Forberedelse, Imaging, og Kvantifisering av Bakteriell Surface Motility Analyser

Abstract

Bakteriell overflate motilitet, slik som sverm, blir vanligvis undersøkt i laboratoriet ved hjelp av plate-analyser som nødvendiggjør spesifikke konsentrasjoner av agar og noen ganger å inkludere spesifikke næringsstoffer i vekstmediet. Fremstillingen av slike eksplisitte medier og vekstbetingelser overflaten tjener til å gi de gunstige forhold som gjør det mulig ikke bare for bakterievekst, men koordinert motilitet av bakterier enn disse overflater i tynne væskefilmer. Reproduserbarhet sverm plate og andre overflate motilitet plate analyser kan være en stor utfordring. Spesielt for mer "tempererte svermere" som viser motilitet bare innenfor agar utvalgene av 0,4% -0,8% (vekt / vol), mindre endringer i protokollen eller laboratoriemiljø i stor grad kan påvirke sverm analyseresultatene. "Fuktbarhet", eller vanninnhold ved væske-faststoff-luftgrensesnittet disse plate assays, er ofte en viktig variabel som skal styres. En ekstra utfordring i å vurdere svermende er hvordan å kvantifisere observed forskjeller mellom to (eller flere) eksperimenter. Her har vi detalj en allsidig to-fase-protokollen til å forberede og bilde sverm analyser. Vi inkluderer retningslinjer for å omgå de utfordringene som vanligvis forbindes med sverm analysen media forberedelse og kvantifisering av data fra disse analysene. Vi spesielt vise vår metode med bakterier som uttrykker fluorescerende eller bioluminescente genetiske journalister som grønn fluorescerende protein (GFP), luciferase (lux operon), eller cellulære flekker slik at time-lapse optisk imaging. Vi viser videre evnen til vår metode for å spore konkurrerende svermende arter i det samme eksperimentet.

Introduction

Mange bakterier flytte på overflater ved hjelp av ulike former for selv fremdrift. Noen motilitetsmidler fenotyper kan bli undersøkt i laboratoriet ved hjelp plate analyser som er berørt av den flytende miljø forbundet med halvfast plate analysesammensetning. En undergruppe av nyttig overflate motilitet plate analyser videre innebære en gassfase-typisk romluft. Følgelig utfallet av en bestemt overflate motilitet assay krever nøye kontroll av grenseflaten mellom tre faser: den lokale miljø fast overflate, flytende miljø, og gassmiljøet egenskaper.

Den mest vanlig studert motilitet modus på en slik tre-fase-analysen som er kjent som sverm. Krydde motilitet er koordinert gruppe bevegelse av bakterieceller som er drevet fram av deres flag gjennom tynne flytende filmer på overflater ^1. Det er vanligvis studeres i laboratorier ved hjelp av halvfaste plate-analyser inneholdende 0,4% -0,8% (vekt / vol) agar ^1. En rekke avmenneskelige patogener utnytte dette motilitet atferd for å utforske og kolonisere den menneskelige vert. For eksempel, Proteus mirabilis bruker krydde motilitet å flytte opp i urinrøret, nå og kolon blære og nyrer ^to. Sverm bevegeligheten er generelt ansett som en forløper skritt til biofilmdannelse, den primære årsaken til patogenesen i mange menneskelige patogener ^tre.

Svermende fenotype er svært variert blant bakteriearter; eksperimentell suksess og reproduserbarhet sterkt avhengige av faktorer som næringssammensetning, agar type og sammensetning, sterilisering protokollen (f.eks autoklave), halvfast media herding, og ambient fuktighet (f.eks sesongmessige endringer), blant annet ^3-5. Variasjonen i overflate motilitetsmidler svar understreker utfordringene som oppstår i disse studiene og de betydelige innflytelse media og miljø kan utøve. For noen svermende arter, for eksempel Pseudomonas, krydde motility kan oppstå på en rekke medie komposisjoner, selv om den observerte fenotype og medfølgende sverm ekspansjonsrate vil variere sterkt ^tre. Kombinert, disse faktorene kan gjøre overflaten motilitet studier ekstremt utfordrende. Sesongvariasjoner innenfor en lab kan påvirke disse tre-fase-analyser: analyser kan fungere bedre i fuktig luft på sommeren og verre i den tørre luften av vinteren. Her presenterer vi de generelle retningslinjer for å omgå noen av de mest bemerkelsesverdige utfordringer når du utfører overflate motilitet plate studier.

For noen overflate motilitet studier, er utvikling av spesifikke fenotyper av stor interesse. De fleste, men ikke alle, publiserte studier for å undersøke sverm av P. aeruginosa viser dannelsen av tentakler eller fraktaler som stråler fra en innsprøytning sentrum ^3-9. Forskjeller mellom P. aeruginosa-stammer har blitt dokumentert ^5,8, men mye av nærvær eller fravær av tentakler kan tilskrives den spesific medium og protokoll som brukes for disse sverm motilitet plate analyser. Her har vi informasjon om hvordan man skal fremme tendril dannende svermer for P. aeruginosa. Fordi P. aeruginosa er bare ett av mange svermende bakterier, vi også inneholde detaljer for vår metode for å undersøke sverm av Bacillus subtilis og gliding av Myxococcus xanthus. Som P. aeruginosa, aktuell forskning på B. subtilis og M. xanthus spenner en rekke emner som forskere jobber med å skjelne aspekter av sporulering, bevegelighet, stressrespons, og overgangs oppførsel ^1,10. Det er et behov for å kvantifisere de mønstre og dynamikken i den spesifikke atferd (er) for slike celler i svermende grupper.

Overflate motilitet datainnsamling, kan analyse og tolkning være tungvint og kvalitativ. Vi har utviklet en protokoll for detaljert makroskopisk analyse av bakterielle svermer som gir i tillegg til å sverme sone morfologi og size (f.eks diameter), kvantitativ dynamisk informasjon om sverm ekspansjonsrate og bakteriell eller Bioproduct tetthetsfordeling ^7. Videre kan denne fremgangsmåte utnytte tilgjengelige fluorescerende proteiner, luminescens, og fargestoffer for å oppnå en omfattende oversikt av bakterielle interaksjoner ^8, så vel som å spore syntesen av biprodukter (f.eks P. aeruginosa rhamnolipid ^7,8) i løpet av en sverm.

Protocol

1. Swarm analyse av medier og Inoculation ^4,5,7,8,11

1. Media Forberedelse
   MERK: Mediet sammensetning beskrevet nedenfor gjelder for P. aeruginosa tendril formasjons studier. Vennligst se medie spesifikasjoner på tabell 1 for P. aeruginosa, B. subtilis, og M. Xanthus overflaten motilitetsmidler analyser.
   1. Bland 200 ml FAB-minus _{(NH4) 2} SO ₄ sverm medium (Tabell Materials), 0,9 g Noble agar, og 0,2 g kasaminosyrer (Tabell 1) ved omrøring med en magnetisk rørestav. Bruke små mengder (100-300 ml) for å forbedre konsistens mellom eksperimentene.
   2. Autoklaveres 200 ml agar / media blandingen ved hjelp av en eksponeringstid på 22 min, eksponeringstemperatur på 121,1 ° C, og en rask ventileringsalternativ. Autoklaven innstillingene vil tillate riktig sterilisering og agar smelting, men hindre agar Karamellisering.
      MERK: Noble agar er utsatt til karamellization; bakteriell bevegeligheten er endret på karamellisert agar.
   3. Umiddelbart etter steriliseringssyklusen har sluttført, lukker lokket av media flasken for å hindre vanntap ved fordampning. Vær imidlertid oppmerksom på at stram tildekking kan føre til et "vakuum forsegling" -lignende effekt på flasken.
   4. Avkjøl media til 50 ° C under omrøring ved romtemperatur (RT) og tilsett 2 ml steril 1,2 M glukose. Alternativt plassere media i en 60 ° C inkubator eller vannbad til den er klar til å bruke (opptil 15 timer senere), og fortsett som indikert. For å hindre dannelse av bobler i media, bland godt med magnetisk oppsikt bar; bobler på overflaten av agar vil forhindre selv sverm.
      MERK: For andre analyser, legge på dette trinnet varmefølsomme komponenter som ikke kan autoklaveres eksempel ekstra næringsstoffer eller fargestoffer, etter behov (for eksempel tillegg av 8 ul Invitrogen Syto 63 fargestoff per 100 ml smeltet agar til bilde M. xanthus som vist i representative resultater, nedenfor). Tillegg av noen fargestoffer kan påvirke baseline svermende atferd, som bør sjekkes mot et ikke-dye kontroll.
   5. I en laboratoriehette, alikvoter 7,5 ml sterilt medium per 60 mm diameter polystyren petriskål og holde platene i et enkelt lag (ikke stablet). For større svermende overflate, delmengde 25 ml medium per 100 mm diameter petriskål. Det er viktig å fylle retter på en jevn horisontal overflate. Bruk en bull øyehøyde for å sjekke om overflaten er jevnet.
      MERK: For P. aeruginosa analyser, ved hjelp av en bestemt medievolumet per plate vil bedre konsistens og reproduserbarhet. For B. subtilis og M. Xanthus analyser, hånd helle gir resultater sammenlignes med spesifikke volum porsjoner.
2. Plate herding
   1. For små plater (60 mm), tillate at smeltet agarmedium for å herde (begge satt til halv-fast og tørr skytende væske) i hetten åpnet (dvs. uten lokk) i 30 min. Størreplater (100 mm) krever en lengre tørketid (se diskusjon).
      MERK: Alternativt kan enkelte analyser krever plater for å kurere på benken toppen over natten (20-24 timer) dekket (dvs. lokk på) i en enkelt lag (tabell 1). Sverm er følsom for både overflødig og utilstrekkelig fuktighet. Fuktighet, luftstrøm, og temperaturen enhver lab kan nødvendiggjøre variasjon til plate herding for å fremme optimal sverm av dere bakterien.
   2. Vaksinere plater umiddelbart etter tørkeperioden er over. Ikke oppbevar plater for videre bruk.
      1. Utfør "blekk spredning test" ved å fange opp en test plate med 10 pl blanding av 0,50% (vol / vol) Higgins Vanntett Sort India Ink og bakterieinokulum ^11. Hvis blekk / pode blanding sprer lett (dvs. beholder ikke dråpeform) på overflaten av media, vil mediene trenger mer tid til å tørke.
         MERK: For arter som er spesielt følsomme for fuktighet (<em> f.eks P. aeruginosa), utføre en rask "blekk spredning test" ¹¹ for å avgjøre om platene er tørre nok.
3. Swarm analysen Inoculation
   1. Vaksinere 6 ml kjøttkraft kulturmedier (se tabell 1 for detaljer) med en isolert koloni fra en fersk (<5 dager gammel hvis igjen i romtemperatur) lysogeni buljong (LB) plate kultur. Inkuber buljongkulturer over natten (≤18 hr) ved 30 ° C eller 37 ° C med risting horisontale (240 rpm).
   2. Vaksinere sverm plater ved å fange opp med 1-5 mL av natten buljong kultur, eller med "poking" agar med en steril tann plukke eller wire vaksinasjon nål.
      MERK: Vi foretrekker den sistnevnte metode, fordi det reduserer sannsynligheten for spruter inokulumet og forhindrer tilsetning av ekstra fuktighet til svermen flateareal.
4. Swarm analysen Inkubasjon
   1. For generell analyse, ruge sverm analyseplater på 30 °C eller 37 ° C (eller til og med 42 ° C i B. subtilis; Tabell 1) -dette er bestemt bakterie. Invertere platene under inkubering, slik at overskytende fuktighet kondenserer på lokket, ikke agaren.
      MERK: Temperatur kan påvirke fenotype samt kinetikk. For P. aeruginosa svermer, inkubering ved 37 ° C fører til hurtigere vekst og sverm utvidelseskoeffisient enn inkubering ved 30 ° C; men morfologien av disse svermer ofte varierer med endringen i temperatur.
   2. For time-lapse imaging, ruge sverm plater på riktig temperatur før overføring til bildestasjonen (se tabell 1 for detaljer).
      MERK: Denne pre-imaging inkubasjon gjør svermer å starte sin utvikling og bli etablert før han ble flyttet til et nytt miljø, som kan eller ikke kan være optimal for sverm motilitet.

2. Makroskopisk Imaging av Surface Motilitet Analyser ^7,8

<ol>

For time-lapse imaging, etter at pre-bildebehandlings inkubasjonstid sted sverm analyseplater på en klar bildeplate inne i en kommersiell in vivo avbildning stasjon. Bilde opp til seks, 60 mm diameter eller fire, 100 mm diameter plater på en gang. Siden kameraet tar bilder fra under avbildningsplanet, invertere platene, slik at den optiske bane ikke blir hindret ^8. Alternativt, Inkuber ved 30 ° C eller 37 ° C (tabell 1) for varigheten av eksperimentet, og fjerne platene som skal avbildes fra inkubatoren ved angitte tidsintervaller.

Plasser lokkene på petriskålene oppreist på toppen av platen motstykke som holder det inokulerte mediet. Fyll lokkene av petriskåler med vann for å hindre overdreven tørking under bildebehandling, og vedlegge hele settet opp ved hjelp av en annen klar skuffen for å opprettholde fuktigheten gjennom hele forsøket.

Ved hjelp av Molecular Imaging (MI) programvare ^12, kjøre analysen (e) ved romtemperatur ved hjelp av imaldring innstillinger beskrevet i tabell 2. For time-lapse imaging, satt opp en protokoll med de nødvendige skritt og spesifikasjoner.

3. Data Processing og tolkning ^7,8

1. Bildebehandling
   1. Bruk MI programvare for å batch eksportere bilder som 16-bits TIFF-filer: File> Export eller eksportere flere> Velg fil (er) til å eksportere og eksportere steds.
   2. Bruk ImageJ å åpne et enkelt bilde eller importere en time-lapse serie:
      1. Åpne et enkelt bilde: Fil> Åpne
      2. Import time-lapse bildesekvens: File> Import Sequence, og velge "Sorter navnene numerisk".
         1. For større tidsintervall filer, velger du "Bruk virtuell stabel" i "Import Sequence" vinduet for å stable de eksporterte bildene i hensiktsmessige kategorier (dvs. GFP, RFP, etc.).
   3. Om nødvendig, endre bilder fra 16-bits filer til 8-bits filer: Bilde> type> 8-bit
      MERK: Noen ImageJ verktøy krever 8-bits bilder.
   4. Finn ut om intensiteten signal for et bilde eller time-lapse sekvens må snus. Plasser markøren på et lyspunkt i bildet (f.eks fluoresceinmerket vekst) og merk signalintensitet "Value" fra ImageJ verktøylinjen. Deretter plasserer du markøren i en mørk flekk utenfor tallerkenen området og noter signal intensitet. Hvis signalintensiteten for den mørke punkt er større enn intensiteten til den lyse flekk, må bildesignalintensiteten å bli invertert (følg deltrinn 1-2 nedenfor).
      1. Invertere intensitet signaler: Edit> Invert
      2. Snu oppslagstabellen: Bilde> Oppslag tabeller> Invert LUT
   5. Trekk fra bakgrunnen: Prosess> Trekk Bakgrunn, og bruk en "Rullende ball radius" med en pikselradius som er den ene halvdelen av ett bilde dimensjon (f.eks 1000 piksler for en 2000 x 2000 pixel bilde).
   6. Kunstig farge et bilde eller time-lapse sekvens: Bilde> Oppslag Tables, og velg riktig farge fra valglisten.
   7. For filmer med to eller flere kanaler, fusjonere og balansere fargene før du lagrer som en film (bildebehandling, trinn 8). Å flette bilder sammen, åpne alle bildestakker i ImageJ, deretter velger Image> Farge> Merge-TV, og gi hver stabel til en fargekanal.
   8. Spar tid-lapse sekvens som AVI eller QuickTime-film: Fil> Lagre som, og velg ønsket format og spesifikasjoner.
2. Data Analysis
   1. Anskaffe Bakteriell Surface vekstområde for å kvantifisere Expansion Ranger
      1. Åpne bilde (r) i ImageJ
      2. For å beregne diameteren på plate i piksler, tegne en linje over midten av en analyse plate med "Straight" verktøy fra og måle dens lengde: Analyser> Measure
      3. Standard måleenhet i ImageJ er pixel. Oppnå en konverteringsfaktor ved å dele diameteren av analyseplate (f.eks, 60 for en 60 mm plate) ved piksel lengde oppnådd i det foregående trinnet.
      4. Endre måleenhet fra pixel til mm: Bilde> Egenskaper
         1. Endre "Unit of Lengde" til "mm", og "Pixel bredde", "Pixel Høyde", og "voxel Depth" til omregningsfaktor beregnet i forrige trinn. Velg "Global" boksen for å opprettholde denne omregningsfaktor på tvers av flere bilder.
            MERK: Hvis ImageJ er lukket og gjenåpnet, eller synsfeltet av et bilde er endret (dvs. at ett bilde zoomet inn mer enn en annen), må den omregningsfaktoren beregnes på nytt. Alternativt utføre alle analyser i piksler og deretter konvertert til mm.
      5. For hver ramme, spore og måle sverm området ved hjelp av "Freehand Selections" verktøy på verktøylinjen for å spore outline av svermen og måle området ved hjelp av: Analyser> Mål. Dette vil generere en målinger logg som kan lagres for videre analyse i Microsoft Excel eller lignende programmer: File> Save As
   2. Anskaffe Bakteriell Surface Vekst Intensitet å kvantifisere Surface vekstrate
      1. Når bakgrunnen trekkes (bildebehandling, trinn 5), kan du bruke den siste rammen av sekvensen å bestemme maksimalt areal av sverm (Data Analysis, trinn 1).
      2. Bruk "Oval" selection tool fra verktøylinjen for å tegne en boks rundt bakterieoverflatevekst.
      3. Still bety intensitet måling av piksler i boksen ved hjelp av: Analyser> Set Målinger, og velg "Mean grå verdi".
      4. For å få intensitet signalmålinger for hver ramme i time-lapse sekvens, mens på det første bildet i sekvensen gå til: Analyser> Mål. Dette vil generere en målinger logg som kan lagres for videre analyse i Microsoft Excel eller lignende programmer: File> Save As
   3. Alternativ til forrige avsnitt (Data Analysis, trinn 2). Bruk ImageJ makroer plugin å sette opp og kjøre en makroer overflate vekst intensitet måling script.
      1. Setup en automatisert måling skript for å analysere flere rammer samtidig: Plugin> Ny> Macro, og lim den medfølgende script (nedenfor) inn i boksen og lagre som en ImageJ makroer tekstfil: Fil> Lagre, og lagre til ImageJ programmappen under " makroer ".
         numberOfFrames = N
         for (i = 0; i <numberOfFrames; i ++) {
         kjøre ('Mål');
         kjøre ('Neste Slice [>]');
         }
         MERK: Her variabelen "N" er for en udefinert antall rammer.
      2. Redigere "numberOfFrames" i Makroer plugin for hvert forsøk for å gjenspeile antall bilder i bildesekvensen før du kjører skriptet. Bruk: Plugin> makroer>Rediger, og skriv inn riktig antall bilder i sekvens og lagre (Fil> Lagre).
      3. Følg deltrinn 1-3 i Data Analysis-Step 2, og mens du er på det første bildet i sekvensen kjøre makroer plugin: Plugin> makroer> Kjør. Dette vil generere en målinger logg som kan lagres for videre analyse i Microsoft Excel eller lignende programmer: File> Save As

Representative Results

Variasjon i plate forberedelse kan i stor grad påvirke krydde motilitet. Det herde- eller tørketiden etter støping av smeltet agar medium påvirker den tynne væskefilm er tilstede på overflaten motilitet analyser og den bakterielle motilitet over tid. Endringer i næringssammensetningen påvirker også sverm i flere bakterier. Figur 1A viser et korttidseffekten av tørketiden ved spredning av India blekk og spredning av en innledende inokulum av Bacillus subtilis ¹¹ Fig. 1B viser effekten av tørketiden og Figur 1C viser effektene av ammonium sulfat [(NH _{4) 2} SO _4] under påfølgende tendril utvikling av sverm P. aeruginosa ^5.

Kvantifiserbare data kan hentes fra endepunkts bilder av overflaten motilitet ved hjelp av flere bildebehandlings strategier. Figur 2 viser representative overflate vekstresultater for B. subtilis sverm og dens tilhørende Bioluminescens image; og Myxococcus xanthus overflatevekst og den tilhørende røde fluorescens bilde av SYTO 64-fargede celler.

Utvidelse av datainnsamling utover bare inspeksjon og avbildning av endepunkts resultater tillater studiet av dynamiske oppførsel (er) for overflate voksende bakterier. Figur 3 ^{Figur 7} viser et eksempel på P. aeruginosa sverm (avbildes for GFP uttrykke celler) og tilhørende rhamnolipid produksjon (avbildes med Nile Red lipid flekken) -den kvantifisering av data fra disse bildene vises også til å vise utvidelsen frekvensen av P. aeruginosa svermende. Video 1 viser en time-lapse av B. subtilis sverm avbildes med luminescens av en lux -expressing belastning. Video 2 ⁸ viser en time-lapse av P. aeruginosa Salmonella ente serovar Typhimurium (rød-uttrykke lux) i et konkurranseutsatt sverm analysen.

Figur 1: Eksempler på faktorer i overflaten motilitet analysesammensetning som påvirker analyse utfallet Effekt av (A) agar tørketid på agaroverflaten fuktighet og spredning av inokulum for B.. subtilis (Ref ^8), (B) agar tørketid på P. aeruginosa sverm (Gjengitt fra Ref ⁵ med tillatelse), og (C) tilstedeværelse eller fravær av ammonium sulfat på P. aeruginosa sverm og tendril formasjon.

Figur 2: vekselstrømve tilnærminger for bildeflaten vekst og motilitet av bakterier ved hjelp av en Bruker bilde stasjon. Side ved side bilde av et kamera (til venstre) og Bruker bilde (høyre) viser (A) P. aeruginosa uttrykker GFP-avbildes med grønn fluorescens innstillinger, (B) B. subtilis uttrykker lux Bioluminescens reporter-avbildes med Lumi-nescence innstillinger, og (C) M. xanthus farget med SYTO 64-avbildes med Red Fluorescens II innstillinger. Se tabell 2 for innstilling av detaljer.

Fig. 3: Kvalitativ og kvantitativ analyse av et overflate motilitet assay (A) med tidsforsinkelse analyse av celletetthetsfordeling, rhamnolipid produksjon (Nile Red lipid flekken avbildes ved hjelp av den røde fluorescensJeg innstillinger; Målestokk = 15 mm), og (B) kvantifisering av ekspansjonsgraden fra celletetthet fordelings bilder av en P. aeruginosa sverm. (Gjengitt fra Ref ⁶ med tillatelse.)

Video 1. Time-lapse avbildning av en B. subtilis sverm. B. subtilis uttrykker lux og tatt opp med Luminescensen innstillinger. Se tabell 2 for innstilling av detaljer.

Video 2. arts konkurranse visualisert ved time-lapse bildebehandling. Svermer av P. aeruginosa (grønn, uttrykker GFP og tas opp med grønn fluorescens innstillinger) og S. ente serovar Typhimurium (rød; expressynge lux og tatt opp med Luminescensen innstillinger). Se tabell 2 for innstilling av detaljer. (Skriv ut på nytt med tillatelse fra Ref ^7.)

	P. aeruginosa	P. aeruginosa tendril formasjons studier	B. subtilis	M. xanthus
Overnatter buljong kultur media	FAB pluss 30 mM Glukose	FAB pluss 30 mM Glukose	LB	CTT
Overnatter buljong kultur inkuberingstemperatur	37 ° C	37 ° C	37 ° C	30 timer ved 30 ° C
Swarm media	FAB	FAB minus (NH 4) 2 SO 4	2% (vekt / volum) LB	CTT
Swarm media: tilleggskomponenter	12 mM glukose en	10% (vekt / volum) CAA, 12 mM Glukose en	n / a	SYTO® 64 en
Agar typen	Agar, Noble	Agar, Noble	Granulert agar	Agar, Noble Affymetrix
Agar-konsentrasjon (vekt / vol)	0,45%	0,45%	0.60%	1.50%
Sverm plate størrelse	60 mm	60 mm	100 mm	150 mm
Media volum per plate	7,5 ml	7,5 ml	Hånd Strømmet	Hånd Strømmet
Swarm media innstilling / tørkemetode	Hette; plater avdekket	Hette; plater avdekket	Stasjonære; plater dekket	Stasjonære; plater dekket
Swarm media innstilling / tørketid	30 min	30 min	Overnatter (20 -24 timer)	Overnatter (20 -24 timer)
Sverm analysen inkuberingstemperatur	30 eller 37 ° C	30 ° C	37 ° C	30 ° C
Inkubasjon for tidsinnstilte bilde	30 ° C i minst 4 timer	30 ° C i minst 4 timer	37 ° C i 2 timer	RT i 12 timer
Time-lapse opptakslengde	24-timers	24-timers	10 hr	66 hr
Time-lapse innstilling	En ramme / 10 min	En ramme / 10 min	En ramme / 6 min	En ramme / 10 min
et Lagt etter autoklave.

Tabell 1:. Spesifikasjoner for Surface Motilitet analysen Forberedelse Inkluderer overflatemotilitet analyse forberedelse spesifikasjoner for P. aeruginosa, B. subtilis, og M. xanthus.

Signal	Grønn fluorescens	Rød fluorescens jeg	Rød fluorescens II	Luminescens
Protein eller fargestoff	Grønn fluorescens Protein (GFP)	mCherry protein eller Nile Red rhamnolipid flekken	SYTO® 64	Luciferase fra lux operon
Eksitasjon bølgelengde (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Av
Utslipp bølgelengde (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Ingen filter
Eksponeringstid (sek)	30	60	60	240
f- stopp	4.0	4.0	2,5	1.1
FOV (mm)	190	190	140	120
Fokusplan (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Binning (piksler)	None	2 x 2	None	8 x 8

Tabell 2: Imaging Spesifikasjon Bruker bildebehandling stasjons spesifikasjoner for rød og grønn fluorescens, og luminescens avbildning av bakteriell overflatevekst..

Discussion

Oppnå reproduserbare svermende i et laboratorium kan være utfordrende, som sverm analyser er svært sensitive for miljøfaktorer, som for eksempel fuktighet og tilgjengelige næringsstoffer. Den mest kritiske del av et overflate motilitet plateanalyse finnes fuktighet på agaroverflaten. Før inokulering, må sverm media være tørr nok til å hindre bakterieceller fra svømming over overflaten væske, men ikke så tørr som å inhibere sverm motilitet ^5. Inkubasjon bør finne sted på en tilstrekkelig fuktig miljø: for lite fuktighet kan føre til at analysen uttørking under inkubasjon, mens for mye fuktighet kan føre til kunstige eller kunstig overflate spredning. Med mindre en fuktighetsstyrt inkubator er for hånden, kan inkubator og laboratorium fuktighet variere dramatisk. Følgelig kan en ekstra vannreservoar, en luftfukter, eller en avfukter i kuvøse være nødvendig for å hindre over tørking eller opphopning av fuktighet samtidig som relative luftfuktighet nær 80%. Opprettholde dette idealet fuktighet kan vise seg utfordrende hvis sesong fuktighet endringene er betydelige. Hvis dette er tilfelle, vil svermen analyseprotokollen kreve noen justeringer for å ta høyde for sesongmessige endringer i luftfuktigheten. Vi har funnet ut at å endre sverm media tørketiden er den enkleste måten å justere for sesongmessige endringer i luftfuktigheten. Konstant fuktighet overvåking, både på innsiden og utsiden av inkubatoren, anbefales. Videre anbefales det at forskere kalibrere og validere sine instrumenter, inkubatorer, badevekt, etc. som mindre feil i temperatur, volum eller mengder av mediekomponenter kan påvirke reproduserbarhet av disse analysene.

Det skal også bemerkes at typen og størrelsen av den plate som brukes i analysen, kan påvirke platen fuktighet, og dermed sverm. Lufttette plater ikke slippe ut fuktighet, og dermed oppmuntre svømming motilitet. I kontrast, åpen front plater tillate for mye fuktighet å unnslippe. En Petri-skålgir et ideelt miljø fordi det vents av nok fuktighet for å forhindre væske bygge opp, men beholder nok fuktighet for å hindre mediene i å tørke ut. Denne metoden detaljer en overflate motilitet analyseprotokollen som gir mulighet for høy bildekvalitet. For å holde agar klar for bildebehandling 60 mm diameter rettene er fylt med 7,5 ml agar medier. Hvis detaljert avbildning ikke er nødvendig, kan volumer opp til 20 ml også gi reproduserbare resultater.

Mens sverm motilitet kan oppnås på et bredt spekter av agar konsentrasjoner, det optimale området av agar nødvendig for sverm avhenger av arten. Samlet sett økte agar konsentrasjoner hemmer krydde motilitet, og dermed den tiden som trengs for å produsere et bilde-klar sverm øker. P. aeruginosa svermer vanligvis på agar konsentrasjoner mellom 0,4-0,7% ^1, men vi finner ut at optimal sverming skjer i en mye smalere utvalg (0,4-0,5%). Andre, slik som B. subtilis og S. enteen sverm på 0,6% agar, og Vibrio parahaemolyticus på 1,5% agar ^10. Den nødvendige agar konsentrasjonen bestemmes også av type og merke av agar. Høyere renhet agarer, som Noble agar, sterkt forbedre krydde i P. aeruginosa, og er foretrukket over granulert agar ^13,14. Men disse rensede versjoner av agar er også mer utsatt for Karamellisering under autoklaven steriliseringssyklusen; avhengig av instrument, en forkortet / modifisert sterilisering sekvens (for å muligens endre eksos syklus for å hindre langvarig varmeeksponering) kan være nødvendig for å forberede sverm media bruker Noble agar.

Media sammensetning spiller også en rolle i den observerte sverm fenotype ^tre. P. aeruginosa sverm motilitet studier er vanligvis utføres ved hjelp av minimal nærings medier. Vi foretrekker FAB medium ^4,8 (Materialer Table), men andre medier, som M9, LB, eller små variasjoner til disse vanlige medier,har vært brukt med hell ^9,15,16. Tendril dannelse oppnås best om FAB minimalt medium supplert med glukose som karbonkilde og kasaminosyrer (CAA), men uten en ytterligere nitrogenkilde (dvs. _{(NH4) 2} SO ₄₎ ^6,13. Hvis tendril dannelse eller morfologi er ikke hovedfokus for studien, deretter FAB minimal medium (Materialer Table, tabell 1) blottet for CAA anbefales slik at effekten av spesifikke karbonkilder og / eller flere næringsstoffer kan studeres i detalj. Andre arter, som for eksempel B. subtilis (presenteres her), er allsidige svermere, i stand til krydde på LB og granulert agar. Disse artene sverme lett, krever bare ~ 10 hr å utvikle en hel sverm. Denne raske sverm rente gjør følgende progresjon av svermen potensielt vanskelig, men vår protokoll gjør en slik sporing veldig gjennomførbart. Evnen til å utføre sverm time-lapse avbildning gir en stoffene.Nårtensiell lette i sverm datainnsamling, spesielt fra slike ivrige svermere.

Vi introduserer en robust, omfattende, to-fase-protokollen og retningslinjer som tar sikte på å styrke gjennomføringen og reproduserbarhet av bakteriell overflate motilitet forskning og har først og fremst lagt vekt på aspekter viktig å undersøke flagellar-mediert svermende. Dette sverm analyseprotokollen detaljer viktige aspekter av media sammensetning og håndtering av overflate motilitetsmidler plater for å sørge for større konsistens og reproduserbarhet innenfor og mellom forskningsmiljøer. Dette vil bedre grunnlag for sammenligning mellom ulike forskningsstudier. I tillegg gir den presenterte tilnærming og protokoll middel til å gjøre forskning på svermende og overflate motilitet mindre utsatt for miljømessige variasjoner ved å gjøre forskere klar over at slike faktorer påvirker deres arbeid og gi mulige løsninger (for eksempel hvordan små endringer i agar påvirke svermende ^4,5 ). Videre protokollen gitt ikvantifisere makroskopiske aspekter av svermende, gir en mulighet til å måle mange attributter av bakteriell overflate vekst som tidligere var unquantifiable.

Vi har ikke undersøkt alle overflate bevegelige bakterier i utviklingen av denne protokollen. Som sådan, er det forventet at protokoll modifikasjoner vil være nødvendig for arter som ikke er presentert her. Effektiviteten av denne protokollen er begrenset av de iboende begrensningene av utstyr og materialer ansatt. For eksempel temperaturrelaterte studier er ikke mulig som ennå med Bruker bildebehandling stasjon, siden temperaturkontroll er ikke en funksjon av utstyret. I tillegg, kan anvendelsen av fargestoffer (for eksempel Nile Red å farge rhamnolipider) har kinetisk og konsentrasjons begrensninger ^8. Denne teknikken sterkt avhengig av den behandling og analyse av digitale bilder; forbedret automatisering av dataanalyse (f.eks ved hjelp av flere makroer script funksjon i ImageJ) vil redusere den tiden som trengs for analyseog utvide anvendeligheten av dataene. Til slutt, på grunn av robustheten i bildeprotokoll, skal fremtidige anvendelser tar sikte på å utvide denne teknikk for å undersøke mindre ensartede vekstflater som er mer relevant for overflater kolonisert av miljømessige og patogene bakterier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentsa
FAB Minimal Media:			Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	2 g. Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)	Fisher Scientific	C79	1 ml
Trace metal solution (see below)	n/a	n/a	1 ml
Trace Metal Solution:			Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.
CaSO4 x 2H2O	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2O	Fisher Scientific	C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2O	Sigma	S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	A74	5 mg
FeSO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	F7002	200 mg
CTT Media:			Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)	Amresco	0234	1 ml. Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore).
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)	Sigma-Aldrich	P3786	0.1 ml. Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore).
MgSO4 solution	Fisher Scientific	M65	0.8 ml. Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore).
Casitone	BD Diagnostics	225930	1 g
Additional Reagents:
LB Broth, Lennox	BD Diagnostics	240230	2% (wt/vol)
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media. Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.
Casamino acids (CAA)	Amresco	J851	0.10% (wt/vol). Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.
Agar, Noble	Sigma-Aldrich	A5431	0.45% (wt/vol). Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.
Agar, Noble	Affymetrix	10907	1.50% (wt/vol). Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.
Agar, Granulated	Fisher Scientific	BP1423	0.60% (wt/vol)
Higgins Waterproof Black India Ink	Higgins	HIG44201	0.50% (vol/vol). Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S-11346	Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 μl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).
Relevant Materials and Equipment
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia. x H)	VWR	25384-326
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia. x H)	VWR	25384-342
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia. x H)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker		Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
Bruker MI software	Bruker		http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
ImageJ software	NIH		http://imagej.nih.gov/ij/
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.