Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Bakterielle Oberflächenbeweglichkeit, wie das Schwärmen, wird üblicherweise im Labor mit Plattentests, die spezifische Konzentrationen von Agar und manchmal Aufnahme spezifischer Nährstoffe in dem Nährmedium notwendig sucht. Die Herstellung von solchen expliziten Medien und Wachstumsbedingungen Fläche dient, die günstige Bedingungen, die nicht nur das Wachstum von Bakterien, aber koordinierte Motilität der Bakterien gegenüber diesen Oberflächen innerhalb dünnen Flüssigkeitsfilmen ermöglichen. Die Reproduzierbarkeit der Schwarm Platte und andere Oberflächenbeweglichkeit Plattentests kann eine große Herausforderung sein. Speziell für mehr "gemäßigten Schwärmer", die Beweglichkeit nur innerhalb Agar Bereiche von 0,4% -0,8% (G / V), kleine Änderungen in Protokoll oder Laborumgebung können Schwarm Untersuchungsergebnisse stark beeinflussen aufweisen. "Wettability", oder des Wassergehalts in der Flüssigkeits-Feststoff-Luft-Grenzfläche dieser Plattentests, ist oft eine wichtige Variable kontrolliert werden. Eine weitere Herausforderung bei der Beurteilung Schwärmen ist, wie man o quantifizierenbserved Unterschiede zwischen zwei (oder mehr) Experimenten. Hier werden wir ausführlich ein vielseitiges Zweiphasen-Protokoll zu erstellen und Bild Schwarm Assays. Wir sind Leitlinien für die Herausforderungen häufig mit Schwarm Assay Medienvorbereitung und Quantifizierung von Daten aus diesen Tests verbundenen umgehen. Wir haben uns speziell zeigen unsere Methode mit Bakterien, die fluoreszierende oder Biolumineszenz genetische Reporter wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), Luciferase (lux-Operon) zum Ausdruck bringen oder Mobil Flecken auf Zeitraffer-optische Bildgebung ermöglichen. Wir zeigen weiter die Fähigkeit unseres Verfahrens zu verfolgen konkurrierenden Schwärmen Spezies in dem gleichen Experiment.
Viele Bakterien bewegen auf Oberflächen mit verschiedenen Mitteln der Selbstantrieb. Einige Motilität Phänotypen kann im Labor mit Plattentests, die von der flüssigen Umgebung mit dem halbfesten Platten-Assay Zusammensetzung assoziiert betroffen sind recherchierbar. Eine Untergruppe der Nutzfläche Motilität Plattentests weiter beinhalten eine Gasphase-typischerweise Raumluft. Dementsprechend wird der Ausgang eines bestimmten Oberflächen Motilität Assay erfordert eine sorgfältige Steuerung der Schnittstelle aus drei Phasen: die örtlichen Umwelt festen Oberfläche, flüssigen Umgebung und Gasumgebung Eigenschaften.
Die am häufigsten untersuchten Motilität Modus derart dreiphasigen Assay wird wie Schwärmen bekannt. Schwärmen Beweglichkeit ist die koordinierte Gruppe Bewegung von Bakterienzellen, die durch ihre Geißeln durch dünne Flüssigkeitsfilme auf Oberflächen 1 angetrieben werden. Es wird üblicherweise in Laboratorien mit halbfesten Plattentests, die 0,4% -0,8% (w / v) Agar 1 studiert. Eine Anordnung vonHumanpathogene nutzen diese Motilität Verhalten zu erforschen und zu besiedeln den menschlichen Wirt. Zum Beispiel nutzt Proteus mirabilis wimmelt Motilität zu bewegen auf der Harnröhre und erreichte und Kolonisierung der Blase und Nieren 2. Schwärmendes Motilität wird allgemein als Vorläuferschritt zu Biofilmbildung, die primäre Ursache der Pathogenese bei vielen menschlichen Pathogenen 3.
Das Schwärmen Phänotyp ist sehr unterschiedlich zwischen den Bakterienarten; experimentelle Erfolg und Reproduzierbarkeit stark verlassen sich auf Faktoren wie Nährstoffzusammensetzung, Agar Art und Zusammensetzung, Sterilisation Protokoll (zB Autoklavieren), halbfeste Medien Aushärtung und Umgebungsfeuchtigkeit (zB Wechsel der Jahreszeiten), unter anderem 3-5. Die Variabilität der Motilität Antworten Oberfläche betont die Herausforderungen in diesen Studien und den maßgeblichen Einfluss Medien und Umwelt ausüben kann auftreten. Für einige schwärmen Arten, wie Pseudomonas, wimmelt motility kann auf einer Vielzahl von Medien-Zusammensetzungen auftreten, obwohl der beobachtete Phänotyp und Begleit Schwarm Ausdehnungsrate wird erheblich 3 variieren. In Kombination können diese Faktoren machen Oberfläche Motilität Studien extrem schwierig. Saisonale Schwankungen in einem Labor können diese Dreiphasen-Assays beeinflussen: Tests können besser in der feuchten Luft des Sommers und noch schlimmer in der trockenen Luft des Winters funktionieren. Hier präsentieren wir die allgemeinen Leitlinien zu einigen der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung von Oberflächenbeweglichkeit Platte Studien zu umgehen.
Für einige Oberflächen Motilität Studien, ist von großem Interesse die Entwicklung von spezifischen Phänotypen. Die meisten, aber nicht alle veröffentlichten Studien zu Schwärmen von P. prüfen aeruginosa zeigen die Bildung von Ranken oder Fraktale strahlenförmig von einer Impfung Center 9.3. Die Unterschiede zwischen P. aeruginosa-Stämme wurden dokumentiert 5,8, aber viel von der Gegenwart oder Abwesenheit von Ranken können zur spezifi zurückzuführenc Medium und das Protokoll für diesen Schwarm Motilität Platte Assays verwendet. Hier sind Informationen, wie man Ranke bildenden Schwärmen für P. fördern aeruginosa. Da P. aeruginosa ist nur eine von vielen schwärmenden Bakterien, auch wir Informationen für unsere Verfahren zu Schwärmen von Bacillus subtilis und Gleiten von Myxococcus xanthus zu untersuchen. Wie P. aeruginosa, der aktuellen Forschung auf B. subtilis und M. xanthus umfasst eine Reihe von Themen, wie Forscher arbeiten, um Aspekte der Sporenbildung, Motilität, Stressantwort und Übergangsverhalten 1,10 zu erkennen. Es besteht ein Bedarf, die Muster und die Dynamik des spezifischen Verhaltens (s) für diese Zellen in Schwärmen Gruppen zu quantifizieren.
Oberflächenbeweglichkeit Datenerfassung, können Analyse und Interpretation umständlich und qualitativ sein. Wir haben ein Verfahren für die detaillierte makroskopische Analyse der bakteriellen Schwärmen, die zusätzlich zur Verfügung stellt Zone Morphologie und s Schwarm entwickeltenize (zB Durchmesser), quantitative dynamische Informationen zum Schwarm Expansionsrate und bakterielle oder Bioprodukt Dichteverteilung 7. Darüber hinaus kann dieses Verfahren die Vorteile der verfügbaren fluoreszierenden Proteinen, Lumineszenz, und Farbstoffe, um einen umfassenden Überblick der bakteriellen Interaktionen 8 zu erhalten, sowie um die Synthese von Bioprodukten (zB Rhamnolipid P. aeruginosa 7,8) innerhalb eines Schwarms zu verfolgen.
Erzielung reproduzierbarer Schwärmen in einem Labor kann eine Herausforderung sein, wie Schwarm Assays sind sehr empfindlich gegenüber Umwelteinflüssen, wie Feuchtigkeit und verfügbaren Nährstoffen. Der kritischste Aspekt einer Oberfläche Motilität Plattenassay ist Feuchtigkeit auf der Agaroberfläche. Vor der Beimpfung müssen Schwarm Medien trocken genug, um Bakterienzellen vom Schwimmen über die Oberfläche Flüssigkeit zu verhindern, aber nicht so trocken wie zu hemmen wimmelt Motilität 5 sein. Die Inkubation sollte in einem ausreichend feuchten Umgebung zu nehmen: zu wenig Feuchtigkeit im Test Austrocknen während der Inkubation führen, während zu viel Feuchtigkeit kann zu künstlichen oder Artefakt Oberfläche Verbreitung führen. Es sei denn, eine feuchtigkeitsgesteuerten Inkubator zur Hand, kann Inkubator und Labor Feuchtigkeit drastisch ändern. Folglich könnte ein weiterer Wasservorratsbehälter, einen Luftbefeuchter oder ein Entfeuchter im Inkubator ist zur Übertrocknung oder die Ansammlung von überschüssiger Feuchtigkeit zu verhindern, während die relat werdenive Feuchtigkeit in der Nähe von 80%. Die Aufrechterhaltung dieses ideale Luftfeuchtigkeit kann sich als Herausforderung, wenn saisonale Feuchtigkeitsschwankungen signifikant sind. Wenn dies der Fall ist, wird der Schwarm Assay-Protokoll einige Anpassungen erfordern, um saisonale Änderungen in der Feuchtigkeit zu berücksichtigen. Wir haben festgestellt, dass eine Veränderung der Schwarm Medien Trockenzeit ist der einfachste Weg, um für die saisonale Feuchtigkeitsschwankungen anzupassen. Konstantfeuchteüberwachung sowohl innerhalb als auch außerhalb des Inkubators, wird empfohlen. Ferner ist es empfehlenswert, dass die Forscher zu kalibrieren und zu bestätigen ihre Instrumente, Inkubatoren, Schuppen, etc. als kleinere Fehler in der Temperatur, Volumen oder Mengen von Medienkomponenten können Reproduzierbarkeit dieser Assays beeinträchtigen.
Es sollte auch beachtet werden, dass die Art und die Größe der Platte in dem Assay verwendet werden kann, Plattenfeuchtigkeit beeinflussen und somit Schwärmen werden. Airtight Platten nicht auslassen überschüssige Feuchtigkeit, was ermutigend Schwimm Beweglichkeit. Im Gegensatz dazu offenflächigen Platten erlauben zu viel Feuchtigkeit entweichen. Eine Petrischalebietet eine ideale Umgebung, weil es Öffnungen off genug überschüssige Feuchtigkeit zu verhindern, dass Flüssigkeit aufzubauen, behält aber genug Feuchtigkeit, um das Medium vor dem Austrocknen zu verhindern. Diese Methode nennt eine Oberfläche Motilität Assay-Protokoll, das für hohe Bildqualität ermöglicht. Um den Agar klar für die Bildgebung 60 mm Durchmesser Gerichte werden mit 7,5 ml Agar-Medien gefüllt zu halten. Wenn detaillierte Bildgebung nicht benötigt wird, können Mengen von bis zu 20 ml auch reproduzierbare Ergebnisse.
Während wimmelt Beweglichkeit kann auf eine breite Palette von Agar-Konzentrationen erreicht werden, der optimale Bereich von Agar zum Schwärmen ist abhängig von der Spezies. Insgesamt höhere Agar Konzentrationen hemmen wimmelt Beweglichkeit und damit die benötigte Zeit, um eine Bild-ready Schwarm Steigerungen zu produzieren. P. aeruginosa schwärmt der Regel auf Agar-Konzentrationen zwischen 0,4-0,7% 1, jedoch finden wir, dass optimale Schwärmen in einem viel engeren Bereich (0,4-0,5%) auftritt. Andere, wie B. subtilis und S. Darm-ein Schwarm mit 0,6% Agar und Vibrio parahaemolyticus in 1,5% Agar 10. Die erforderliche Agarkonzentration wird auch durch die Art und Marke Agar bestimmt. Höhere Reinheit Nährböden, wie Edel Agar, stark verbessern schwärmen in P. aeruginosa und werden bevorzugt Agar 13,14 über granuliert. Jedoch sind diese gereinigte Versionen von Agar auch anfälliger für Karamelisierung während der Autoklav-Sterilisationszyklus; je nach Gerät, eine verkürzte / modifiziert Sterilisation Sequenz (die Abgaszyklus möglicherweise ändern, um längere Hitzeeinwirkung zu verhindern) kann erforderlich sein Schwarm Medien vorzubereiten mit Edel-Agar werden.
Medienzusammensetzung spielt auch eine Rolle bei der beobachteten Schwarm Phänotyp 3. P. aeruginosa wimmelt Motilität Studien werden in der Regel unter Verwendung von minimal Nährmedien. Wir bevorzugen FAB Medium 4,8 (Werkstoff-Tabelle), aber auch andere Medien, wie M9, LB oder leichte Abweichungen zu diesen gemeinsamen Medien,erfolgreich 9,15,16 verwendet. Rankenbildung am besten zu FAB mit Glukose als Kohlenstoffquelle und Casaminosäuren (CAA) ergänzten Minimalmedium erreicht, jedoch ohne eine zusätzliche Stickstoffquelle (das heißt, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Wenn Rankenbildung oder Morphologie ist nicht der Schwerpunkt der Studie, dann FAB-Minimalmedium (Werkstoff-Tabelle, Tabelle 1) frei von CAA empfohlen, so dass die Auswirkungen von bestimmten Kohlenstoffquellen und / oder zusätzliche Nährstoffe können im Detail untersucht werden. Andere Arten, wie B. subtilis (hier vorgestellten), sind vielseitig Schwärmer, der fähig ist Schwärmen auf LB-Agar und granuliert. Diese Arten Schwarm einfach und erfordert nur ~ 10 Stunden, um eine vollständige Schwarm zu entwickeln. Diese schnelle wimmelt Rate macht nach dem Fortschreiten der Schwarm möglicherweise schwierig, aber unser Protokoll macht solche Tracking sehr machbar. Die Fähigkeit, Schwarm Zeitraffer-Bildgebung durchführen stellt eine substanliche Leichtigkeit in Schwarm Datenerfassung, insbesondere von solchen begeisterter Schwärmer.
Wir stellen eine robuste, umfassende, Zwei-Phasen-Protokoll und Richtlinien zur Verbesserung der Durchführung und Reproduzierbarkeit der Bakterienoberfläche Motilität Forschung ausgerichtet und wurden in erster Linie betont Aspekte wichtig, Flagellen-vermittelte Schwärmen zu untersuchen. Dieser Schwarm Testprotokoll ausführliche Informationen zu wichtigen Aspekten der Medienzusammensetzung und den Umgang mit Oberflächenbeweglichkeit Platten, um eine größere Konsistenz und Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Forschungsgruppen bieten. Dies wird die Grundlage des Vergleichs zwischen den verschiedenen Forschungsstudien zu verbessern. Darüber hinaus bietet die vorgestellte Ansatz und das Protokoll mittels Forschung zu Schwärmen und Oberflächenbeweglichkeit weniger anfällig gegenüber Umweltänderungen zu machen, indem die Forscher wissen, dass diese Faktoren wirken sich auf ihre Arbeit und Bereitstellung von Lösungsmöglichkeiten (zum Beispiel, wie kleine Veränderungen in Agar beeinflussen wimmelt 4,5 ). Darüber hinaus, um das Protokoll vorgesehenquantifizieren makroskopischen Aspekte Schwärmen, bietet die Möglichkeit, viele Eigenschaften von bakteriellen Oberflächenwachstum, die bisher nicht quantifizierbar waren zu messen.
Wir haben nicht alle Oberflächen bewegliche Bakterien in der Entwicklung dieses Protokolls untersucht. Als solches wird erwartet, dass das Protokoll Modifikationen werden für die hier nicht dargestellten Spezies erforderlich sein. Die Effizienz dieses Protokolls wird durch die inhärenten Beschränkungen der Ausrüstung und der verwendeten Materialien beschränkt. Beispielsweise sind Temperatur Studien nicht möglich, da noch mit dem Bruker Abbildungsstation, da die Temperatursteuerung nicht ein Merkmal der Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Verwendung von Farbstoffen (wie Nilrot um Rhamnolipide zu färben) kinetische und Konzentrationsbeschränkungen 8 haben. Diese Technik stützt sich stark auf die Verarbeitung und Auswertung von Digitalbildern; verbesserte Automatisierung der Datenanalyse (zB durch zusätzliche Macros Skriptfunktion in ImageJ) würde die Zeit für die Analyse benötigt reduzierenund erweitern Sie die Nützlichkeit der Daten. Schließlich, aufgrund der Robustheit der Bildgebungsprotokoll, zukünftige Anwendungen sollte die Erweiterung dieser Technik auf weniger einheitliche Wachstumsoberflächen können, die für Oberflächen von Umwelt- und pathogenen Bakterien besiedelt sind, untersuchen wollen.
The authors have nothing to disclose.
(; Bis MA und JDS R01GM100470 und 1R01GM095959-01A1) und einem Core Facility Zuschuss von der Indiana Clinical and Translational Sciences Institute (teilweise durch NIH Zuschusses # TR000006 UL1 finanziert, teilweise Unterstützung für diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health zur Verfügung gestellt, um JDS).
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |