Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Bakteriell overflate motilitet, slik som sverm, blir vanligvis undersøkt i laboratoriet ved hjelp av plate-analyser som nødvendiggjør spesifikke konsentrasjoner av agar og noen ganger å inkludere spesifikke næringsstoffer i vekstmediet. Fremstillingen av slike eksplisitte medier og vekstbetingelser overflaten tjener til å gi de gunstige forhold som gjør det mulig ikke bare for bakterievekst, men koordinert motilitet av bakterier enn disse overflater i tynne væskefilmer. Reproduserbarhet sverm plate og andre overflate motilitet plate analyser kan være en stor utfordring. Spesielt for mer "tempererte svermere" som viser motilitet bare innenfor agar utvalgene av 0,4% -0,8% (vekt / vol), mindre endringer i protokollen eller laboratoriemiljø i stor grad kan påvirke sverm analyseresultatene. "Fuktbarhet", eller vanninnhold ved væske-faststoff-luftgrensesnittet disse plate assays, er ofte en viktig variabel som skal styres. En ekstra utfordring i å vurdere svermende er hvordan å kvantifisere observed forskjeller mellom to (eller flere) eksperimenter. Her har vi detalj en allsidig to-fase-protokollen til å forberede og bilde sverm analyser. Vi inkluderer retningslinjer for å omgå de utfordringene som vanligvis forbindes med sverm analysen media forberedelse og kvantifisering av data fra disse analysene. Vi spesielt vise vår metode med bakterier som uttrykker fluorescerende eller bioluminescente genetiske journalister som grønn fluorescerende protein (GFP), luciferase (lux operon), eller cellulære flekker slik at time-lapse optisk imaging. Vi viser videre evnen til vår metode for å spore konkurrerende svermende arter i det samme eksperimentet.
Mange bakterier flytte på overflater ved hjelp av ulike former for selv fremdrift. Noen motilitetsmidler fenotyper kan bli undersøkt i laboratoriet ved hjelp plate analyser som er berørt av den flytende miljø forbundet med halvfast plate analysesammensetning. En undergruppe av nyttig overflate motilitet plate analyser videre innebære en gassfase-typisk romluft. Følgelig utfallet av en bestemt overflate motilitet assay krever nøye kontroll av grenseflaten mellom tre faser: den lokale miljø fast overflate, flytende miljø, og gassmiljøet egenskaper.
Den mest vanlig studert motilitet modus på en slik tre-fase-analysen som er kjent som sverm. Krydde motilitet er koordinert gruppe bevegelse av bakterieceller som er drevet fram av deres flag gjennom tynne flytende filmer på overflater 1. Det er vanligvis studeres i laboratorier ved hjelp av halvfaste plate-analyser inneholdende 0,4% -0,8% (vekt / vol) agar 1. En rekke avmenneskelige patogener utnytte dette motilitet atferd for å utforske og kolonisere den menneskelige vert. For eksempel, Proteus mirabilis bruker krydde motilitet å flytte opp i urinrøret, nå og kolon blære og nyrer to. Sverm bevegeligheten er generelt ansett som en forløper skritt til biofilmdannelse, den primære årsaken til patogenesen i mange menneskelige patogener tre.
Svermende fenotype er svært variert blant bakteriearter; eksperimentell suksess og reproduserbarhet sterkt avhengige av faktorer som næringssammensetning, agar type og sammensetning, sterilisering protokollen (f.eks autoklave), halvfast media herding, og ambient fuktighet (f.eks sesongmessige endringer), blant annet 3-5. Variasjonen i overflate motilitetsmidler svar understreker utfordringene som oppstår i disse studiene og de betydelige innflytelse media og miljø kan utøve. For noen svermende arter, for eksempel Pseudomonas, krydde motility kan oppstå på en rekke medie komposisjoner, selv om den observerte fenotype og medfølgende sverm ekspansjonsrate vil variere sterkt tre. Kombinert, disse faktorene kan gjøre overflaten motilitet studier ekstremt utfordrende. Sesongvariasjoner innenfor en lab kan påvirke disse tre-fase-analyser: analyser kan fungere bedre i fuktig luft på sommeren og verre i den tørre luften av vinteren. Her presenterer vi de generelle retningslinjer for å omgå noen av de mest bemerkelsesverdige utfordringer når du utfører overflate motilitet plate studier.
For noen overflate motilitet studier, er utvikling av spesifikke fenotyper av stor interesse. De fleste, men ikke alle, publiserte studier for å undersøke sverm av P. aeruginosa viser dannelsen av tentakler eller fraktaler som stråler fra en innsprøytning sentrum 3-9. Forskjeller mellom P. aeruginosa-stammer har blitt dokumentert 5,8, men mye av nærvær eller fravær av tentakler kan tilskrives den spesific medium og protokoll som brukes for disse sverm motilitet plate analyser. Her har vi informasjon om hvordan man skal fremme tendril dannende svermer for P. aeruginosa. Fordi P. aeruginosa er bare ett av mange svermende bakterier, vi også inneholde detaljer for vår metode for å undersøke sverm av Bacillus subtilis og gliding av Myxococcus xanthus. Som P. aeruginosa, aktuell forskning på B. subtilis og M. xanthus spenner en rekke emner som forskere jobber med å skjelne aspekter av sporulering, bevegelighet, stressrespons, og overgangs oppførsel 1,10. Det er et behov for å kvantifisere de mønstre og dynamikken i den spesifikke atferd (er) for slike celler i svermende grupper.
Overflate motilitet datainnsamling, kan analyse og tolkning være tungvint og kvalitativ. Vi har utviklet en protokoll for detaljert makroskopisk analyse av bakterielle svermer som gir i tillegg til å sverme sone morfologi og size (f.eks diameter), kvantitativ dynamisk informasjon om sverm ekspansjonsrate og bakteriell eller Bioproduct tetthetsfordeling 7. Videre kan denne fremgangsmåte utnytte tilgjengelige fluorescerende proteiner, luminescens, og fargestoffer for å oppnå en omfattende oversikt av bakterielle interaksjoner 8, så vel som å spore syntesen av biprodukter (f.eks P. aeruginosa rhamnolipid 7,8) i løpet av en sverm.
Oppnå reproduserbare svermende i et laboratorium kan være utfordrende, som sverm analyser er svært sensitive for miljøfaktorer, som for eksempel fuktighet og tilgjengelige næringsstoffer. Den mest kritiske del av et overflate motilitet plateanalyse finnes fuktighet på agaroverflaten. Før inokulering, må sverm media være tørr nok til å hindre bakterieceller fra svømming over overflaten væske, men ikke så tørr som å inhibere sverm motilitet 5. Inkubasjon bør finne sted på en tilstrekkelig fuktig miljø: for lite fuktighet kan føre til at analysen uttørking under inkubasjon, mens for mye fuktighet kan føre til kunstige eller kunstig overflate spredning. Med mindre en fuktighetsstyrt inkubator er for hånden, kan inkubator og laboratorium fuktighet variere dramatisk. Følgelig kan en ekstra vannreservoar, en luftfukter, eller en avfukter i kuvøse være nødvendig for å hindre over tørking eller opphopning av fuktighet samtidig som relative luftfuktighet nær 80%. Opprettholde dette idealet fuktighet kan vise seg utfordrende hvis sesong fuktighet endringene er betydelige. Hvis dette er tilfelle, vil svermen analyseprotokollen kreve noen justeringer for å ta høyde for sesongmessige endringer i luftfuktigheten. Vi har funnet ut at å endre sverm media tørketiden er den enkleste måten å justere for sesongmessige endringer i luftfuktigheten. Konstant fuktighet overvåking, både på innsiden og utsiden av inkubatoren, anbefales. Videre anbefales det at forskere kalibrere og validere sine instrumenter, inkubatorer, badevekt, etc. som mindre feil i temperatur, volum eller mengder av mediekomponenter kan påvirke reproduserbarhet av disse analysene.
Det skal også bemerkes at typen og størrelsen av den plate som brukes i analysen, kan påvirke platen fuktighet, og dermed sverm. Lufttette plater ikke slippe ut fuktighet, og dermed oppmuntre svømming motilitet. I kontrast, åpen front plater tillate for mye fuktighet å unnslippe. En Petri-skålgir et ideelt miljø fordi det vents av nok fuktighet for å forhindre væske bygge opp, men beholder nok fuktighet for å hindre mediene i å tørke ut. Denne metoden detaljer en overflate motilitet analyseprotokollen som gir mulighet for høy bildekvalitet. For å holde agar klar for bildebehandling 60 mm diameter rettene er fylt med 7,5 ml agar medier. Hvis detaljert avbildning ikke er nødvendig, kan volumer opp til 20 ml også gi reproduserbare resultater.
Mens sverm motilitet kan oppnås på et bredt spekter av agar konsentrasjoner, det optimale området av agar nødvendig for sverm avhenger av arten. Samlet sett økte agar konsentrasjoner hemmer krydde motilitet, og dermed den tiden som trengs for å produsere et bilde-klar sverm øker. P. aeruginosa svermer vanligvis på agar konsentrasjoner mellom 0,4-0,7% 1, men vi finner ut at optimal sverming skjer i en mye smalere utvalg (0,4-0,5%). Andre, slik som B. subtilis og S. enteen sverm på 0,6% agar, og Vibrio parahaemolyticus på 1,5% agar 10. Den nødvendige agar konsentrasjonen bestemmes også av type og merke av agar. Høyere renhet agarer, som Noble agar, sterkt forbedre krydde i P. aeruginosa, og er foretrukket over granulert agar 13,14. Men disse rensede versjoner av agar er også mer utsatt for Karamellisering under autoklaven steriliseringssyklusen; avhengig av instrument, en forkortet / modifisert sterilisering sekvens (for å muligens endre eksos syklus for å hindre langvarig varmeeksponering) kan være nødvendig for å forberede sverm media bruker Noble agar.
Media sammensetning spiller også en rolle i den observerte sverm fenotype tre. P. aeruginosa sverm motilitet studier er vanligvis utføres ved hjelp av minimal nærings medier. Vi foretrekker FAB medium 4,8 (Materialer Table), men andre medier, som M9, LB, eller små variasjoner til disse vanlige medier,har vært brukt med hell 9,15,16. Tendril dannelse oppnås best om FAB minimalt medium supplert med glukose som karbonkilde og kasaminosyrer (CAA), men uten en ytterligere nitrogenkilde (dvs. (NH4) 2 SO 4) 6,13. Hvis tendril dannelse eller morfologi er ikke hovedfokus for studien, deretter FAB minimal medium (Materialer Table, tabell 1) blottet for CAA anbefales slik at effekten av spesifikke karbonkilder og / eller flere næringsstoffer kan studeres i detalj. Andre arter, som for eksempel B. subtilis (presenteres her), er allsidige svermere, i stand til krydde på LB og granulert agar. Disse artene sverme lett, krever bare ~ 10 hr å utvikle en hel sverm. Denne raske sverm rente gjør følgende progresjon av svermen potensielt vanskelig, men vår protokoll gjør en slik sporing veldig gjennomførbart. Evnen til å utføre sverm time-lapse avbildning gir en stoffene.Nårtensiell lette i sverm datainnsamling, spesielt fra slike ivrige svermere.
Vi introduserer en robust, omfattende, to-fase-protokollen og retningslinjer som tar sikte på å styrke gjennomføringen og reproduserbarhet av bakteriell overflate motilitet forskning og har først og fremst lagt vekt på aspekter viktig å undersøke flagellar-mediert svermende. Dette sverm analyseprotokollen detaljer viktige aspekter av media sammensetning og håndtering av overflate motilitetsmidler plater for å sørge for større konsistens og reproduserbarhet innenfor og mellom forskningsmiljøer. Dette vil bedre grunnlag for sammenligning mellom ulike forskningsstudier. I tillegg gir den presenterte tilnærming og protokoll middel til å gjøre forskning på svermende og overflate motilitet mindre utsatt for miljømessige variasjoner ved å gjøre forskere klar over at slike faktorer påvirker deres arbeid og gi mulige løsninger (for eksempel hvordan små endringer i agar påvirke svermende 4,5 ). Videre protokollen gitt ikvantifisere makroskopiske aspekter av svermende, gir en mulighet til å måle mange attributter av bakteriell overflate vekst som tidligere var unquantifiable.
Vi har ikke undersøkt alle overflate bevegelige bakterier i utviklingen av denne protokollen. Som sådan, er det forventet at protokoll modifikasjoner vil være nødvendig for arter som ikke er presentert her. Effektiviteten av denne protokollen er begrenset av de iboende begrensningene av utstyr og materialer ansatt. For eksempel temperaturrelaterte studier er ikke mulig som ennå med Bruker bildebehandling stasjon, siden temperaturkontroll er ikke en funksjon av utstyret. I tillegg, kan anvendelsen av fargestoffer (for eksempel Nile Red å farge rhamnolipider) har kinetisk og konsentrasjons begrensninger 8. Denne teknikken sterkt avhengig av den behandling og analyse av digitale bilder; forbedret automatisering av dataanalyse (f.eks ved hjelp av flere makroer script funksjon i ImageJ) vil redusere den tiden som trengs for analyseog utvide anvendeligheten av dataene. Til slutt, på grunn av robustheten i bildeprotokoll, skal fremtidige anvendelser tar sikte på å utvide denne teknikk for å undersøke mindre ensartede vekstflater som er mer relevant for overflater kolonisert av miljømessige og patogene bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Delvis støtte for dette arbeidet ble gitt av National Institute of Health (R01GM100470 og 1R01GM095959-01A1, til MA og JDS) og en Core Facility stipend fra Indiana Kliniske og Translasjonsforskerne Sciences Institute (finansiert delvis av NIH stipend # UL1 TR000006, til JDS).
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |