Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
La motilidad superficie bacteriana, tales como enjambre, se examina comúnmente en el laboratorio usando los ensayos de placa que requieren concentraciones específicas de agar y, a veces inclusión de nutrientes específicos en el medio de crecimiento. La preparación de tales medios y condiciones de crecimiento explícitas superficie sirve para proporcionar las condiciones favorables que permiten no sólo el crecimiento de bacterias, pero la motilidad coordinada de las bacterias más de estas superficies dentro de películas líquidas delgadas. La reproducibilidad de la placa de enjambre y otros ensayos de placa de motilidad superficie puede ser un gran desafío. Especialmente para los más "enjambres templados" que muestran la motilidad sólo dentro de los rangos de agar de 0,4% -0,8% (p / v), cambios menores en el protocolo o entorno de laboratorio puede influir mucho en los resultados del ensayo de enjambre. "Humectabilidad", o contenido de agua en la interfase líquido-sólido-aire de estos ensayos de placa, a menudo es una variable clave para ser controlado. Un reto adicional en la evaluación de la enjambrazón es cómo cuantificar observed diferencias entre dos (o más) experimentos. A continuación te detallamos un protocolo de dos fases versátil para preparar y ensayos imagen enjambre. Incluimos directrices para eludir los retos comúnmente asociados con la preparación de medios de ensayo de enjambre y cuantificación de los datos de estos ensayos. En especial, demostramos nuestro método utilizando bacterias que expresan los periodistas genéticas fluorescentes o bioluminiscentes como proteína verde fluorescente (GFP), luciferasa (operón lux), o manchas celulares para permitir imágenes ópticas-time lapse. Además, demuestran la capacidad de nuestro método para rastrear competir especies que pululan en el mismo experimento.
Muchas bacterias se mueven sobre superficies utilizando diversos medios de auto-propulsión. Algunos fenotipos de motilidad se pueden investigar en el laboratorio usando los ensayos de placa que se ven afectados por el medio líquido asociado con la composición de ensayo de placa de semi-sólido. Un subconjunto de la superficie útil ensayos de placa motilidad implica además un aire de gas fase típicamente habitación. En consecuencia, el resultado de cualquier ensayo de la motilidad superficie en particular, exige un cuidadoso control de la interfaz de tres fases: la superficie sólida ambiental local, el medio ambiente líquido y propiedades de entorno gas.
El modo de la motilidad más comúnmente estudiado en un ensayo de este tipo de tres fases se conoce como un enjambre. Motilidad enjambre es el movimiento grupo coordinado de las células bacterianas que son impulsados por sus flagelos a través de películas líquidas delgadas sobre superficies 1. Se estudia normalmente en laboratorios utilizando los ensayos de placa semi-sólidos que contienen 0,4% -0,8% (p / v) de agar 1. Una serie depatógenos humanos explotan este comportamiento motilidad para explorar y colonizar el huésped humano. Por ejemplo, Proteus mirabilis utiliza la motilidad enjambre de ascender en la uretra, alcanzando y colonizar la vejiga y los riñones 2. Motilidad enjambrazón es generalmente considerado como un paso precursor de la formación del biofilm, la causa principal de la patogénesis de muchos patógenos humanos 3.
El fenotipo enjambre es muy variada entre las especies bacterianas; el éxito experimental y reproducibilidad dependen en gran medida de factores tales como la composición de nutrientes, el tipo de agar y la composición, el protocolo de esterilización (por ejemplo, esterilización en autoclave), semi-sólida de curado medios de comunicación, y de la humedad ambiente (por ejemplo, cambios estacionales), entre otros 3-5. La variabilidad de las respuestas de la motilidad de superficie hace hincapié en los problemas encontrados en estos estudios y los medios de influencia significativa y el medio ambiente pueden ejercer. Para algunas especies que pululan, como Pseudomonas, mot enjambreility puede ocurrir en una variedad de composiciones de medios, aunque el fenotipo observado y acompañando tasa de expansión enjambre variarán en gran medida 3. Combinados, estos factores pueden hacer estudios de motilidad superficie extremadamente desafiante. La variabilidad estacional dentro de un laboratorio puede influir en estos ensayos de tres fases: ensayos pueden funcionar mejor en el aire húmedo del verano y peor en el aire seco del invierno. Aquí presentamos las pautas generales para evitar algunos de los desafíos más notables cuando se realizan estudios de superficie de la placa de la motilidad.
Para algunos estudios de la motilidad de la superficie, el desarrollo de fenotipos específicos es de gran interés. La mayoría, aunque no en todos los estudios publicados para examinar enjambre de P. aeruginosa muestran la formación de zarcillos o fractales que irradian desde un centro de inoculación 3-9. Las diferencias entre P. aeruginosa cepas se han documentado 5,8, pero gran parte de la presencia o ausencia de zarcillos pueden ser atribuidos a la especific medio y el protocolo usado para estos ensayos de placa de la motilidad enjambre. Aquí se incluyen los detalles sobre cómo promover enjambres zarcillo de formación para P. aeruginosa. Debido P. aeruginosa es sólo una de las muchas bacterias que pululan, también incluimos detalles de nuestro método para examinar enjambre de Bacillus subtilis y vuelo sin motor de Myxococcus xanthus. Como P. aeruginosa, la investigación actual sobre B. subtilis y M. xanthus abarca una variedad de temas como los investigadores están trabajando para discernir los aspectos de la esporulación, la motilidad, la respuesta al estrés, y el comportamiento de transición 1,10. Hay una necesidad de cuantificar los patrones y la dinámica del comportamiento específico (s) para estas células en grupos enjambre.
Adquisición de datos de la motilidad de superficie, el análisis y la interpretación puede ser engorroso y cualitativa. Hemos desarrollado un protocolo para el análisis macroscópico detallada de enjambres bacterianas que ofrece además a pulular morfología de zona y size (por ejemplo, diámetro), información dinámica cuantitativa sobre tasa de expansión enjambre y distribución bacteriana o la densidad de bioproductos 7. Además, este método puede tomar ventaja de las proteínas fluorescentes disponibles, luminiscencia, y colorantes para obtener una visión global de las interacciones bacterianas 8, así como para realizar un seguimiento de la síntesis de bioproductos (por ejemplo, P. aeruginosa ramnolípido 7,8) dentro de un enjambre.
El logro de la enjambrazón reproducible en un laboratorio puede ser un reto, como ensayos de enjambres son muy sensibles a los factores ambientales, como la humedad y los nutrientes disponibles. El aspecto más crítico de una superficie de ensayo de placa de la motilidad es la humedad en la superficie del agar. Antes de la inoculación, los medios de enjambre deben ser lo suficientemente seco para evitar que las células bacterianas de nadar a través de la superficie del líquido, pero no tan seco como para inhibir la motilidad enjambre 5. La incubación debe tener lugar en un entorno suficientemente húmedo: demasiado poca humedad puede dar lugar a la desecación de ensayo durante la incubación, mientras que el exceso de humedad puede conducir a la superficie artificial o artefactos difusión. A menos que una incubadora con control de humedad está a la mano, incubadora y humedad de laboratorio pueden variar dramáticamente. En consecuencia, un depósito adicional de agua, un humidificador, o un deshumidificador dentro de la incubadora podrían ser necesarias para evitar el exceso de secado o la acumulación de exceso de humedad mientras se mantiene la relative humedad cercana al 80%. El mantenimiento de esta humedad ideal puede resultar difícil si los cambios de humedad estacionales son significativos. Si este es el caso, el protocolo de ensayo enjambre requerirá algunos ajustes para tener en cuenta los cambios estacionales de humedad. Hemos encontrado que la modificación del tiempo de secado medios enjambre es la forma más sencilla para ajustar los cambios de humedad estacionales. Vigilancia de la humedad constante, tanto dentro como fuera de la incubadora, se recomienda. Además, se recomienda que los investigadores calibrar y validar sus instrumentos, incubadoras, escalas, etc. errores como de menor importancia en la temperatura, volumen o cantidades de los componentes del medio pueden afectar la reproducibilidad de estos ensayos.
También debe tenerse en cuenta que el tipo y tamaño de la placa usada en el ensayo pueden afectar a la humedad placa, y por lo tanto enjambre. Placas herméticos no ventilar el exceso de humedad, favoreciendo así la natación motilidad. En contraste, las placas de libro abierto permiten demasiada humedad se escape. Un plato Petriproporciona un entorno ideal, ya que ventila fuera suficiente exceso de humedad para evitar que el líquido se acumule, pero retiene la humedad suficiente para evitar que los medios de comunicación se sequen. Este método detalla un protocolo de ensayo de la motilidad superficie que permite la formación de imágenes de alta calidad. Para mantenerse separado para platos de imágenes de 60 mm de diámetro están llenas de 7,5 ml de medio de agar agar. Si no se requiere formación de imágenes se detalla, volúmenes de hasta 20 ml también pueden proporcionar resultados reproducibles.
Mientras que la motilidad enjambre se puede lograr en una amplia gama de concentraciones de agar, el rango óptimo de agar requerido para enjambre depende de la especie. En general, las concentraciones más altas de agar inhiben la motilidad enjambre, y por consiguiente el tiempo necesario para producir una imagen-listo enjambre aumenta. P. aeruginosa general pulula sobre las concentraciones de agar entre 0,4-0,7% 1, sin embargo, nos encontramos con que la enjambrazón óptima se produce en un rango mucho más estrecho (0,4-0,5%). Otros, como el B. subtilis y S. entéricoun enjambre en el 0,6% de agar, y Vibrio parahaemolyticus en el 1,5% de agar 10. La concentración de agar requerido se determina por el tipo y marca de agar. Agares de mayor pureza, como agar Noble, mejoran fuertemente pululando en P. aeruginosa y se prefieren sobre agar granulado 13,14. Sin embargo, estas versiones purificadas de agar también son más propensos a la caramelización durante el ciclo de esterilización en autoclave; dependiendo del instrumento, una secuencia abreviada / modificado esterilización (para alterar posiblemente el ciclo de escape para evitar la exposición prolongada al calor) puede ser necesaria para preparar los medios enjambre utilizando agar Noble.
Composición de los medios de comunicación también juega un papel en el fenotipo observado enjambre 3. P. aeruginosa estudios de motilidad enjambre se realizan generalmente utilizando medios nutrientes mínimos. Preferimos FAB medio de 4,8 (Tabla de Materiales), pero otros medios, como la M9, LB, o ligeras variaciones a estos medios de comunicación comunes,se han utilizado con éxito 9,15,16. Formación Tendril se logra mejor en FAB medio mínimo suplementado con glucosa como fuente de carbono y casaminoácidos (CAA), pero sin una fuente de nitrógeno adicional (es decir, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Si la formación zarcillo o la morfología no es el foco principal del estudio, a continuación, FAB medio mínimo (Tabla de Materiales; Tabla 1) carente de CAA se recomienda de manera que los efectos de las fuentes de carbono específicas y / o nutrientes adicionales pueden ser estudiados en detalle. Otras especies, tales como B. subtilis (presentada aquí), son enjambres versátiles, capaces de enjambre en LB y agar granulado. Estas especies pululan fácilmente, requiriendo sólo ~ 10 horas para desarrollar un enjambre completo. Esta tasa enjambre rápido hace siguiendo la progresión del enjambre potencialmente difícil, pero nuestro protocolo hace que tal seguimiento muy factible. La capacidad de realizar time-lapse enjambre proporciona una Sustanciacial facilidad en la adquisición de datos enjambre, particularmente de tales enjambres ávidos.
Se introduce un e integral, el protocolo de dos fases sólida y directrices encaminadas a mejorar la ejecución y la reproducibilidad de la investigación motilidad superficie bacteriana y hemos hecho hincapié principalmente aspectos importante examinar enjambre flagelar mediada. Este protocolo de ensayo enjambre detalla aspectos importantes de la composición de los medios y la manipulación de placas de motilidad superficie para proporcionar una mayor consistencia y reproducibilidad dentro y entre los grupos de investigación. Esto mejorará la base de la comparación entre los diferentes estudios de investigación. Además, el enfoque presentado y el protocolo proporciona los medios para hacer que la investigación en enjambre y la superficie de la motilidad menos susceptible a las variaciones ambientales haciendo investigadores conscientes de que tales factores afectan a su trabajo y proporcionar posibles soluciones (por ejemplo, ¿cómo pequeños cambios en agar afectan enjambre 4,5 ). Además, el protocolo proporciona acuantificar aspectos macroscópicos de enjambrazón, proporciona una oportunidad para medir muchos atributos de crecimiento de la superficie bacteriana que antes eran imposible de cuantificar.
No hemos examinado todas las bacterias móviles de superficie en el desarrollo de este protocolo. Como tal, se espera que se requerirán modificaciones de protocolo para las especies no se presentan aquí. La eficacia de este protocolo está restringido por los límites inherentes de los equipos y materiales empleados. Por ejemplo, los estudios relacionados con la temperatura hasta el momento con la estación de formación de imágenes Bruker no son posibles, ya que el control de temperatura no es una característica del equipo. Además, el uso de colorantes (tales como Rojo Nilo para teñir ramnolípidos) puede tener limitaciones cinéticas y de concentración 8. Esta técnica se basa fuertemente en el procesamiento y análisis de imágenes digitales; mejora de automatización de análisis de datos (por ejemplo, usando macros adicionales en función de script ImageJ) reduciría el tiempo necesario para el análisisy expandir la utilidad de los datos. Por último, debido a la robustez del protocolo de imágenes, aplicaciones futuras deberían tener como objetivo la ampliación de esta técnica para examinar las superficies de crecimiento menos uniformes que son más relevantes para las superficies colonizadas por bacterias ambientales y patógenos.
The authors have nothing to disclose.
Apoyo parcial de este trabajo fue proporcionado por el Instituto Nacional de Salud (R01GM100470 y 1R01GM095959-01A1; a MA y JDS) y una donación del Fondo Core del Instituto de Ciencias clínica y traslacional Indiana (financiado en parte por el NIH subvención # TR000006 UL1; a JDS).
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |