıcı analizler üzerinde duruldu. Andrew Ellicott Douglass ağaç halkası araştırma 2 için çapraz tanışma tekniği icat ettiğinde, bu ekolojik bağlamda daha fazla veya daha az doğru arkeoloji ahşap bulguları bugüne kadar yeni yeteneği tarafından bastırıldı. İlk defa Çapraz-tanışma takvim yılı ağaç halkalarının doğru kalma etkin ve şimdiye kadar uygulanması 1 tüm alanlarında ağaç halkası araştırma omurgası olarak kabul edilir.
Buna paralel olarak, 19. yüzyılın sonundan itibaren, odun anatomisi önemli bir araştırma disiplini içine ilgilidir geliştiDoğal ve uygulamalı bilimler 3 diğer birçok alanlara d. İki ana etki oluşturulmuştur: ahşap teknolojisi, fizyoloji, patoloji, ve ekoloji 3,5 ilişkin arkeoloji 4 odun belirlenmesi için temel sistematik ahşap anatomisi, ve uygulanan ahşap anatomisi.
Ağaç-halkası araştırmada, dendroecology günümüzde bu tür jeomorfolojik süreçler (Dendrojeomorfoloji), sıcaklık ve yağış rekonstrüksiyon (dendroclimatology), su seviyesi değişimleri (dendrohydrology) ya da buzul dalgalanmalar (çevresel çalışmalar odaklanan ağaç halkası ile ilgili çalışmalar kapsayan bir konu olarak tanımlanır dendroglaciology) 6. Bu tanım gösterir gibi ağaç halkası analizleri gibi (i) halka genişliği 7,8, ahşap yoğunluğu 9 yıllık değişimleri analiz ederek geçmiş iklim koşulları gibi uzanan ve çevresel süreçleri yeniden alanında giderek daha önemli hale veya 10 izotoplar, ya da var (ii) tO jeomorfolojik süreçler 11 aralıklarını nüks. Halka genişliği varyasyonlar ve izotop içeriği hakkında Bunlar çok detaylı çalışmalar yüzük anatomik yapısını incelemek için, daha detaylı, yani halkalar analiz ihtiyacını göstermektedir. Ancak, çevresel değişikliklere ilişkin yıllık halkalar içinde ahşap anatomik özellikleri ayrıntılı çalışmalar 12,13 nadirdir. Bu mikroskobik özellikleri 14 bilinmesine rağmen, nadiren Dendroekolojik araştırma mikroskobik düzeyde uygulanmıştır. Ayrıca, tam olarak partner amaçları için esas teşkil doğal olarak yetişen ağaçlar, bu büyüme reaksiyonların doğru zamanlama nadiren son 15 belgelenmiştir.
Küresel ısınmanın etkileri ile ilgili 16, mevcut ve yeni tekniklerin geliştirilmesi iyileştirilmesi özellikle iklim etkisi araştırma 11 açısından, kayıt ve gerekli geçmiş ve devam eden çevre süreçleri ölçmek için.Ekolojik temelli ahşap anatomisi 17 geleneksel ahşap anatomik araştırmalar genişleterek, DENDRO-bilim yeni parametreleri analiz ve odunsu bitkilerin 18 anatomisine belirli çevresel faktörlerin kısa ve uzun vadeli etkilerini anlamak için yeni yöntemler geliştirmek. Belirli sürücülerin (örn, mekanik kuvvetler, iklim değişimleri) ilişkin bireysel halkaları içinde farklı hücre parametrelerinde değişimler hakkında detaylı bilgi ağaç halkası oluşumu değişkenliği anlamak için temel bir gerekliliktir. Ortak halka genişliği ölçümleri ile karşılaştırıldığında, ahşap anatomik varyasyonlar belirlenmesi emek ve çok zaman gerektiren daha karmaşık ve geniş hazırlama teknikleri gerektirir. Örnek kesme, boyama ve gömme detaylı prosedürler manifoldu ve her zaman çalışmanın 19 amacı bağlıdır.
Sayı, boyut veya Distr için kozalaklı hatta yapılarda halka genişliği makroskopik analizi içinsertağaçlarında gemilerin ibution, bir numunenin yüzeyi genellikle ince zımpara kağıdı veya özel taşlama makineleri 20 kullanılarak parlatılır. Bu işlemin bir dezavantajı, ayrıca yarı otomatik mikroskobik analizi 21 önleyen toz tek tek hücrelerin doldurma. Örnek yüzey jilet veya başka bir keskin bıçak kullanılarak kesilir zaman makroskobik numune hazırlama için en iyi sonuçlar elde edilir.
Küçük örnekler için olsa da, tıraş bıçakları mükemmel bir araçtır; çekirdek gibi büyük örnekler çekirdeklerin tüm ölçüde üzerinde uçak yüzeylerin kesme gerektirir. Zımparalama aksine, hücrelerin ardışık görüntü analizi için başka bir hazırlık sağlar toz ile doldurulmuş değildir. Ayrıca, açık hücre lümen, düzgün kesilmiş hücre duvarları ve tüm örneklemin düzlem yüzeyi çekirdeğinin tüm ölçüde yüksek frekanslı dansitometrisinin 22 uygulamasını sağlar. Görüntü, numunelerin yüzey (hücre analizleri içinduvarlar), koyu mürekkep kullanılarak boyanabilir ve açık hücre lümen sonra hücre duvarı ve lümen alanı 19,23 arasındaki kontrastı arttırmak için beyaz tebeşir ile doldurulabilir. Bu oldukça basit teknik damar boyutu ölçümleri için büyük hücre yapılarının temel makroskopik değerlendirme sağlar.
Düzlem yüzeylerin kesme Bu teknikler makroskopik analizler için yeterli. Ayrıntılı bir ahşap anatomik için (yani, mikroskobik) analizi, iletilen ışık mikroskobu DENDRO bilimlerinde uygulanan en yaygın yöntemdir. Xylem hücreleri, hücre tipi tayini, hücre bölünmesini, hücre farklılaşması kapsayan karmaşık süreçlerle ayırt, ve hücre ölümü 24 programlanmış. Bu işlemler, hücre anatomik özelliklerini belirlemek meydana hangi zamanlama ve oran bu yana, bu süreçleri etkileyen çevresel koşullar halka yapısında anatomik sapmaları oluşturabilir. Bu analiz için önemli bir önkoşul olaraks, mikro bölümleri microtome 19 ile hazırlıklı olmak gerekir. Kesit için örnekler hazırlarken, trakeid veya lif yönü görünürlüğü önemlidir. Mikrotomlar kayar tahrik el kullanımı görüntü için gereken 19 analizleri, bu teknik, yüksek kaliteli bölümleri kolaylaştırır, çünkü mikro bölümleri kesmek için tavsiye edilir. Belirli bir çalışma belirli amacına bağlı olarak, mikro bölümler hücrelerinin uzunlamasına ölçüde dik veya paralel olarak kesilir. Bu bölümler daha sonra mikroskop altında fotoğraflandı ve özel görüntü kullanılarak ölçülen hücre boyutları yazılım analiz eder.
Yakın zamana kadar, mikro kesitler hazırlamak için özelliği küçük bir örnek boyutları sadece (yaklaşık 1 cm x 1 cm) ile sınırlandırılmıştır. Bu, belirli yıl bozuklukları olarak tek olayları analiz için kabul edilebilir, ama bu teknik, çevresel rekonstrüksiyon için gerekli uzun bir zaman serisi analizi izin vermez. Bu çaba sadece fark edilebiliryeni, verimli ve ekonomik hazırlık prosedürleri ve analitik teknikler geliştirilmesi yoluyla d. Son yıllarda, İsviçre'de İsviçre Federal Araştırma Enstitüsü WSL de ağaç halkası laboratuar üyeleri bu konuda yoğun bir çalışma başladı. Sonuç olarak, yeni cihazlar ve analiz teknikleri, çevre araştırma konuları geniş bir yelpazede ahşap anatomik özellikleri entegre fikrini desteklemek için geliştirilmiştir.
Protocol
1. Örnekleme Teknikleri
- Çekirdek örnekleme
- Örnekleme ağaç sapları için, her büyüme gelişimini analiz etmek kök bir artış karotiyer kullanarak en az iki çekirdeği özü. Ortak iklim rekonstrüksiyon yamaç çekirdek paralel almak için, örneğin, araştırma görevi örnekleme konumunu Vary. Tropikal türler ile çalışırken, en az üç veya daha fazla çekirdek almak.
- Keskin bir artış delgi (çapı 5, 10 veya 12 mm) kullanarak ve sapın artan eksenine dik delgi yerleştirin.
NOT: ağaca onu delerken onun dönme dışındaki çekirdek birimi hareketlerini önlemek için bir itici kullanın, çekirdek birimi kontrollü ve istikrarlı bir konuma sahip olmak. Içine ve özü ile kök içine tüm yol taşıyordu. Çekirdek çok yoğun ahşap (yani, tropikal türler) için, Diospyrus ebenum olarak çekirdek bile yoğun ormanda izin artış çekirdek bir adaptör (Abanoz) ile özel Yeniden Yapılandırılmış testere cesetleri kullanın. </ Li> - Bir çıkarıcı kullanın ve ağaç kaynaklanan çekirdek çıkarın. Karotiyer dışarı çevirin ve kök çıkarın.
- Daha sonra çekirdek üzerine doğrudan yerleştirilen bir bant, yazarak yumuşak bir kalem kullanılarak ekstre çekirdek belirli bir kimliği ekleyin. Gövdenin karşı taraf için yapılır.
- Herhangi bir hasarı önlemek için plastik ya da kağıt tüpler veya özel kutulara ağacın iki numune saklayın.
NOT: Dökme çekirdeği önlemek için kağıt çörek tropik ortamlarda özellikle yararlıdır. - Son olarak, ahşap destek kirişleri üzerine çekirdeği (lif yönü dik) mount. Soğuk suya dayanıklı ahşap tutkal kullanın ve kurumaya bırakın.
NOT: Bu çalışmanın amacı daha kimyasal, izotop veya yoğunluk analizi içeriyorsa ahşap destekler üzerine çekirdekleri monte asla. Bu amaçlar için, açık kablo kanalları veya tek yüzlü oluklu mukavva çekirdekleri düzeltmek.
- Mikro-çekirdek örnekleme
- Özel delme cihazı kullanınya da 2 mm bir açıklık ile iğne. Kabuğu kalınlığına bağlı kabuğu gerekli kısmını kaldırmak için bir keski kullanın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi kök büyüyen eksenine dik yerleştiriniz ve derinliği yaklaşık 2 cm kök ksilemini nüfuz için bir çekiç kullanın.
- Aletin içine sonuçlanan mikro çekirdek kırmak ve sapından çıkarmak için iğne çevirin. Mikrosantrifüj şişelerde mikro çekirdekleri saklayın ve onları etiketlemek.
- Disk örnekleme
- Kütükleri ve düşmüş ağaçlar ya da mümkün örnekleme yaparken özel durumlarda (özellikle tropik), örneğin, bir zincir testere ile (büyüyen eksenine dik kesitler) diskleri almak. Sadece diskleri etiket ve daha fazla analiz kadar saklayın.
NOT: Bu örnekleme prosedürü en sık artım corers kullanımına izin vermez hepsi-kuru ölü, tarihsel, arkeolojik ve alt fosil malzemesi yanı sıra çok yoğun sert ağaçlarına uygulanır.
2. Numune Hazırlama
- Diskleri Zımpara
- Bir zımpara makinesinde diskleri yerleştirin ve 120, 220, 300-kum ardından 80 kum zımpara ile başlayan, giderek ince aşındırıcılar dizisi kullanarak yüzeyi eziyet. 400 kum ile son bir cilalama en kozalaklı yeterlidir. Yapraklı ağaçlarda ve özellikle tropikal türler için kullanılması büyüme halka sınırlarını ayırt etmek 1200'e irmik kadar zımpara.
- Çekirdek düzlem yüzeyleri Kesme
- Onların bütün ölçüde üzerinde çekirdek üzerinde uçak yüzeyleri kesmek sağlayan yeni geliştirilmiş çekirdek mikrotom çekirdek tutucu artış çekirdeği Fix.
NOT: microtome bıçak dik açıda olan dik numune, lif yönü var sahibinin içinde çekirdek yönünü düzeltin. - Biraz bıçağı dokunana kadar çekirdek kaldırın. Cu için çekirdek ölçüde üzerinde rulman rehberlik sabit bıçak, çekinen bir birinci bölümünü kapalı t.
- , Çekirdek arkasında bıçağı geri itin çekirdek ile yaklaşık 10 mikron numune tutucu kaldırın ve kesme işlemi tekrarlayın. Tabakanın çapı yaklaşık üçte biri sürekli düzlem yüzeyi sonuçlanan kısmak kadar bunu yapın.
- Onların bütün ölçüde üzerinde çekirdek üzerinde uçak yüzeyleri kesmek sağlayan yeni geliştirilmiş çekirdek mikrotom çekirdek tutucu artış çekirdeği Fix.
- Mısır nişastası çözeltisi eklenerek mikro bölümleri hazırlanması.
- Anatomik yapısının detaylı görüntü analizi için, çekirdekler veya diğer numuneler mikrotom sahibinin diskler kopmuş düzeltmek. Numunenin üst kenarında yeni geliştirilmiş kızak mikrotom bir rulman rehberlik rehberliğinde mikrotom bıçak, yerleştirin ve üzerine çekin.
- Yaklaşık 20 um 30 ile örnek yukarı kaldırın ve tekrar numune üzerinde bıçak çekmek için bıçak geri itin. Numunenin üzerine sürekli bir yüzey elde edilir kadar bu prosedürü yineleyin.
- Elde edilen bir mısır nişastası çözeltisi ile yüzey (mısır nişastası, 10 g su, 8 ml,% 100 glisero 7 g Kapakortak bir fırça ile I).
NOT: nişasta taneleri ince kesitler sonraki kesim için yapısını dengelemek için numune açık hücreleri doldurmak. - , 15 mikron ile örnek kaldırın numune yüzeyinde bir fırça yerleştirin ve (fırça altında) ince bir bölümü kesmek için başlangıç numune doğru yavaşça çekin bıçağı. Kesim sırasında, ortaya çıkan bölüm fırça tarafından yönlendirilen bıçak üzerinde kayar.
- Tüm kesit kesildiği zaman, bir fırça ve su ile bıçak mikro kısmını çıkarmak (sürtünmeyi azaltmak için) ve ayrıca hazırlanması için bir cam lam üzerine bölümüne yerleştirin. Kurutma engellemek için, gliserol, az miktarda (% 33 =% 100 gliserol bir kısım su ve iki kısım) kullanarak kapsar.
3. mikroslayd Hazırlık
- Kalıcı slaytlar aşağıdaki hazırlanması için, ilk olarak bir pipet ve su ile mikro bölümünden uzak gliserol yıkayın.
- Se ıslak KapakSafranin birkaç damla ölü m ve Astrablue (+ 2 ml% 100 asetik asit su + 100 mi Astra mavi bir toz, 0.5 g) (Safranin tozu su + 100 mi, 1 g), linyinli olmayan Odunlaşmış ayırt yapıları, aynı zamanda bir sonraki görüntü analizi için kontrastının arttırılması için.
- Boya ile kaplanarak 5 dakika için bölüm dinlensin ve sonra tekrar bir pipet ve suyla yıkayacak.
- En kısa fazla boya çıkarılır gibi, seyreltilmiş bir% 75,% 96 dizi ve son olarak% 100 etanol ile yıkayarak pipetler bölümü dihidrat.
- Kullanım pipetler yerine tüm dehidratasyon işlemi için yaklaşık iki dakika 3 ila işlem süresini azaltmak için bir banyo örnekleri yerleştirme cam slayt örnekleri durulayın.
NOT: etanol ile Dehidratasyon kırma kırılgan örnekleri engeller. - Bundan sonra% 100 ksilolde ile bölüm durulayın.
NOT: Ksilen kanserojen ve onu kullanırken havalandırma laboratuvar zorunludur. DiğerÜrünler ksilol değiştirilmesi bulunmamakta, ancak potansiyel reanalysis için daha uzun süreler (yaş, yıl) örnek üzerinde depolamak için niyet varsa, Kanada balsamı (adım 3.5.2) zamanla rengini değiştirmeden açık kalır sadece gömme ortamıdır. Ne yazık ki Kanada balsamı ksilol ile kombinasyon halinde kullanılması gerekir. - Yeteri kadar susuz değil sürece ksilol (beyazımsı) sütlü döner gibi, dehidratasyon işlemi tekrarlayın.
- En kısa sürede ksilol açık kalır gibi,% 100 Kanada balsam bir damla bölümü kapsayacak ve bölümün en azından boyutta bir cam kapak ile örtün.
NOT: yavaşça cam kapak basarak hava kabarcıkları kaldırarak farkında olun. - Isıya dayanıklı plastik iki şerit arasındaki sonuçlanan mikro slayt yerleştirin ve bir metal plaka üzerine yerleştirin. Aşağıdaki kurutma işlemi sırasında düz bölümü tutmak için aşağı basın slayt üstüne (örneğin, bir mıknatıs) bir ağırlık koyun.
- Bir fırında slaytlar yerleştirinYaklaşık 12 saat süre ile 60 ° C arası. 12 saat sonra, fırından dışarı slaytlar almak ve onları RT (yaklaşık 20 ° C) soğuması için bir rafa koyun. Soğuyunca, ağırlık ve plastik şeridi çıkarın ve fazla Kanada balsamı kaldırmak için Jilet kullanarak slayt temizleyin.
4. Hücre İçeriği görselleştirme
- Nawashin çözeltisi 25 hazırlayın.
- Kromik asit 5 g,% 96 asetik asit, 50 ml iyonu giderilmiş su ve 320 ml bir çözelti (A) hazırlanır. Iyonu giderilmiş su, 175 ml formalin 200 ml bir çözelti (B) hazırlanır.
- Nawashin çözelti oluşturmak için: 1 oranında bir 1 çözelti A ve çözelti B karıştırın.
- 10 dk hücrenin içindeki tüm bozunma süreçleri durdurmak için hücre içeriğini görselleştirmek için, Nawashin çözeltisi ile örnek düzeltmek.
NOT: sabitleme hücre uzun ömürlü (hücre uzun ömürlü = mevcut çekirdekler / çekirdeklerin devamsızlık bir tahmini için izin hücre çekirdekleri korur; varlığı oHücre) yaşayan ya da ölü olup olmadığını çekirdeğinin r yokluğu gösterir. - Tespit edildikten sonra, tam Safranin-Astra mavi ve ek pikrik-anilin mavi ile boyamadan önce (1 kısım doymuş suda çözünür anilin% 10 pikrik asit mavi + 4 ölçü) bunları boyama öncesi Nawashin çözeltinin ayrılması için su ile yıkama bölümleri .
- Dikkatle boyama işlemi hızlandırmak için (kaynama noktasının altında herhangi bir durumda) yaklaşık 80 ° C numunenin ısı. Numunelerin dehidrasyon ve gömme için protokol 3,4-3,8 adımları izleyin.
5. Anatomik Özellikleri Dijital Görüntü hazırlanması
- Damar analizi için temel yüzeylerin dijital görüntüleri oluşturun.
- Çekirdek mikrotomu kullanarak çekirdek yüzey uçağı kesin ve basit bir keçe kalem kullanarak Elde edilen yüzey siyah leke.
- En kısa boya gibi kurutularak, beyaz bir tebeşir ile iç yüzeyine sürün. Sadece üzerinde tebeşir ovularak hücrelerde tebeşir basınBir parmak kullanarak yüzey. Ayrıca bu prosedür ile tebeşiri fazlasını gidermek.
NOT: Hücre duvarları siyah ve damarların lümen parçaları beyaz bir sonucu olarak. Bu kontrast otomatik bir görüntü analizi için bir ön koşuldur. - Bir dijital kamera ile donatılmış bir binoküler mikroskop altında hazırlanan çekirdek yerleştirin. Hafif üst üste binen bir dizi al (yakl.% 10) tüm yüzey yakalanır kadar görüntüler çekirdeğin bir tarafına başlayarak. Çekirdek yüzeyinin tam bir görüntü oluşturmak için tek görüntüleri Dikiş.
- Mikro slaytlar dijital görüntüler oluşturun
- Bir mikroskop altında temizlenir mikro slaytlar yerleştirin ve tüm bölümünden görüntüleri üst üste alır.
- Yapısına bağlı olarak, belirli bir büyütme tanımlama 40X ve 1,000X büyütme arasında değişen, analiz edilecek.
- Bölümün tam bir görüntü oluşturmak için tek görüntüleri Dikiş. Dikiş işlemi sırasında olası bozulmaları önlemek için, "kullanın; Planı "mikroskop objektif lensleri tipi.
6. Nicel Anatomik Özellikleri
- Görüntü analiz aracı ROXAS18 veya benzeri yazılımları kullanarak hücrelerin ve halka sınırlarını tespit etmek, bir mikro bölüm ve metrik birimlerle kantitatif sonuçlar elde etmek ilişkili mekansal kalibrasyon tam resim yüklemek. Aynı büyütme alınan ve metrik birimlerle ölçek aralığı ile elde edilen değer bölen bir mikrometre sahne görüntüleri ölçekleri arasındaki piksel sayısını (örneğin 1.000 mikron) ölçerek mekansal kalibrasyon hesaplayın.
- (Yazılım sağlanan) sağlanan listede analizi otomatik kısmını başlamadan önce uygun bir yapılandırma seçin.
Not: bir konfigürasyonu, örneğin, tespit edilecek olan göz önüne örnek ve hücre boyutu ve şekli aralığının boyama renk alır, program ayarları önceden optimize kümesidir. Böylece Tailored yapılandırmalarıFarklı türler ve görüntü kaliteleri için en uygun tanıma sonuçlarını üretmek için izin verir.- Örneğin, yer veya önlemek için dışlanacak olan görüntüdeki bölgelerin kullanımı gibi daha seçenekleri seçin, örneğin, numune boş görüntü marjları veya çatlaklar, gerekirse.
- Analiz düğmesine basarak analizi başlatın. Seçtiyseniz, dahil veya çokgen, dikdörtgen veya daire aracını kullanarak hariç edilecek görüntüde bölgeleri tanımlar. Aşağıdaki otomatik analiz görüntü kalitesine göre kontrast bazı görüntü eksiklikleri (örneğin, kötü kontrast) düzeltmek ve iyileştirmek için esnek algoritmalar kullanır.
- Kütükleri ve düşmüş ağaçlar ya da mümkün örnekleme yaparken özel durumlarda (özellikle tropik), örneğin, bir zincir testere ile (büyüyen eksenine dik kesitler) diskleri almak. Sadece diskleri etiket ve daha fazla analiz kadar saklayın.
Representative Results
Tüm Dendroekolojik analizler doğru numuneler bağlıdır olursa olsun diskler, çekirdekler, ya da mikro çekirdek alınırsa. Bunun için, cihazların ahşap numune içinde mikro çatlaklar önlemek için (doğru bilenmiş) mükemmel durumda olması gerekir. Artım çekirdek yüzeyleri hazırlarken, bir çekirdek mikrotom kullanılması esastır. Daha fazla görüntü analizleri ve damar boyutu ölçümleri (Şekil 1) için kontrastı arttırmak için tedavi edilebilir açık hücreleri, sahip yeteneği serisi analizleri süre içine anatomik yapıların adaptasyonu yolunda ilk önemli adımdır. Bazen parke numunesinin yoğunluğu mikrotom kullanımını önler. Bu durumda uygun bir cilalama ve bir kompresör ya da vakum ile damarlarının aşırı talaş sonradan çıkarılması, en iyi seçenektir.
Earlywood ve kozalaklı de latewood Trakeidlerin gibi küçük hücre yapılarının daha detaylı analizler için, yüksek kaliteli mikro bölümler ihtiyaç vardır. Burada, potentigibi sekonder hücre duvar ark eserler temel duvar ihtiyaç kaçınılması için (Şekil 2) sıyrılıp edilir. Bu eserler dijital görüntüler ortaya çıkarsa, hücre boyutları otomatik analiz artık mümkün değildir. eserler daha sonra el ile zaman alıcıdır ve hücre boyutları hatalı ölçümler çoğu durumda sonuçları olan düzeltilmesi gerekir. (Şekil 2) 26 en az eser oluşumunu azaltarak numunenin üstüne Newton tipi olmayan bir sıvı, örneğin, bir mısır nişastası çözeltinin basit bir uygulama yapısının stabilitesini destekler. Tropik türler dahil olmak üzere bütün ahşap numune için uygun mısır nişastası, bu uygulama, gereksiz kesmeden önce numunelere gömme işleminin uygulama yapar.
Mikro bölümler yıllık halkaların daha güvenli tespitine imkan. Bu, özellikle kozalaklı yani kendi doğal sınırları, üzerinde büyüyen için geçerlidir </ Em>, yüksek dağ alanlarında ağaç çizgisinde. Son derece dar halkalar (Şekil 3) makroskobik algılamak için sık sık ve zor. Aşırı durumlarda, halkalar earlywood hücrelerinin bir veya iki sıra ve kalınlaştırılmış hücre duvarlarının (ortak latewood hücrelerinin aksine) yoksun düzleştirilmiş latewood hücreleri, bir sıra içerir. Mikro bölümleri kullanırken Bunun için onlar daha iyi ya da sadece görülebilir. Ayrıca, yoğunluk dalgalanmaları özellikle Akdeniz ve tropik (Şekil 3) yıllık halkaların tespiti basitleştiren, daha net halka sınırları ayırt edilebilir.
40X ya da daha yüksek olduğu bir büyütme ile görüntü analiz edilirken, tek hücre görebilir ve hücre duvarlarının kalınlığı da tespit edilebilir. Yarı-otomatik analiz yazılımı kendi zamansal ve mekansal gelişme (Şekil 4) yönünde aşağıdaki tanımlanan yollar boyunca belirli parametrelerin ölçümü sağlar. Bu grubu, chanBu tür hücre lümen veya hücre çeperi kalınlığı, tek parametre ges yıllık halka (Şekil 4), tüm uzantısı boyunca tespit edilebilir. Bu görüntü içinde görünür tüm halkaları için yapılabilir ve bu tamamen uzun bir zaman serisi analizi ihtiyacını destekler.
Görüntü analizleri de vejetasyon dönemi (Şekil 5) içinde yıllık halkaların gelişim evrelerini belirlemek için kullanılabilir. Safranin ve Astra-mavi ikincil hücre duvarının tam Lignifikasyon kadar hücre duvarlarının dış köşelerinde başlayan, polarize ışık, Lignifikasyon bile farklı aşamalarını kullanarak lekeli bir bölümün görüntüsünü analiz ederken, görünür hale gelir. Odunlaşmış (olgun) hücre duvarları polarize ışık (Şekil 5) içine parlaklık olmasıdır. Detaylı bilgi Örneğin daha ayrıntılı iklim büyüme relati için belirlemek için ilgili vejetasyon dönemi için belgelenmiş çevresel verilerle ilgili olabilir öğrenmekten yararlanma.
Şekil 1. mikro bölümün örnekleri ve halka genişliği ve damar boyutu ölçümleri içeren bir meşe hazırlanmış bir düzlem yüzey Sol:. Bir meşe artım çekirdeğinin dış kısmı. 5 mm çapında bir göbek, bir çekirdek mikrotom kullanılarak kesilmiştir. Yüzey daha sonra bir keçe kalem kullanarak siyah lekeli ve leke kuru sonra hücreler beyaz tebeşir ile doldurulmuştur. Sağ: Grafik solda gösterilen çekirdek yüzeyinde yapılan halka genişliği ve damar boyutu ölçümleri belirten. Hiçbir mikro bölümler nedeniyle (21 sonra değiştirilmiş) çekirdek mikrotomla yarattığı net yüzeye bu ölçümleri yapmak gerekiyordu. Alt: Mikro bölümü susuz, lekeli ve Kanada balsamı sabit bir artış çekirdek kesti. Kalınlığı: 20 mikron, uzunluğu: 25 cm. g "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil mikro bölümden 2. Görüntüler mısır nişastası çözümünü kullanarak bir bölüm kesme karşı istikrar olmadan kesim Sol:. Mikro bölümü kozalaklı ağaç earlywood Trakeidlerin eserler kesme gösteren. Örnek gömmeden kesildi ve sonuç olarak earlywood hücrelerinin oldukça ince duvarlar ikincil primer duvar (mavi oklar) kapalı ayrıldı. Sağ: Bir kozalaklı ağaç earlywood Trakeidlerin herhangi eserler olmadan Mikro bölümü. Bu bölümde (solda gösterildiği gibi aynı numune) numune yüzeyinin üstünde bir fırça ile mısır nişastası çözümü uyguladıktan sonra kesildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Şekil pek saptanabilir yıllık halka sınırları 3. örnekleri Sol: hücre duvarlarının kalınlaşması herhangi olmadan basık latewood hücrelerin tek bir satır ile gösterilen bir halka sınırı (siyah ok) gösteren: (Larix desidua burada) bir artış çekirdek Mikro bölümü. Bu halka makroskopik görünür olmaz. Sağ: İçi yıllık yoğunluk dalgalanmaları (beyaz ok) Akdeniz türlerde yaygındır (mikro bölüm: Pırnal meşe). geri earlywood yapısı (beyaz ok) latewood ve doğru hücre yapısının kademeli değişim gerçek halka sınırları gelen yoğunluk dalgalanmaları (siyah ok) ayırt etmek için izin verir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil, bir kozalaklı yıllık halka içinde lümen alanı ve duvar kalınlığı ölçümleri 4. İllüstrasyon Top:. Pinus sylvestris (sarıçam) bir ağaç halkası içinde Roxas analizinin bir örnek sonuçlarını gösteren Cut-out görüntü. Halka sınırları sarı gösterilen ve camgöbeği trakeid lümen özetliyor vardır. Bir radyal dosyası (mavi trakeid Lumina) için ölçülen hücre duvar kalınlıkları kırmızı çevreler tarafından temsil edilmektedir. Siyah ölçek çubuğu = 100 mikron. Alt:. Trakeid lümen alanı ve tüm yıllık halka trakeid hücre duvarı kalınlığı içi yıllık değişimler , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. examplBir şekillendirme yıllık halka, e. görüntü büyüyen bir Larix desidua 7 inci, Temmuz 2007 tarihinde örneklenmiş bir mikro-çekirdek elde edilen bir Safranin ve Astra-mavi boyalı mikro-bölümünden polarize ışık ile ışık mikroskobu altında esir olmuştur Lötschental deniz seviyesinden 1.300 m. Bu mikro-kesit üzerinde kambiyal hücreleri, genişleme aşamasında hücreler, duvar kalınlaşması aşamasında hücreler ve olgun hücreler tanınabilir. Görüntünün teğet genişliği ksilem kesitinin ~ 1 mm kapsar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Dendroekolojik araştırma içine odun anatomisi başarılı ve sürdürülebilir bir entegrasyon zorlukları dışında manifoldu analitik sorunlar, çoğunlukla teknik yönlerine vardır. Ilke örnekleme yüksek kaliteli mikro bölümleri ve sonraki analiz 19 oluşturma yaklaşımları Bunlar zorluklar değişir.
İlk bakışta, çekirdek ya da disklerin örnekleme uzun yıllardır bilinmektedir basit bir işlemdir. Yanlış yapılabilir ve örnekleme küçük bir yanlışlık sonraki hazırlama ve analiz aşamalarında ciddi sorunlara neden olabilir birçok şey vardır. Çalışmanın amacı ölçümleri genişlik halka sınırlı ise bu tür kök eksenine ya da kusurlu bilenmiş karotiyer kullanarak dik tam değil karot gibi küçük yanlışlıklar bir sorun değildir. Mikroskobik analizi için hedef Ancak, yanlış bir örnekleme yönü optik bozulmalara neden olabilirHücre duvarları, çekirdek içindeki mikro çatlaklar künt corers sonuçların kullanımı sırasında. Bu çekirdek mikro bölümleri kesmek için çalışırken bir sonucu olarak, ince kesitler sadece darmadağın ve verimli bir hazırlık artık garanti edilir. Aynı mikro-çekirdek örnekleme için de geçerlidir. Puncher kök ahşap içine dövülmüş zaman bir kör uç yüksek basınç neden olacaktır. Sonuç kambiyal tabaka sıkıştırılır. kambiyal hücreleri (Şekil 5) dolayısıyla sıkılmış ve analiz edilemez.
Disk örnekleme gerçekten büyüme varyasyonları analiz çevresel değişimlere onları ilişkilendirmek için en iyi stratejidir. Ne yazık ki ileri analizler için numune amaçlanan tüm ağaçlardan diskleri almak imkansız değildir. Bununla birlikte, özellikle tropik dendrokronoloji durumunda, kök diskler belirli bir miktar artış çekirdeği ile kombinasyon halinde gereklidir. diskler halka sınırları tanımlamak için bir üs olarak kullanılan ve bunun için boundar desteklemek içinler artış çekirdeği 12,27,28 analiz dayalı tanımlı.
kesme karşı zımpara artılarını ve eksilerini sıkça 1,11,21 tartışılmıştır. Yukarıda belirtildiği gibi, en iyi prosedür her zaman araştırma sorusu bağlıdır ve parametreler (makroskopik ya da mikroskopik) analiz edilecek. Izotop veya kimyasal analizler bir başka çalışma aşamasında tahmin edilmektedir takdirde tüm numune üzerinde hücre lümen içine doldurmak olabilir zımpara ile oluşturulan aşındırıcı toz, dikkatle vakumlama veya basınçlı hava uzaklaştırılır büyük önem taşımaktadır.
Tüm mikroskobik daha analizler için numune hazırlama en uygun şekilde analizleri için mikro bölümleri Kesme olduğunu. Her şeyden önce, bölme bundan sonra olası daha sonraki analizler için bir kontaminasyon olmaksızın tutulabilir örnek kesilir. İkinci Bu bölümler tek hücre parametrelerinin yüksek çözünürlüklü ölçümler için izin verir. Ayrıca, zaman alıcı gömme kaçınarakhücreleri stabilize etmek için bir mısır nişastası çözüm 26 kullanılarak tekniği mikro kesit büyük bir avantajdır.
Mikro kesit bir dezavantajı hala uzun hazırlık süreleri sonuçlanan sınırlı örneklem boyutu. Gerçek zamanlı serisi yüzyıllar hatta binlerce yıl boyunca zaman içinde geri giderek analizleri için, daha da varolan kesme cihazları 17,19, ancak görüntü işleme ve analiz 18 geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Bu yönde bir ilk adım ilk çekirdek düzlem yüzeyleri (Şekil 1) kesmek için üretilen çekirdek mikrotom 21 gelişmedir. Son testler bu cihaz (Şekil 1) kullanarak tüm çekirdeklerin mikro bölümleri kesmek yeteneği ortaya çıkardı.
Yüksek kaliteli mikro bölümler etkili bir görüntü analizi için temel ilke sağlamaktadır. Bir mikroskop altında görüntü alınması yaygın bir prosedür 19 olduğunu, ancak onların etkili analiz hala gereken bir görevdirayrıca 17 geliştirilecek. Varolan tüm görüntü analiz sistemleri daha az ya da yoğun teknisyen tarafından kontrol olması gerekir, yani yarı-otomatik bulunmaktadır. Birçok durumda, görüntüler düzeltilmesi gereken ya da yeni resimler resim içindeki hücre duvarı kalınlığı değiştirmeden yazılım tarafından yapıların daha iyi bir kayıt kontrastı artırmak için yapılması gerekir.
Böyle Roxas 18, WinCell veya ImageJ 29 için özel komut olarak özel görüntü analizi araçları gibi hücre sayısı, hücre boyutunda, hücre duvarı kalınlığı ve yıllık halka içinde hücre konumu gibi temel anatomik veri sağlamak mümkün. Bir Dendroekolojik bağlamda uygun olan birçok ek anatomik ölçümleri gibi büyük kanalların boyutu, kanalların boyutu dağılımı, earlywood veya boruların ilk sıranın boyu, (optik) ahşap yoğunluk, içi yıllık olarak bu temel ölçümler hesaplanabilir boru boyutu ve hücre duvarının profillerikalınlık ve kanallar (yalnız, adedi, vs.) gruplama şekilleri.
Yazılım Roxas 18 kullanarak, boru lümen (yani, su ileten, hücre) ve yıllık halka sınırları hatları otomatik olarak tanınır ve görsel orijinal görüntünün üzerine bindirmeleri olarak temsil edilmektedir. Kanallar için algılama algoritmaları renk, boyut ve şekil bilgisi, her kanalın yerel bağlamda halka sınırları için algılama algoritmaları dayanmaktadır. Bir araç bize elle doğrudan yani, bindirme özelliklerini düzenleme silme, ekleme ve halka sınırları değiştirerek ve kanal özetliyor bu sonuçları iyileştirmek için izin verir. Düzenlemeden sonra, hücre duvar kalınlığı (iğne yapraklılar) dahil nihai veri çıkış, otomatik olarak oluşturulur ve bir elektronik tabloya kaydedilir. Tam otomatik sistemleri şu anda bile nispeten basit bir yapı gösteren kozalaklı için, mevcut değil, fakat bu gelecekteki gelişmeler için bir hedeftir. Bu güçlü fu destek vereceğiniZaman serisi ahşap anatomik parametrelerin ll entegrasyonu analizleri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Increment corer | http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&view=article &id=57&Itemid=88&lang=en |
||
| Core-Microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Laboratory microtome | http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN | ||
| Trephor micro corer | http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp | ||
| Nawashin solution | Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid | ||
| Picric-Anilin blue | One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol | ||
| Safranin | Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4 | ||
| Astra-blue | Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3 | ||
| Ethanol | Linear Formula CH3CH2OH | ||
| Xylol (Xylene) | Linear Formula C6H4(CH3)2 | ||
| Canada Balsam | Embedding solution for microscopy | ||
| Roxas Software | http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN | ||
| ImageJ Software | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| WinCell | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Schweingruber, F. H. Tree Rings and Environment: Dendroecology. , Haupt. Bern. (1996).
- Sheppard, P. R. Dendroclimatology: extracting climate from trees. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 1, 343-352 (2010).
- Wagenführ, R. Anatomie des Holzes: Strukturanalytik - Identifizierung - Nomenklatur - Mikrotechnologie. , DRW-Verlag Weinbrenner. (1999).
- Tennessen, D., Blanchette, R. A., Windes, T. C. Differentiating Aspen and Cottonwood in Prehistoric Wood from Chacoan Great House Ruins. Journal of Archaeological Science. 29, 521-527 (2002).
- Rowell, R. M. Handbook of Wood Chemistry and Wood Composites. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2005).
- Kaennel, M., Schweingruber, F. H. Multilingual Glossary of Dendrochronology. Terms and definitions in English, German, French, Spanish, Italian, Portuguese and Russian. , Haupt. Berne. (1995).
- Esper, J., Frank, D. C., Luterbacher, J., et al. A changing world: challenges for landscape research. On selected issues and challenges in dendroclimatology. Kienast, F. , Springer. Dordrecht. 113-132 (2007).
- Esper, J., Frank, D. C., Wilson, R. J. S., Büntgen, U., Treydte, K. Uniform growth trends among central Asian low and high elevation juniper tree sites. Trees. 21 (2), 141-150 (2007).
- Frank, D. C., Nievergelt, D., Esper, J. Summer temperature variations in the European Alps, AD 755-2004. Journal of Climate. 19 (2), 5606-5623 (2006).
- Treydte, K., et al. Millennium-long precipitation record from tree-ring oxygen isotopes in northern Pakistan. Nature. 440, 1179-1182 (2006).
- Heinrich, I. Dendrogeomorphology. The Encyclopedia of Quaternary Science. Elias, S. A. 2, Amsterdam, Elsevier. 91-103 (2013).
- Verheyden, A., De Ridder, F., Schmitz, N., Beeckman, H., Koedam, N. High-resolution time series of vessel density in Kenyan mangrove trees reveal a link with climate). New Phytologist. 167, 425-435 (2005).
- Abrantes, J., Campelo, F., García-González, I., Nabais, C. Environmental control of vessel traits in Quercus ilex under Mediterranean climate: relating xylem anatomy to function. Trees. 27, 655-662 (2013).
- Fengel, D., Wegener, G. W. ood Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. , Kessel Verlag, Remagen. (2003).
- Heinrich, I., Gärtner, H., Monbaron, M. Tension wood formed in Fagus sylvatica and Alnus glutinosa after simulated mass movement events. IAWA-Journal. 28 (1), 39-48 (2007).
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, United Kingdom and New York, NY. (2013).
- Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in Dendrosciences: The GSL1-microtome). Dendrochronologia. 32 (1), 47-51 (2014).
- Arx, G., Carrer, M. ROXAS - a new tool to build centuries-long tracheid-lumen chronologies in conifers. Dendrochronologia. 32 (3), 290-293 (2014).
- Schweingruber, F. H. Microscopic Preparation Techniques for Plant Stem Analysis. , Verlag Dr Kessel, Remagen. (2013).
- Hoadley, R. B. Identifying wood: Accurate results with simple tools. , The Taunton Press. Newtown, CT. (1990).
- Nievergelt, D. The core-microtome. A new tool for surface preparation on cores and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- Von Schnakenburg, P., Bräuning, A., Helle, G. Detecting annual growth rhythms from high-frequency densitometry and carbon isotopes in tropical mountain rain forest trees in southern Ecuador. Tree Rings in Archaeology, Climatology and Ecology. Elferts, D., Brumelis, G., Gärtner, H., Helle, G., Schleser, G. 6, GFZ Potsdam. Potsdam. 96-99 (2008).
- Garcia Gonzalez, I., Fonti, P. Ensuring a representative sample of earlywood vessels for dendroecological studies: an example from two ring-porous species. Trees. 22 (2), 237-244 (2008).
- Fonti, P., et al. Studying global change through plastic responses of xylem anatomy in tree rings. New Phytologist. 185 (1), 42-53 (2010).
- Purvis, M. J., Collier, D. C., Walls, D. Laboratory techniques in Botany. , Butterworth, London. (1966).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using non-Newtonian fluids to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31 (3), 175-178 (2013).
- De Ridder, M., Vanden Bulcke, J., Van Ackera, J., Beeckman, H. Tree-ring analysis of an African long-lived pioneer species as a tool for sustainable forest management. Forest Ecology and Management. 304, 417-426 (2013).
- De Ridder, M., et al. A tree-ring based comparison of Terminalia superba climate–growth relationships in West and Central. Trees. 27 (5), 1225-1238 (2013).
- Redband, W. S. ImageJ. , U.S. National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij (1997).
