Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.
Bakteriell yta motilitet, såsom svärmning, vanligen undersöks i laboratorium med plattanalyser som kräver specifika koncentrationer av agar och ibland inkludera specifika näringsämnen i tillväxtmediet. Beredningen av sådana explicita media och tillväxtytan villkor tjänar att ge de gynnsamma förhållanden som tillåter inte bara bakterietillväxt men samordnad motilitet av bakterier över dessa ytor inom tunna vätskefilmer. Reproducerbarhet svärm platta och andra ytan motilitet plattanalyser kan vara en stor utmaning. Speciellt för mer "tempererade swarmers" som uppvisar motilitet endast inom agar intervall av 0,4% -0,8% (vikt / vol), smärre förändringar i protokoll eller laboratoriemiljö kan kraftigt påverka svärm analysresultat. "Vätbarhet", eller vatteninnehåll på mellan flytande och fast-luftgränssnitt av dessa plattanalyser, är ofta en viktig variabel som skall kontrolleras. En ytterligare utmaning i bedömningen svärmning är hur man kvantifiera observed skillnader mellan två (eller flera) experiment. Här har vi detalj en mångsidig två-fas-protokollet för att förbereda och bild svärm analyser. Vi inkluderar riktlinjer för att kringgå de utmaningar som vanligen förknippas med svärm analys media förberedelse och kvantifiering av data från dessa analyser. Vi visar specifikt vår metod med hjälp av bakterier som uttrycker fluorescerande eller självlysande genetiska reportrar som grönt fluorescerande protein (GFP), luciferas (lux operon) eller cellulära fläckar för att möjliggöra tidsförlopp optisk avbildning. Vi visar vidare förmågan hos vår metod för att spåra konkurrerande svärm arter i samma experiment.
Många bakterier flyttar på ytor med hjälp av olika medel för själv framdrivning. Vissa motilitet fenotyper kan forskat i laboratoriet med hjälp plattanalyser som påverkas av den flytande miljön i samband med den halvfasta plattanalyskompositionen. En delmängd av användbar yta motilitet plattanalyser vidare innebära en gasfas-typiskt rumsluften. Följaktligen resultatet av någon särskild yta motilitet analys, kräver noggrann kontroll av gränssnittet i tre faser: den lokala miljö fast yta, flytande miljö och gas miljö egenskaper.
Den vanligast studerade motilitet läge i ett sådant tre-fas-analys är känd som svärmar. Myllrande motilitet är samordnad grupp rörelse bakterieceller som drivs av sin flag genom tunna vätskefilmer på ytor 1. Det är oftast studeras i laboratorier som använder halvfasta plattanalyser som innehåller 0,4% -0,8% (vikt / vol) agar 1. En matris avmänskliga patogener utnyttja denna rörlighet beteende för att utforska och kolonisera den mänskliga värden. Till exempel använder Proteus mirabilis myllrande motilitet att flytta upp i urinröret, når och kolonisera urinblåsan och njurarna 2. Myllrande motilitet anses allmänt som en föregångare steg för att biofilmbildning, den främsta orsaken till patogenes i många humana patogener 3.
Den myllrande fenotyp är mycket varierande bland bakteriearter; experimentell framgång och reproducerbarhet förlitar starkt på faktorer som näringssammansättning, agar typ och sammansättning, sterilisering protokoll (t.ex. autoklave), halvfasta medier härdning, och omgivande fukt (t.ex. säsongsmässiga förändringar), bland annat 3-5. Variationen i ytan motilitet svar betonar de utmaningar som uppstått i dessa studier och de betydande inflytande media och miljö kan utöva. För vissa swarming arter, såsom Pseudomonas, svärm MOTbilitet kan uppstå på en mängd olika medie kompositioner, även om den observerade fenotypen och medföljande svärm expansionstakt kommer att variera kraftigt 3. Tillsammans har dessa faktorer kan göra ytan motilitet studier extremt utmanande. Säsongs variabilitet inom ett labb kan påverka dessa trefas analyser: analyser kan fungera bättre i den fuktiga luften i sommar och värre i den torra luften i vintern. Här presenterar vi de allmänna riktlinjer för att kringgå några av de mest anmärkningsvärda utmaningarna när du utför yta motilitet plattstudier.
För vissa ytliga motilitet studier, är av stort intresse för utvecklingen av specifika fenotyper. De flesta, men inte alla, publicerade studier för att undersöka svärmning av P. aeruginosa visar bildandet av rankor eller fraktaler strålar ut från en ympning centrum 3-9. Skillnader mellan P. aeruginosa stammar har dokumenterats 5,8, men mycket av närvaron eller frånvaron av rankor kan hänföras till den specific medium och protokoll som används för dessa svärm motilitet plattanalyser. Här tar vi information om hur man kan främja klänge bildande svärmar för P. aeruginosa. Eftersom P. aeruginosa är bara en av många myllrande bakterier, inkluderar vi även information om vår metod för att undersöka svärmning av Bacillus subtilis och glida av Myxococcus Xanthus. Liksom P. aeruginosa, aktuell forskning om B. subtilis och M. Xanthus spänner en rad ämnen som forskarna arbetar med att urskilja aspekter av sporulering, motilitet, stress, och övergångsbeteende 1,10. Det finns ett behov av att kvantifiera de mönster och dynamik i specifikt beteende (er) för dessa celler i swarming grupper.
Surface motilitet datainsamling, kan analys och tolkning vara besvärliga och kvalitativ. Vi har utvecklat ett protokoll för detaljerade makro- analys av bakteriella svärmar som ger förutom svärma zon morfologi och size (t.ex. diameter), kvantitativ dynamisk information om svärm expansionstakt och bakteriell eller bioprodukt densitetsfördelning 7. Dessutom kan denna metod utnyttja tillgängliga fluorescerande proteiner, luminiscens, och färgämnen för att få en heltäckande bild av bakteriella interaktioner 8, samt för att spåra syntesen av bioprodukter (t.ex. P. aeruginosa ramnolipid 7,8) inom en svärm.
Att uppnå reproducerbar myllrande i ett laboratorium kan vara en utmaning, eftersom svärm analyser är mycket känsliga för miljöfaktorer såsom fukt och tillgängliga näringsämnen. Den mest kritiska aspekten av en yta motilitet platta analysen är fukt på agarytan. Före ympning måste svärm media vara torr nog för att förhindra bakterieceller från att simma över ytan flytande, men inte så torr som att hämma myllrande motilitet 5. Inkubation bör ske på ett tillräckligt fuktig miljö: för lite fukt kan resultera i analys uttorkning under inkubation, medan för mycket fukt kan leda till konstgjorda eller arte yta sprids. Om inte en fuktkontrollerad inkubator finns till hands, kan inkubator och laboratoriefuktigheten varierar kraftigt. Följaktligen kan en extra vattenbehållare, en luftfuktare eller en avfuktare inom inkubatorn krävas för att förhindra över torkning eller ansamling av fukt samtidigt som relative fuktighet nära 80%. Att upprätthålla detta ideal luftfuktighet kan visa sig utmanande om säsongsmässiga förändringar luftfuktighet är betydande. Om så är fallet, kommer svärmen analysprotokoll kräva vissa justeringar för att ta hänsyn till säsongsmässiga förändringar i luftfuktighet. Vi har funnit att modifiera svärm medie torktid är det enklaste sättet att justera för säsongsmässiga förändringar luftfuktighet. Konstant övervakning luftfuktighet, både inom och utanför inkubatorn, rekommenderas. Vidare rekommenderas att forskarna kalibrera och validera sina instrument, företagskuvöser, skalor, etc. som mindre fel i temperatur, volym eller mängder av media komponenter kan påverka reproducerbarhet av dessa analyser.
Det bör också noteras att typen och storleken på plattan som används i analysen kan påverka platt fukt, och sålunda svärmar. Lufttäta plattor inte ventilera bort fukt, vilket uppmuntrande simning motilitet. Däremot open-faced plattor tillåter för mycket fukt att fly. En petriskålger en idealisk miljö för att det ventilerar bort tillräckligt fukt för att förhindra vätska bygga upp, men behåller tillräckligt med fukt för att förhindra att medierna från att torka ut. Denna metod detaljer en yta motilitet analysprotokoll som möjliggör hög bildkvalitet. För att hålla agar klart för rätter avbildning 60 mm diameter är fyllda med 7,5 ml agarmedia. Om detaljerad avbildning inte krävs, kan volymerna upp till 20 ml också ge reproducerbara resultat.
Medan myllrande motilitet kan uppnås på ett brett spektrum av agar koncentrationer, det optimala intervallet agar krävs för svärmning beror på arten. Sammantaget hämmar högre agar koncentrationer myllrande motilitet, och följaktligen den tid som krävs för att producera en bild-ready svärm ökar. P. aeruginosa myllrar allmänhet på agar koncentrationer 0,4-0,7% 1, men vi tycker att optimal svärmning sker i ett mycket smalare utbud (0,4-0,5%). Andra, såsom B. subtilis och S. enterisken svärm på 0,6% agar, och Vibrio parahaemolyticus på 1,5% agar 10. Den erforderliga agarkoncentration bestäms också av den typ och märke av agar. Högre renhet agar, som Noble agar, starkt öka svärma i P. aeruginosa och föredras framför granulerad agar 13,14. Dessa renade versioner av agar är också mer benägna att karamellise under autoklavsterilisering cykeln; beroende på instrumentet, en förkortad / modifierat steriliseringssekvens (för att eventuellt ändra avgascykeln för att förhindra långvarig värmeexponering) kan vara skyldigt att upprätta svärm media med Noble agar.
Media sammansättning spelar också en roll i den observerade svärmen fenotypen 3. P. aeruginosa myllrande motilitet studier utförs vanligen använder minimala näringsmedier. Vi föredrar FAB medel 4,8 (Material tabell), men andra medier, såsom M9, LB, eller små variationer på dessa vanliga medier,har använts med framgång 9,15,16. Tendril bildning uppnås bäst på FAB minimalt medium kompletterat med glukos som kolkälla och kasaminosyror (CAA), men utan en ytterligare kvävekälla (dvs., (NH4) 2 SO4) 6,13. Om tendril bildning eller morfologi är inte huvudfokus i studien, då FAB minimalmedium (Material tabell, Tabell 1) saknar CAA rekommenderas så att effekterna av specifika kolkällor och / eller ytterligare näringsämnen kan studeras i detalj. Andra arter, såsom B. subtilis (presenteras här), är mångsidiga swarmers, kan svärma på LB och granulerad agar. Dessa arter svärm lätt, kräver endast ~ 10 tim för att utveckla ett komplett svärm. Denna snabba myllrande takt gör efter utvecklingen av svärmen potentiellt svårt men våra protokoll gör sådan spårning mycket möjligt. Förmågan att utföra svärm tidsförlopp avbildning ger en substantial lätthet i svärm datainsamling, särskilt från sådana ivrig swarmers.
Vi introducerar en robust, heltäckande, två-fas-protokoll och riktlinjer som syftar till att förbättra genomförandet och reproducerbarhet av bakteriell yta motilitet forskning och har främst betonat aspekter viktigt att undersöka flagellära medierad svärmning. Denna svärm analysprotokoll detaljer viktiga aspekter av medie sammansättning och hantering av ytan motilitet plattor för att ge större konsekvens och reproducerbarhet inom och mellan forskargrupper. Detta kommer att förbättra grunden för jämförelsen mellan olika forskningsstudier. Dessutom ger den presenterade tillvägagångssättet och protokoll medel för att göra forskningen om svärmning och ytan motilitet mindre känsliga för miljövariationer genom att forskare medvetna om att sådana faktorer påverkar deras arbete och ge möjliga lösningar (t.ex. hur små förändringar i agar påverkar svärma 4,5 ). Vidare protokollet lämnas tillkvantifiera makroskopiska aspekter av svärmning, ger en möjlighet att mäta många attribut av bakterieytan tillväxt som tidigare omöjliga att uppskatta.
Vi har inte undersökt alla ytvatten rörliga bakterier i utvecklingen av detta protokoll. Som sådan, är det förväntat att protokoll modifieringar kommer att krävas för arter som inte presenteras här. Effektiviteten av detta protokoll begränsas av de inneboende gränserna för utrustning och material som används. Till exempel, temperaturrelaterade studier är inte möjlig ännu med Bruker avbildningsstationen, eftersom temperaturreglering är inte en funktion av utrustningen. Dessutom kan användningen av färgämnen (såsom Nilrött att färga rhamnolipids) har kinetiska och koncentrationsbegränsningar 8. Denna teknik bygger starkt på bearbetning och analys av digitala bilder; förbättrad automatisering av dataanalys (t.ex. med hjälp av ytterligare Makron script funktion i ImageJ) skulle minska den tid som behövs för analysoch utöka nyttan av uppgifterna. Slutligen, på grund av robusthet bildprotokoll, bör framtida tillämpningar syfta utöka denna teknik för att undersöka mindre enhetliga tillväxtytor som är mer relevanta för ytor koloniserades av miljö- och patogena bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Delvis stöd för detta arbete lämnades av National Institute of Health (R01GM100470 och 1R01GM095959-01A1, till MA och JDS) och en Core Facility bidrag från Indiana Kliniska och translations Sciences Institute (finansierat delvis av NIH bidrag # UL1 TR000006; till JDS).
Materials table | ||||
Company | Catalog Number | Amount | Comments | |
Reagentsa: | ||||
FAB Minimal Media: | Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O. | |||
(NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | 2 g | Not used in P. aeruginosa tendril formation studies. |
Na2HPO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 9 g | |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | 3 g | |
NaCl | BDH | BDH8014 | 3 g | |
MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) | Fisher Scientific | M33 | 1 ml | |
CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) | Fisher Scientific | C79 | 1 ml | |
Trace metal solution (see below) | n/a | n/a | 1 ml | |
Trace Metal Solution: | Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil. | |||
CaSO4 x 2H2O | Sigma-Aldrich | 255548 | 200 mg | |
MnSO4 x H2O | Sigma-Aldrich | M7634 | 20 mg | |
CuSO4 x 5H2O | Fisher Scientific | C493 | 20 mg | |
ZnSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | 20 mg | |
CoSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | C6768 | 10 mg | |
NaMoO4 x 2H2O | Sigma | S6646 | 10 mg | |
H3BO3 | Fisher Scientific | A74 | 5 mg | |
FeSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | 200 mg | |
CTT Media: | Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O. | |||
Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) | Amresco | 0234 | 1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) | Sigma-Aldrich | P3786 | 0.1 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore). |
MgSO4 solution | Fisher Scientific | M65 | 0.8 ml | Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore). |
Casitone | BD Diagnostics | 225930 | 1 g | |
Additional Reagents: | ||||
LB Broth, Lennox | BD Diagnostics | 240230 | 2 % (wt/vol) | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media | Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving. |
Casamino acids (CAA) | Amresco | J851 | 0.10 % (wt/vol) | Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Sigma-Aldrich | A5431 | 0.45 % (wt/vol) | Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Noble | Affymetrix | 10907 | 1.50 % (wt/vol) | Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving. |
Agar, Granulated | Fisher Scientific | BP1423 | 0.60 % (wt/vol) | |
Higgins Waterproof Black India Ink | Higgins | HIG44201 | 0.50 % (vol/vol) | Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture. |
SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S-11346 | Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 µl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving). | |
Relevant Materials and Equipment: | ||||
Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-326 | ||
Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-342 | ||
Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H) | VWR | 25384-092 | ||
In-Vivo Xtream | Bruker | Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html | ||
Bruker MI software | Bruker | http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf | ||
ImageJ software | NIH | http://imagej.nih.gov/ij/ | ||
aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information. |