Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
细菌表面蠕动,如蜂拥,使用板测定法使得需要特定的琼脂的浓度,有时纳入特定营养素在生长培养基中通常检测在实验室。这样明确的培养基和表面生长条件的制备用于提供的有利条件,允许不仅细菌生长,但细菌过度薄液膜内的这些表面中的协调运动。群板等表面活力板试验的重复性可以是一个重大的挑战。尤其是对于更“温带游动”表现出只在0.4%琼脂范围-0.8%(重量/体积),在协议或实验室环境可以极大地影响群的测定结果小的改动蠕动。 “润湿性”,或水含量以这些板试验中液 – 固 – 气界面,通常要控制的关键变量。在评估蜂拥另外一个挑战是如何量化Ø任何两个(或更多个)的实验之间bserved差异。下面我们详细介绍一款多功能两阶段协议的准备和图像群检测。我们有指引,规避通常与群试验介质制备并从这些实验数据的定量相关的挑战。我们具体地用细菌表达荧光或生物发光基因记者如绿 色荧光蛋白(GFP),萤光素酶(LUX操纵子),或细胞的污渍,使时间推移光学成像显示我们的方法。我们进一步证明我们的方法来跟踪在同一实验的竞争蜂拥物种的能力。
许多细菌对移动使用自推进各种手段表面。一些蠕动表型可以在实验室中使用受与半固体平板测定组合物相关联的液体环境板测定法进行研究。有用的表面运动板测定法的子集进一步包括一个气相 – 典型的室内空气。因此,任何特定的表面运动检测的结果,需要小心控制的三相界面的:当地环境的固体表面,液体的环境中,和气体环境的特性。
在这样的三相测定中最常用的研究运动模式被称为蜂拥。蜂拥蠕动是通过在表面1薄液体膜推进通过鞭毛的细菌细胞的协调组运动。它通常是研究在使用含有0.4%-0.8%的半固体板测定(重量/体积)的实验室琼脂1。数组人类病原体利用这个动力的行为去探索和殖民人类宿主。例如, 奇异变形杆菌采用蜂拥蠕动拉升尿道,达到和殖民膀胱和肾脏2。蜂拥蠕动通常被认为是前体的步骤,以形成生物膜,发病机制在许多人类病原体3的首要原因。
蜂拥表型是细菌物种之间多种多样;实验成功和再现强烈依赖于因素,例如营养组合物,琼脂型和组合物,杀菌协议( 例如 ,高压灭菌),半固体介质固化,和环境湿度( 例如 ,季节变化),等等3-5。表面动力响应的变化强调了这些研究和显著影响,媒体和环境能发挥所遇到的挑战。对于一些蜂拥物种,如假单胞菌属 ,蜂拥MOTility可以发生在各种介质组合物中,虽然观察到的表型和伴随群膨胀率会相差很大3。结合这些因素,可以使表面蠕动的研究极具挑战性。实验室内的季节性变化可以影响这三个阶段试验:检测功能可以在潮湿的空气夏天更好,更糟糕的冬季的干燥空气。在这里,我们提出的一般准则进行表面蠕动板研究时,以规避一些最显着的挑战。
对于一些表面蠕动的研究,具体的表型的发展是极大的兴趣。大多数,但不是所有的,已发表 的研究以检查P的蜂拥假单胞菌显示卷须或分形从中心接种3-9辐射的形成。 P.之间的差异假单胞菌菌株已被记录5,8,但大部分的存在或不存在卷须可以归因于specifiC介质和协议用于这些群活力板试验。在这里,我们包括如何促进卷须形成群为P.细节铜绿假单胞菌 。由于P.铜绿假单胞菌只是众多蜂拥的细菌之一,我们还包括了我们的方法来检查枯草芽孢杆菌的蜂拥和滑翔粘细菌的细节。像P.铜绿假单胞菌 ,对B.目前的研究芽孢杆菌和M.球菌跨越主题为研究人员组成的数组正在辨别孢子,运动,应激反应和过渡行为1,10的各个方面。有必要进行量化,这些细胞中的特定行为(多个)的图案和动力学蜂拥基。
表面动力数据采集,分析和解释很麻烦和定性。我们已经开发出一种协议细菌群的详细的宏观分析,提供除了一窝蜂区形态和sIZE( 例如 ,直径),关于群膨胀率与细菌或生物制品的密度分布7定量的动态信息。此外,这种方法可以充分利用可用的荧光蛋白,发光,和染料,以获得细菌的相互作用8的全面视图,以及追踪生物制品的合成( 例如 , 铜绿假单胞菌鼠李糖脂7,8)一个群内。
实现可再现蜂拥在实验室可以是具有挑战性的,因为群的测定是于环境因素,如湿度和可用养分高度敏感。一个表面运动板测定法的最重要的方面是湿气在琼脂表面。在接种前,群媒体必须有足够的干燥,防止细菌细胞来自全国各地的表面液体游泳,但不能这么干,以抑制蜂拥蠕动5。孵化应在足够潮湿的环境:太少水分可导致在测定中干燥出来孵育期间,而过多的水分可导致人工或人为的表面扩散。除非湿度控制的孵化器在手,孵化器和实验室湿度相差很大。因此,一个附加的储水器,加湿器,或除湿培养箱内可能需要防止过度干燥或过量湿气的积累,同时保持relat香港专业教育学院附近湿度80%。保持这种理想的湿度可能具有挑战性,如果季节湿度变化显著。如果是这样的情况下,该群测定方案将需要一些调整以考虑季节变化湿度。我们已发现,修改群介质干燥时间调整为季节性湿度变化最简单的方法。恒定的湿度监测,内外孵化器外,值得推荐。此外,建议的研究人员进行校准和验证他们的乐器,孵化器,秤等中的温度,体积小的错误或媒体组分的量可以影响这些测定的可重复性。
还应当指出的是,在测定中使用的板的类型和尺寸可以影响板的水分,并且因此蜂拥。密闭板不泄掉多余的水分,从而鼓励游泳运动。相比之下,开放式面板允许过多的水分逃逸。培养皿提供了一个理想的环境,因为它通风口关闭足够的多余水分,以防止液体积聚,但保留足够的水分,以防止介质干燥。这种方法详细介绍了表面动力试验协议,允许高品质的影像。为了保持琼脂清晰的成像直径60mm的培养皿充满7.5毫升琼脂培养基中。如果不需要详述成像,体积达到20ml也能提供可重复的结果。
而蜂拥蠕动可在琼脂浓度的宽阵列来实现,需要蜂拥琼脂的最佳范围取决于物种。总体而言,较高的琼脂浓度则抑制蜂拥蠕动,因此所需的时间,以产生一个图像就绪群增加。P.假单胞菌群通常在琼脂浓度之间0.4-0.7%1,但我们发现,最优蜂拥发生在窄得多的范围(0.4-0.5%)。其它如B.芽孢杆菌和S.肠一大群在0.6%琼脂和副溶血性弧菌在1.5%琼脂10。所需的琼脂浓度也由琼脂的类型和品牌来确定。纯度较高的琼脂,像贵族琼脂,大力提升蜂拥在P.假单胞菌和优于造粒琼脂13,14。然而,琼脂的这些纯化的版本也更容易出现在高压釜灭菌周期焦糖;取决于仪器,缩短/改性灭菌序列(至可能改变排气循环,以防止长时间的热接触),可能需要使用诺布尔琼脂制备群介质。
媒体组成也起着观察群的表型3的作用。P.铜绿假单胞菌蜂拥动力的研究通常执行使用最小的营养介质。我们优选FAB培养基4,8-( 材料数据表),但其他媒体,如M9,LB或轻微变化到这些公共媒体已成功9,15,16使用。卷须形成在补充有葡萄糖作为碳源和酪蛋白氨基酸(CAA)。FAB基本培养基最好地实现,但没有附加的氮源( 例如 ,(NH 4)2 SO 4)6,13-。如果卷须形成或形态不研究的主要焦点,然后FAB最小培养基( 材料表; 表1)缺乏CAA的建议,使得特定碳源和/或另外的营养物的影响可以进行详细的研究。其它物种,如B.枯草芽孢杆菌 (这里介绍),是通用游动,能够在蜂拥LB和颗粒状琼脂。这些品种蜂拥而上容易,只需要〜10小时,开发出全群。这种快速蜂拥速率使得继群潜在的困难的进展,但我们的协议使得这种跟踪非常可行的。执行群延时成像能力提供了一个substanTiAl基缓解群数据采集,尤其是从这样的狂热游动。
我们引入了强大的,全面的,两阶段协议和准则,旨在提高执行力和细菌表面蠕动研究的可重复性,并主要强调的方面的重要研究鞭毛介导的蜂拥。这个群试验协议细节的媒体组成和操作面蠕动板的重要方面,为内部和之间的研究小组更大的一致性和可重复性。这将改善不同的研究研究之间比较的基础。此外,所提出的方法和协议提供手段,使上蜂拥和表面蠕动研究较少受环境变化通过使研究人员知道,这样的因素会影响他们的工作,并提供可能的解决方案( 例如 ,在琼脂的小变化是如何影响蜂拥4,5- )。此外,该协议提供量化蜂拥宏观方面,提供了一个机会来衡量的细菌表面生长的许多属性这在以前是无法量化的。
我们还没有检查所有表面活动细菌在这个协议的发展。因此,它预期的协议的修改将需要在这里没有呈现物种。该协议的效率是由所采用的设备和材料的固有界限的限制。例如,与温度相关的研究是不可能的,因为尚未与布鲁克成像站中,由于温度控制不是设备的一个特征。此外,使用染料(如尼罗红染色鼠李糖脂)可具有的动能和浓度限制8。这种技术强烈依赖于处理和数字图象数据;数据分析的改进的自动化( 例如 ,使用附加的宏中的ImageJ脚本函数)将减少分析所需的时间和扩展数据的有效性。最后,由于所述成像协议的鲁棒性,未来的应用程序的目标应该是扩大该技术,研究较不均匀的生长表面是更相关的受环境和致病的细菌定植的表面。
The authors have nothing to disclose.
(;以MA和JDS R01GM100470和1R01GM095959-01A1)和来自印第安纳州的临床与转化科学研究所的核心设施补助(由美国国立卫生研究院资助#UL1 TR000006部分资金,由美国国立卫生研究院提供的这项工作的部分支持JDS)。
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |