Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Bacteriële oppervlakte motiliteit, zoals zwermen, gewoonlijk in het laboratorium onderzocht met plaatanalyses die specifieke concentraties van agar en soms opname van specifieke voedingsstoffen in het groeimedium noodzakelijk. De bereiding van dergelijke expliciete media en groeioppervlak voorwaarden dient om de gunstige voorwaarden die niet alleen de groei van bacteriën, maar gecoördineerde beweeglijkheid van bacteriën op deze vlakken binnen dunne vloeibare films toe te staan. Reproduceerbaarheid van zwerm plaat en andere oppervlakte beweeglijkheid plaatanalyses kan een grote uitdaging zijn. Speciaal voor meer "gematigde zwermers" die de beweeglijkheid vertonen alleen binnen agar reeksen van 0,4% -0,8% (gew / vol), kleine wijzigingen in het protocol of het laboratorium omgeving kan een grote invloed hebben zwerm test resultaten. "Bevochtigbaarheid" of watergehalte aan het vloeistof-vaste stof-luchtinterface deze plaatanalyses, vaak een belangrijke variabele te controleren. Een extra uitdaging bij de beoordeling van zwermen is hoe te kwantificeren oBServed verschillen tussen twee (of meer) experimenten. Hier hebben we in detail een veelzijdige twee-fasen-protocol voor te bereiden en het imago zwerm assays. Wij zijn onder andere richtlijnen om de uitdagingen vaak geassocieerd met zwerm assaymedium voorbereiding en kwantificering van de gegevens van deze testen te omzeilen. We specifiek tonen onze methode met behulp van bacteriën die fluorescerende of bioluminescent genetische reporters zoals groen fluorescerend eiwit (GFP), luciferase (lux operon) te uiten, of cellulaire vlekken aan time-lapse optische beeldvorming mogelijk te maken. We het vermogen van onze werkwijze te sporen concurrerende zwermen species in hetzelfde experiment verder aan te tonen.
Veel bewegen bacteriën op oppervlakken met behulp van verschillende middelen van zelf-voortstuwing. Sommige beweeglijkheid fenotypes kunnen worden onderzocht in het laboratorium met behulp plaatanalyses die worden beïnvloed door het vloeibare milieu in verband met de halfvaste plate assay samenstelling. Een subset van bruikbare oppervlakte beweeglijkheid plaatanalyses nog meer te betrekken een gasfase-typisch lucht in de ruimte. Bijgevolg is de uitkomst van een bepaald oppervlak beweeglijkheid test, vraagt een zorgvuldige controle van de interface van de drie fasen: het lokale milieu stevige ondergrond, vloeibaar milieu, en gas milieu-eigenschappen.
De meest bestudeerde motiliteit modus dergelijke driefasige assay bekend als zwermen. Zwermen beweeglijkheid is de gecoördineerde groep beweging van bacteriële cellen die worden voortgestuwd door hun flagella door dunne vloeibare films op oppervlakken 1. Het wordt meestal onderzocht in laboratoria met behulp van semi-vaste plaatanalyses die 0,4% -0,8% (w / v) agar 1. Een array vanhumane pathogenen benutten deze beweeglijkheid gedrag te verkennen en te koloniseren de menselijke gastheer. Bijvoorbeeld, Proteus mirabilis gebruikt zwermen beweeglijkheid overgaan tot de plasbuis, het bereiken en kolonisatie van de blaas en nieren 2. Swarming motiliteit wordt algemeen beschouwd als een voorloper stap biofilm vorming, de primaire oorzaak van pathogenese in vele menselijke pathogenen 3.
De zwermen fenotype is zeer gevarieerd tussen bacteriesoorten; experimenteel succes en reproduceerbaarheid sterk afhankelijk van factoren zoals nutriëntensamenstelling type agar en samenstelling, sterilisatie protocol (bijvoorbeeld autoclaaf), semi-vaste media uitharden en ambient vocht (bijv seizoensinvloeden), onder anderen 3-5. De variabiliteit van de oppervlakte van de beweeglijkheid reacties benadrukt de uitdagingen in deze studies en de aanmerkelijke invloed media en milieu kan uitoefenen. Voor sommige zwermen soorten, zoals Pseudomonas, zwermen motiliteit kan optreden op een verscheidenheid van media-composities, hoewel de waargenomen fenotype en bijbehorende zwerm uitbreidingstarief sterk 3 zal variëren. Gecombineerd, deze factoren kunnen het oppervlak beweeglijkheid studies zeer uitdagend maken. Seizoensgebonden variabiliteit binnen een laboratorium kan deze drie-fase testen beïnvloeden: testen kunnen beter in de vochtige lucht van de zomer en slechter in de droge lucht van de winter functioneren. Hier presenteren we algemene richtlijnen om een aantal van de meest opmerkelijke uitdagingen omzeilen bij het uitvoeren van het oppervlak beweeglijkheid plaat studies.
Voor sommige oppervlak beweeglijkheid studies, de ontwikkeling van specifieke fenotypes is van groot belang. De meeste, maar niet alle, gepubliceerde studies naar zwermen van P. onderzoeken aeruginosa tonen de vorming van ranken of fractals die uitlopen van een inenting centrum 3-9. Verschillen tussen P. aeruginosa stammen zijn gedocumenteerd 5,8, maar veel van de aanwezigheid of afwezigheid van ranken kan worden toegeschreven aan de specificatiesc middelgrote en protocol dat wordt gebruikt voor deze zwerm beweeglijkheid plaatanalyses. Hier behoren we informatie over hoe u-rank vormen zwermen voor P. bevorderen aeruginosa. Omdat P. aeruginosa is slechts een van de vele zwermen bacteriën, we ook informatie voor onze methode om zwermen van Bacillus subtilis en glijden van Myxococcus xanthus onderzoeken. Zoals P. aeruginosa, lopende onderzoek naar B. subtilis en M. xanthus overspant een scala aan onderwerpen als onderzoekers werken aan aspecten van sporulatie, beweeglijkheid, stress respons, en overgangsbepalingen gedrag 1,10 onderscheiden. Het is noodzakelijk om de patronen en de dynamiek van het specifieke gedrag (en) voor deze cellen kwantificeren zwermen groepen.
Oppervlak beweeglijkheid data-acquisitie, kunnen analyseren en interpreteren omslachtig en kwalitatief zijn. We hebben een protocol ontwikkeld voor de gedetailleerde macroscopische analyse van bacteriële zwermen dat in aanvulling biedt op zone morfologie en s zwermenize (bv diameter), kwantitatieve dynamische informatie met betrekking tot zwerm uitbreidingstarief en bacteriële of bioproduct dichtheid distributie 7. Verder kan deze werkwijze gebruik maken van beschikbare fluorescerende eiwitten, luminescentie en kleurstoffen om een volledig beeld van bacteriële interacties 8 te verkrijgen, alsook de synthese van Bioproducts (bijvoorbeeld P. aeruginosa rhamnolipide 7,8) binnen een zwerm volgen.
Het bereiken van reproduceerbare zwermen in een laboratorium kan lastig zijn, zoals zwerm assays zijn zeer gevoelig voor omgevingsfactoren, zoals vochtigheid en beschikbare nutriënten. De meest kritische aspect van een oppervlak motiliteit plaatassay is vocht op het agar oppervlak. Voorafgaand aan inoculatie, moet zwerm media droog genoeg om te voorkomen bacteriële cellen van zwemmen over het oppervlak vloeistof, maar niet zo droog remmen zwermen motiliteit 5 zijn. Incubatie dient plaats te vinden in een voldoende vochtige omgeving: te weinig vocht kan leiden tot de test uitdrogen tijdens de incubatie, terwijl te veel vocht kan leiden tot kunstmatige of artefactuele oppervlak verspreiden. Tenzij een luchtvochtigheid gecontroleerde incubator is bij de hand, kan incubator en laboratorium luchtvochtigheid sterk variëren. Bijgevolg zou een extra waterreservoir, een luchtbevochtiger, of een ontvochtiger in de incubator worden verplicht om te voorkomen dat over het drogen of de ophoping van overtollig vocht terwijl de relative luchtvochtigheid in de buurt van 80%. Het handhaven van deze ideale luchtvochtigheid evenwel geen sinecure als seizoensgebonden luchtvochtigheid wijzigingen aanzienlijk zijn. Als dit het geval is, zal de zwerm testprotocol enige aanpassingen te verantwoorden seizoensgebonden veranderingen in de luchtvochtigheid. We hebben ontdekt dat het wijzigen van de zwerm media droogtijd is de eenvoudigste manier om te corrigeren voor seizoensgebonden veranderingen in de luchtvochtigheid. Constant vochtigheidsmeting, zowel binnen als buiten de incubator, wordt aanbevolen. Verder is het raadzaam dat onderzoekers kalibreren en valideren van hun instrumenten, incubators, schalen, enz. Als kleine fouten in temperatuur, volume of de hoeveelheden van de media onderdelen kan beïnvloeden reproduceerbaarheid van deze testen.
Ook moet worden opgemerkt dat het type en de grootte van de plaat die in de test beïnvloeden plaat vocht en dus zwermen. Luchtdichte platen hebben geen vent het overtollige vocht, dus bemoedigend zwemmen beweeglijkheid. In tegenstelling openliggend platen laten te veel vocht kan ontsnappen. Een petrischaalbiedt een ideale omgeving, omdat het vents off genoeg overtollig vocht te voorkomen dat vloeistof bouwen, maar behoudt voldoende vocht om de media niet uitdroogt. Deze methode Gegevens van een oppervlak beweeglijkheid test protocol dat zorgt voor een hoge beeldkwaliteit. Om de agar duidelijk voor de beeldvorming van 60 mm diameter gerechten worden gevuld met 7,5 ml agar media te houden. Als gedetailleerde beeldvorming niet vereist, kunnen volumes tot 20 ml tevens reproduceerbare resultaten.
Terwijl zwermen beweeglijkheid kan worden bereikt op een breed scala van agar-concentraties, het optimale bereik van agar vereist voor zwermen is afhankelijk van de soort. Kortom, agar hogere concentraties remmen zwermen beweeglijkheid, en bijgevolg de tijd die nodig is om een beeld ready zwerm toeneemt produceren. P. aeruginosa wemelt het algemeen op agar concentraties van 0,4-0,7% 1, maar we vinden dat optimaal zwermen voorkomt in een veel beperkter assortiment (0,4-0,5%). Anderen, zoals B. subtilis en S. enterischeeen zwerm op 0,6% agar, en Vibrio parahaemolyticus op 1,5% agar 10. De benodigde agar concentratie wordt ook bepaald door het type en merk van agar. Hogere zuiverheid agars, zoals Noble agar, sterk verbeteren zwermen in P. aeruginosa en voorkeur boven gegranuleerd agar 13,14. Echter, deze gezuiverde versies agar zijn ook meer vatbaar voor caramelization in de autoclaaf sterilisatie cyclus; afhankelijk van het instrument, een verkorte / gewijzigde sterilisatie reeks (om eventueel de uitlaat cyclus veranderen om langdurige blootstelling aan hitte te voorkomen) kan worden verplicht om zwerm media bereiden met behulp van Noble agar.
Media samenstelling speelt ook een rol in de waargenomen zwerm fenotype 3. P. aeruginosa zwermen beweeglijkheid studies worden meestal uitgevoerd met behulp van minimale voedingsbodems. Wij geven de voorkeur FAB medium 4,8 (Materials tabel), maar ook andere media, zoals M9, LB, of lichte variaties op deze gemeenschappelijke media,zijn met succes toegepast 9,15,16. Rank vorming best verwezenlijkt FAB minimaal medium aangevuld met glucose als koolstofbron en casaminozuren (CAA), maar zonder extra stikstofbron (dwz, (NH4) 2 SO4) 6,13. Als rank vorming of de morfologie is niet de belangrijkste focus van de studie, dan is FAB minimaal medium (Materials tabel; tabel 1) verstoken van CAA wordt aanbevolen, zodat de effecten van specifieke koolstof bronnen en / of aanvullende voedingsstoffen kunnen in detail bestudeerd worden. Andere soorten, zoals B. subtilis (hier voorgesteld), zijn veelzijdig zwermers, staat zwermen op LB en kristalsuiker agar. Deze soorten zwerm gemakkelijk, waarvoor slechts ~ 10 uur om een volledige zwerm ontwikkelen. Deze snelle zwermen tarief maakt naar aanleiding van de progressie van de zwerm potentieel moeilijke maar ons protocol maakt zoals het bijhouden van zeer haalbaar. De mogelijkheid om zwerm time-lapse imaging uitvoeren biedt een substantietieel gemak in zwerm data-acquisitie, met name uit zulke fanatieke zwermers.
We introduceren een robuuste, uitgebreide, twee-fasen-protocol en richtlijnen die gericht zijn op het verbeteren van de uitvoering en de reproduceerbaarheid van bacteriële oppervlakte beweeglijkheid onderzoek en zijn in de eerste plaats benadrukt aspecten belangrijk om-flagellaire gemedieerde zwermen onderzoeken. Deze zwerm assay protocol Gegevens belangrijke aspecten van media samenstelling en de behandeling van het oppervlak beweeglijkheid platen te zorgen voor meer consistentie en reproduceerbaarheid binnen en tussen onderzoeksgroepen. Dit zal de basis van de vergelijking tussen de verschillende onderzoeken te verbeteren. Bovendien, de gepresenteerde aanpak en protocol verschaft middelen voor onderzoek zwermen en oppervlakte beweeglijkheid minder gevoelig omgevingvariaties maken door onderzoekers bekend dat dergelijke factoren beïnvloeden hun werk te verlenen oplossingen (bijvoorbeeld hoe kleine veranderingen in agar beïnvloeden zwermen 4,5 ). Bovendien, het protocol verstrektkwantificeren macroscopische aspecten van zwermen, biedt de mogelijkheid om vele attributen van de bacteriële groei oppervlak die voorheen als onberekenbare meten.
We hebben nog niet alle oppervlakte-beweeglijke bacteriën onderzocht in de ontwikkeling van dit protocol. Als zodanig wordt verwacht dat protocol aanpassingen nodig zijn voor soorten hier gepresenteerd. De efficiëntie van dit protocol wordt beperkt door de inherente beperkingen van de apparatuur en materialen gebruikt. Bijvoorbeeld, temperatuur gerelateerde studies niet mogelijk doch met Bruker imaging station, aangezien temperatuurregeling is geen kenmerk van de apparatuur. Bovendien kan het gebruik van kleurstoffen (zoals Nile Red te rhamnolipiden vlekken) kinetica en concentratie beperkingen 8 hebben. Deze techniek sterk afhankelijk van de verwerking en analyse van digitale beelden; verbeterde automatisering van gegevensanalyse (bijvoorbeeld middels aanvullende Macro scriptfunctie in ImageJ) zou de tijd die nodig is voor de analyse te beperkenen uitbreiden van de bruikbaarheid van de gegevens. Tenslotte vanwege de robuustheid van de beeldvormende protocol moet toekomstige toepassingen gericht op de uitbreiding van deze techniek tot minder uniforme groei oppervlakken die relevanter oppervlakken gekoloniseerd door milieu- en pathogene bacteriën te onderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
Gedeeltelijke steun voor dit werk werd geleverd door het National Institute of Health (R01GM100470 en 1R01GM095959-01A1, MA en JDS) en een Core Facility subsidie van de Indiana Klinische en Translational Sciences Institute (deels gefinancierd door de NIH-subsidie # UL1 TR000006; aan JDS).
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |