Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Bakteriel overflade motilitet, såsom sværmer, er almindeligt undersøgt i laboratoriet under anvendelse af plade assays, der kræver specifikke koncentrationer af agar og undertiden optagelse af specifikke næringsstoffer i vækstmediet. Fremstillingen af sådanne eksplicitte medier og overflade vækstbetingelser tjener til at tilvejebringe de gunstige vilkår, der tillader ikke bare bakterievækst, men koordineret motilitet af bakterier i forhold til disse overflader i tynde flydende film. Reproducerbarhed af sværm plade og andre overflade motilitet plade analyser kan være en stor udfordring. Især for mere "tempererede swarmers", der udviser motilitet kun inden agar intervaller af 0,4% -0,8% (vægt / vol), mindre ændringer i protokol eller laboratoriemiljø kan have stor indflydelse sværm analyseresultater. "Fugtningsmulighed" eller vandindhold ved væske-faststof-luft-grænsefladen af disse plade-assays er ofte en vigtig variabel, der skal styres. En yderligere udfordring i vurderingen sværmer er, hvordan at kvantificere observed forskelle mellem to (eller flere) forsøg. Her har vi detaljeret en alsidig tofaset protokol til at forberede og billede sværm assays. Vi inkluderer retningslinjer for at omgå de udfordringer der almindeligvis er forbundet med sværm assaymedier forberedelse og kvantificering af data fra disse analyser. Vi specifikt vise vores fremgangsmåde ved anvendelse af bakterier, der udtrykker fluorescerende eller bioluminescerende genetiske reportere som grønt fluorescerende protein (GFP), luciferase (lux-operonen), eller cellulære pletter at muliggøre time-lapse optisk billeddannelse. Vi yderligere demonstrere evnen til vores metode til at spore konkurrerende sværme arter i det samme forsøg.
Mange bakterier videre overflader ved hjælp af forskellige former for selv-fremdrift. Nogle motilitet fænotyper kan forsket i laboratoriet ved hjælp af plade-assays, der er berørt af den flydende miljø forbundet med halvfast pladeassay sammensætning. En undergruppe af nyttige overflade motilitet plade analyser inddrager endvidere en gasfase-typisk rumluft. Herefter vil resultatet af en bestemt overflade motilitet assay, kræver omhyggelig styring af grænsefladen af tre faser: den lokale miljømæssige faste overflade, flydende miljø og gas miljø egenskaber.
De mest almindeligt studerede motilitet tilstand i en sådan trefaset assay er kendt som swarming. Mylder motilitet er koordineret gruppe bevægelse af bakterielle celler, der drives af deres flageller gennem tynde flydende film på overflader 1. Det er typisk undersøgt i laboratorier, som anvender semi-fast plade assays indeholdende 0,4% -0,8% (vægt / vol) agar 1. En vifte afhumane patogener udnytte denne motilitet adfærd til at udforske og kolonisere den humane vært. Eksempelvis Proteus mirabilis bruger myldrende motilitet at bevæge sig op i urinrøret, og nåede og kolonisere blære og nyrer 2. Sværmer motilitet anses generelt en forløber skridt til biofilmdannelse, den primære årsag til patogenese i mange humane patogener 3.
Det sværmer fænotype er meget varieret blandt bakteriearter; eksperimentel succes og reproducerbarhed stærkt afhængige faktorer som næringsstof sammensætning, agar type og sammensætning, sterilisering protokol (f.eks autoklavering), halvfast medier hærdning, og omgivende fugt (f.eks sæsonudsving), blandt andre 3-5. Variabiliteten af overfladevand motilitet svar understreger de udfordringer, er stødt på i disse undersøgelser og den betydelige indflydelse medier og miljø kan øve. For nogle sværmen arter, såsom Pseudomonas, swarming motility kan opstå på en række forskellige medier kompositioner, selv om den observerede fænotype og ledsagende sværm ekspansion sats vil variere meget 3. Tilsammen disse faktorer kan gøre overfladen motilitet undersøgelser ekstremt udfordrende. Seasonal variation inden for en lab kan påvirke disse trefasede assays: assays kan fungere bedre i den fugtige luft i sommeren og værre i den tørre luft om vinteren. Her præsenterer vi generelle retningslinjer at omgå nogle af de mest bemærkelsesværdige udfordringer, når du udfører overflade motilitet plade studier.
For nogle overflade motilitet undersøgelser, udvikling af specifikke fænotyper er af stor interesse. De fleste, men ikke alle, publicerede undersøgelser for at undersøge myldrer af P. aeruginosa viser dannelsen af slyngtråde eller fraktaler udstråler fra et podning center 3-9. Forskelle mellem P. aeruginosa-stammer er blevet dokumenteret 5,8, men meget af tilstedeværelsen eller fraværet af tråde kan tilskrives specific medium og protokol, der bruges til disse sværm motilitet plade assays. Her nævnes vi oplysninger om, hvordan man kan fremme tendril-dannende sværme for P. aeruginosa. Fordi P. aeruginosa er blot en af mange sværme bakterier, vi har også oplysninger om vores metode til at undersøge myldrer af Bacillus subtilis og svæveflyvning af Myxococcus xanthus. Ligesom P. aeruginosa, aktuel forskning på B. subtilis og M. xanthus spænder en bred vifte af emner som forskerne arbejder på at skelne aspekter af sporedannelsen, motilitet, stress respons, og overgangs- adfærd 1,10. Der er behov for at kvantificere mønstre og dynamik bestemt adfærd (er) for disse celler i sværme grupper.
Erhvervelse Surface motilitet data, kan analyse og fortolkning være besværlig og kvalitative. Vi har udviklet en protokol for den detaljerede makroskopiske analyse af bakterielle sværme, der giver ud over at sværme zone morfologi og sIZE (f.eks diameter), kvantitativ dynamisk information om sværm ekspansion sats og bakteriel eller bioproduct tæthed fordeling 7. Endvidere kan denne fremgangsmåde udnytte tilgængelige fluorescerende proteiner, luminescens, og farvestoffer for at opnå et samlet overblik over bakterielle interaktioner 8, samt at spore syntesen af Bioproducts (fx P. aeruginosa rhamnolipidbiooverfladeaktivt 7,8) inden for en sværm.
Kan være en udfordring at opnå reproducerbare sværmer i et laboratorium, som sværm assays er meget følsomme over for miljøfaktorer, såsom fugtighed og tilgængelige næringsstoffer. Det mest kritiske aspekt af en overflade motilitet plade assay er fugt på agaroverfladen. Før inokulering skal swarm medier være tør nok til at forhindre bakterieceller fra svømning over overfladen flydende, men ikke så tør som at inhibere swarming motilitet 5. Inkubering bør finde sted i en tilstrækkelig fugtigt miljø: for lidt fugt kan resultere i assayet udtørring under inkubation, mens for megen fugt kan føre til en kunstig eller kunstig overflade spredes. Medmindre et fugt-kontrollerede inkubator er ved hånden, kan inkubator og laboratorium fugtighed varierer voldsomt. Derfor kan et yderligere vandreservoir, en luftfugter eller en affugter i inkubatoren være nødvendig for at undgå overtørring eller akkumulering af overskydende fugt og samtidig holde vedrøive luftfugtighed nær 80%. Fastholdelse af denne ideelle luftfugtighed kan vise sig udfordrende, hvis sæsonudsving luftfugtighed er betydelige. Hvis dette er tilfældet, vil sværmen assayprotokollen kræver nogle justeringer for at tage højde for sæsonbetingede ændringer i luftfugtighed. Vi har fundet, at modificere sværmen medier tørretid er den enkleste måde at justere for sæsonudsving luftfugtighed. Overvågning konstant fugtighed, både i og uden for kuvøsen, anbefales. Endvidere anbefales det, at forskerne kalibrere og validere deres instrumenter, væksthuse, skalaer mm som mindre fejl i temperatur, volumen eller mængder af mediekomponenter kan påvirke reproducerbarheden af disse analyser.
Det skal også bemærkes, at den type og størrelse af den plade, der anvendes i assayet, kan påvirke pladen fugt og dermed swarming. Lufttætte plader ikke lufte overskydende fugt og dermed tilskynde svømning motilitet. Derimod åbne faced plader tillader for meget fugt at undslippe. En petriskåltilvejebringer et ideelt miljø, fordi det vents off nok fugt til at forhindre væske opbygge, men bevarer nok fugt til at forhindre mediet i at tørre ud. Denne metode beskriver en overflade motilitet assay-protokol, der giver mulighed for høj billedkvalitet. For at holde agar klar til retter diameter billeddannelse 60 mm er fyldt med 7,5 ml agar medier. Hvis detaljeret imaging ikke er påkrævet, kan mængder op til 20 ml også give reproducerbare resultater.
Mens myldrer motilitet kan opnås på en bred vifte af agar koncentrationer, det optimale udvalg af agar kræves for sværmer afhænger af arten. Samlet set hæmmer højere koncentrationer agar sværmer motilitet og dermed den nødvendige tid til at producere et billede-klar sværm stiger. P. aeruginosa generelt nøgne sværme agar-koncentrationer mellem 0,4-0,7% 1, men vi finder, at optimal sværmer forekommer i et meget snævrere interval (0,4-0,5%). Andre, såsom B. subtilis og S. enterisken sværm på 0,6% agar, og Vibrio parahaemolyticus 1,5% agar 10. Den nødvendige agarkoncentration bestemmes også af den type og mærke agar. Højere renhed agarer, ligesom Noble agar, kraftigt øge sværmer i P. aeruginosa og foretrækkes frem granuleret agar 13,14. Disse oprensede udgaver af agar er også mere tilbøjelige til at caramelization i autoklaven steriliseringscyklussen; afhængigt af instrumentet, en forkortet / modificeret sterilisation sekvens (for eventuelt at ændre udstødningen cyklus for at forhindre langvarig varme eksponering) kan det være nødvendigt at forberede sværm medier ved hjælp af Noble agar.
Media sammensætning spiller også en rolle i den observerede sværmen fænotype 3. P. aeruginosa swarming motilitet undersøgelser udføres sædvanligvis ved hjælp af minimal næringsmedier. Vi foretrækker FAB medium 4,8 (Materialer Table), men andre medier, såsom M9, LB eller små variationer til disse fælles medier,er blevet anvendt med succes 9,15,16. Tendril formation opnås bedst på FAB minimal medium suppleret med glucose som carbonkilden og casaminosyrer (CAA), men uden en yderligere nitrogenkilde (dvs. (NH4) 2 SO4) 6,13. Hvis slyngtråd dannelse eller morfologi er ikke det vigtigste fokus i undersøgelsen, så FAB minimalt medium (Materialer tabel, tabel 1) blottet for CAA anbefales således, at virkningerne af specifikke kulstofkilder og / eller yderligere næringsstoffer kan studeres i detaljer. Andre arter, såsom B. subtilis (præsenteres her), er alsidige swarmers, som kan sværme på LB og granuleret agar. Disse arter sværmer let og kræver kun ~ 10 timer til at udvikle en fuld sværm. Denne hurtige sværmer rente gør efter progression af potentielt vanskelige sværm men vores protokol gør sådan sporing meget realistisk. Evnen til at udføre sværm time-lapse billedbehandling giver en stofferoplys- lethed i købet sværm data, især fra sådanne ivrige swarmers.
Vi introducerer en robust, omfattende, tofaset protokol og retningslinjer til formål at forbedre gennemførelsen og reproducerbarhed af bakteriel overflade motilitet forskning og har primært understreget aspekter vigtigt at undersøge flagellært-medieret sværmer. Denne sværm assayprotokollen detaljer vigtige aspekter af sammensætning og håndtering af overfladevand motilitet plader medier til at sørge for større sammenhæng og reproducerbarhed inden for og blandt forskergrupper. Dette vil forbedre sammenligningsgrundlaget mellem forskellige forskningsundersøgelser. Desuden præsenteres tilgang og protokol tilvejebringer midler til at gøre forskning sværmning og overflade motilitet mindre modtagelige for miljømæssige variationer ved at forskere klar over, at sådanne faktorer påvirker deres arbejde og levere mulige løsninger (f.eks, hvor små ændringer i agar påvirke swarming 4,5 ). Desuden protokollen i henhold tilkvantificere makroskopiske aspekter af sværmer, giver mulighed for at måle mange attributter af bakteriel overflade vækst, som tidligere ikke kan kvantificeres.
Vi har ikke undersøgt alle overflader bevægelige bakterier i udviklingen af denne protokol. Som sådan forventes det, at protokol ændringer vil være behov for arter, der ikke præsenteret her. Effektiviteten af denne protokol er begrænset af de iboende grænser for udstyr og materialer anvendes. For eksempel temperatur relaterede undersøgelser er ikke mulig, da endnu med Bruker imaging station, da temperaturkontrol er ikke en funktion af udstyret. Desuden kan anvendelsen af farvestoffer (såsom Nile Red til farvning rhamnolipider) har kinetiske og koncentration begrænsninger 8. Denne teknik stærkt afhængig af behandling og analyse af digitale billeder; forbedret automatisering af dataanalyse (f.eks ved brug af yderligere makroer script funktion i ImageJ) vil reducere den nødvendige tid til analyseog udvide anvendeligheden af de data. Endelig, på grund af robustheden af den billeddannende protokollen, skal fremtidige applikationer sigte på at udvide denne teknik til at undersøge mindre ensartet vækst overflader, der er mere relevante for overflader koloniseret af miljømæssige og patogene bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Delvis støtte til dette arbejde blev leveret af National Institute of Health (R01GM100470 og 1R01GM095959-01A1, til MA og JDS) og en Core Facility bevilling fra Indiana Kliniske og Translationelle Sciences Institute (finansieret delvist af NIH tilskud # UL1 TR000006; til JDS).
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |