Introduction
Mange funktioner i hjernens funktion er i øjeblikket umuligt at kopiere i en kunstig system. Hjernens evne til hurtigt at behandle komplekse sensorisk information og skabe, som svar, præcise motoriske kommandoer er i sig selv allerede ud over den nuværende state-of-the-art. Men dens evne til at tilpasse sig forskellige betingelser ved at lære af tidligere erfaringer gør det så langt overlegen i forhold til human udviklede kontrolsystemer. Hidtil har forsøg på at replikere eller udnytte denne plasticitet har mødt ringe succes, og forståelsen af de indre funktioner i hjernen har unddraget den forståelse af forskere. Et af de vigtigste problemer, mens undersøgelsen af forholdet mellem hjerne og adfærd er den manglende evne til korrekt adgang til alle de variabler i systemet: ideelt set ville et optimalt forsøgsopstilling tillade samtidig optagelse og stimulering til et stort antal neuroner, langsigtet stabilitet , overvågning af synapser positioner og vægte og kontrollerbar bi-directional interaktion med omgivelserne. Vanskeligheden i at spore alle disse variabler samtidigt ført til undersøgelse af hjernen-adfærd forholdet på to forskellige skalaer: enten opfører dyr uden fin kontrol over eksperimentelle betingelser 1-7 eller med små, isolerede dele, såsom dele af neuronal væv, med ingen samlet overblik over systemets 8. I sidstnævnte tilfælde, mens der ikke udtænkt forsøgsopstilling giver fri kontrol med alle de involverede i arbejdet i selv en simpel neuralt netværk parametre, er en god studehandel fra dissocierede neuroner vokset Micro-elektrode Arrays (MEA) 9. Disse enheder, der er født i slutningen af 70'erne 10, har flere fordele frem for traditionelle elektrofysiologi teknikker: for det første muligheden for optagelse og stimulere et neuralt netværk i mange forskellige steder på én gang (normalt 60 elektroder). Desuden koblingen af multilaterale miljøaftaler med celler er næsten ikke-invasiv, Så observation af det samme netværk i længere tid, op til flere måneder 11. De fysiologiske virkninger af elektrisk stimulering på dissocierede kulturer er blevet grundigt undersøgt på grund af de anordninger, der afslører, at mange egenskaber observeret ved højere vægte (såsom for eksempel, plasticitet og simpelt memory processer 12-14) er konserveret på trods af tabet af arkitekturen. Under væksten kultur, disse net begynde at vise spontan aktivitet på ca. 7 dage in vitro (DIV) 15,16. Netværk aktivitet tendens til at ændre sig radikalt med yderligere vækst; først som enkelte spidser samles i bursts (slutningen af den anden uge) 17, senere som det skifter til et yderst komplekst mønster af synkroniseret, ikke-periodisk netværk bursts 18, som repræsenterer den modne tilstand af et netværk. Det er blevet foreslået 19, at denne synkrone adfærd, noget der ligner den, der observeres i in vivo rekordheder på sover dyr, skyldes manglen på sanseindtryk.
En anden tilgang forsøgt at få en bedre forståelse af information kodning er taget ved at udføre lukkede kredsløb eksperimenter, hvor forskellige typer signaler blev brugt til at styre stimulation af den neuronale netværk selve 11,20-23. I disse forsøg har en ydre middel er i stand til interaktion med miljøet er blevet anvendt til at generere sensorisk information tilføres til det neurale netværk, som til gengæld, produceret motordrevne kommandoer til en effektormekanisme. Dette gav observationer af, hvordan dynamiske og adaptive egenskaber neurale systemer udviklet som reaktion på inducerede ændringer i miljøet.
En opsætning til at udføre "legemliggjort neurofysiologi eksperimenter blev udviklet, hvor et hjul sensor platform (en fysisk robot eller dens virtuelle model) bevæger sig omkring i en arena og dens profiler hastighed bestemmes af aktiviteten af en neuronalsystemet (dvs. en befolkning på rotte neuroner dyrket over en MEA). Robotten er kendetegnet ved hastighedsprofiler sine to uafhængigt styrede hjul og af de nuværende aflæsninger af sensorerne distance. Den nøjagtige karakter af afstandssensorerne er ikke relevant; de kan være aktive eller passive optiske sensorer eller ultralydssensorer. Det er klart, er dette spørgsmål ikke anvendelse i tilfælde af virtuelle robotter, hvor sensorer kan udformes med enhver ønsket funktion.
I de heri beskrevne forsøg, robotten anvendes altid den virtuelle gennemførelse med 6 afstandssensorer peger på 30 °, 60 ° og 90 ° fra robotten position i begge retninger. Aktiviteten af de tre venstre og højre sensorer gennemsnit og aktiviteten af det biologiske kultur er drevet af oplysninger indsamlet af sådanne »super-sensorer" (som vil bare blive benævnt 'left' og 'rigtige' sensorer i resten af dette arbejde). Protocol beskrevet faktisk kan anvendes til den fysiske robot med forholdsvis mindre justeringer. Den information, der indsamles af robotten (enten fysisk eller virtuel) kodes i en række stimuli, der anvendes til at manipulere aktiviteten af biologiske neurale netværk, der er fysisk adskilt af robotten. De stimuli selv er alle identiske og dermed ikke kode nogen oplysninger. Det afgørende er deres hyppighed: stimulation stiger, når robotten nærmer sig en forhindring, med forskellige leveringstider sites kodning sensorisk information fra venstre og højre øjne "af robotten. Det neurale netværk vil præsentere forskellige svar på indkommende tog af stimulationer: opgave dekodningsalgoritmen er at omsætte den resulterende netværksaktivitet i kommandoer anvendes til at styre hjulene på robotten. Givet en 'perfekt' netværk adfærd (dvs. med pålidelig og helt adskilt reaktioner på stimuli fra forskellige elektroder), ville dette Result i robotten køre i sin arena uden at ramme nogen forhindringer. De fleste netværk til stede en adfærd er meget forskellige fra idealitet, derfor en simpel læring protokol indført: når den aktiveres, tetanisk stimulation (korte perioder med højfrekvente stimulation, 20 Hz stimulation i 2 sekunder, inspireret af protokoller, der er beskrevet i 24,25) efter en kollision med en forhindring er leveret. Hvis tetaniske stimulering resulterer i en lokal styrkelse af netværksforbindelse, vil dette resultere i en gradvis stigning i de navigationsmæssige kapaciteter af robotten.
HyBrainWare2, en forbedret version af den brugerdefinerede software udgives i 26 er kernen arkitektur udviklet til at håndtere kontrollen af de forskellige enheder i systemet (stimulator, dataopsamling, bearbejdning og visualisering, robot kommunikation eller simulering). Denne software er udviklet på vores laboratorium og er frit tilgængelig på anmodning. Denne software giver grænsefladen meddatafangstsystemet bord: Når brugeren starter dataopsamling fra GUI, styrer softwaren købet bord for at starte prøveudtagning og A / D-konvertering af data fra optagelsen elektroder. Disse data kan derefter optages, vises for at screene eller analyseres i realtid til påvisning af pigge, i henhold til de muligheder, der er fastsat af brugeren (se afsnittet Procedure for detaljer). Endvidere i softwaren, definitionen af kodning (oversættelse af sensorisk information til et elektrisk stimulation) og afkodning (oversættelse af registreret aktivitet i motoriske kommandoer til robotten) algoritmer skal angives. Især vores setup er forholdsvis brugervenlig sammenlignet med lignende systemer beregnet i fortiden 27, da næsten alle variabler kan tilgås af brugeren lige før du starter den egentlige eksperiment, mens alle de registrerede oplysninger automatisk gemmes i et format kompatibelt med et neuralt dataanalyse værktøjskasse 28.
Følgende procedure afsnit beskriver en lærerig eksperiment på dissocieret rotte hippocampus kulturer: alle dyrkningen og eksperimentelle parametre til dette særlige forberedelse og skal måske ændres, hvis en anden biologisk substrat skal bruges. Tilsvarende beskrevne eksperiment drager fordel af lukket sløjfe arkitektur at undersøge læring virkning tetanisk stimulation, men arkitekturen er fleksibel nok til at blive anvendt i studiet af forskellige funktioner på dissocierede neurale netværk. Større varianter af den foreslåede forsøg forklares yderligere i Discussion afsnit.
Protocol
1. Fremstilling af Neuronal Kultur over en MEA
- Plate neuronale kulturer på MEA chips, som beskrevet 29. Beskrivelsen af en lignende procedure er også 9 og i Discussion afsnit.
- Drej MEA varmesystem på 5-10 min, før du starter optagelsen for at minimere den termiske belastning opleves af cellerne: sæt temperatur mål for temperaturregulator til 37 ° C og tænde varmepladen under MEA selv (forudsat i de fleste kommercielle MEA systemer) og, hvis kendt, en opvarmet dæksel for at reducere fordampning.
- Steriliser gaspermeable hætter før hver brug i en autoklav med fugtig-varme (30 min, 130 ° C). For at undgå fordampning og forhindre ændringer i osmolaritet, holde kulturerne dækket med hætter under optagelsen.
- Placer neuronal kultur i forstærkeren 30 minutter før faktisk begynder optagelsen.
BEMÆRK: Du skal blot flytte kulturerne fra incubator til forstærkeren i væsentlig grad vil forstyrre spontan aktivitet for omkring en halv time. I løbet af denne tid, vil dyrkningsmediet temperatur stabiliseres. - Hvis en carbair kredsløb er tilgængelig, skal du starte cirkulation af carbair (en blanding af 5% CO2 og 95% O 2 + N2) til forsøg længere end et par timer: kulturer kræver det for at bevare både ilt og pH-niveauer stabil.
2. Udvælgelse af Recording Parametre for MEA Acquisition
- Vælg software filter båndbredde til at opdage pigge (dvs. Multi-Unit Activity - MUA) 30: i RawDataDisplay formular markere afkrydsningsfeltet '300 Hz-3 kHz.
- Start erhvervelse af data: Tryk på 'Start' knappen i RawDataDisplay form.
- Indstil Threshold Gain til spike detektion i RawDataDisplay til 7.
BEMÆRK: Afhængigt af den ønskede specificitet / selektivitet tradeoff og på den vedtagne opdageion algoritme, kan denne tærskel sættes mellem 6 og 10 gange den beregnede standardafvigelse. - Indstil Threshold Hukommelse til 2 sek, og tryk på knappen "Lås", når der ikke tilsatte aktivitet er synlig på displayet (begge kommandoer er i RawDataDisplay form). Markér skøn SD fra median "at beregne støj standardafvigelse fra medianen af den absolutte værdi af den observerede signal 31,32, hvis det er vanskeligt at give endnu korte tidsvinduer uden spiking aktivitet. Fjern fluebenet fra denne mulighed efter tryk på "Lock" knap, som den underliggende algoritme er regnekraft og kan forårsage pc'en til at halte.
- Tænd spike afsløring rutine ('Spike Detection' afkrydsningsfeltet i RawDataDisplay form). Hvis spike afsløring allerede kører (dvs. er afkrydsningsfeltet allerede markeret), kassere pigge detekteret op til dette øjeblik ved at klikke på knappen 'Nulstil' i Data Recording formular.
3. Udvælgelse af MEA elektroder til at stimulere Neuronal Kultur og reaktion Kort Computation
- Optag spontane aktivitet af de neuronale celler dyrket over MEA i 30 min: gemme data til fil ved at klikke på 'Record' knappen, i den "Spikes" kasse af DataRecording form efter den ønskede mængde tid er gået (30 min, i dette tilfælde).
- Identificer de 10 mest aktive kanaler (dvs. 10 kanaler med højeste spike gælder), og vælg derefter de kanaler i nogen af MEA layouts (enten i kodningen, Afkodning eller Connection Kort formularer) ved at trække musemarkøren hen over de ønskede områder. Når der er valgt kanalerne, skal du højreklikke et vilkårligt sted på MEA layout og vælge 'Føj til venstre sensorisk område "i genvejsmenuen: disse elektroder vil blive brugt til at levere elektrisk stimulation i trin 3.5.
- Kontroller, at stimulator og MEA forstærker er tilsluttet korrekt: alle konfigurationer require to ledninger pr ønskede stimulation kanal, mens en ekstra koaksialkabel vil være forpligtet til at bære synkroni signal (se manualerne til de særlige instrumenter til tilslutningsdiagrammer). Fortsæt derefter at slå stimulatoren på.
- Definer stimulus parametre i forbindelse Map form. Alle stimulationer leveret til kulturen er bifasiske square spænding bølger. Indstil halv varighed til 300 mikrosekunder og amplitude til 1,5 V pp 33.
BEMÆRK: Stimuli stor nok til at pålideligt fremkalde neurale svar vil meget sandsynligt kompromis registrering af aktivitet fra de samme steder. I resten af papiret, ikke bør vælges elektroder anvendes til stimulation levering til optagelse alle relevante oplysninger. - Optag respons på stimulation: Tryk på knappen Start i ConnectionMap form. En serie af 30 stimuli, med et interval på 5 sek igen automatisk leveres fra hver af de udvalgte elektroder, mens responser recorded fra de resterende 59 elektroder.
- Beregne en forbindelse kort (dvs. sandsynligheden for at observere et svar fra en elektrode inden for et tidsvindue efter levering af stimulus fra en anden elektrode) for hver stimulerende kanal gennem nogen matematik software eller SpyCode, en applikation udviklet i fortiden (og frit tilgængelige efter anmodning) for at udføre beregninger på neurale data 28.
- Fra tilslutning kortene, skal du vælge bedste elektroder: kasseres alle stimulerende elektroder, der ikke fremkalder reaktioner (dvs. i tidsvindue efter stimulering med et skud satser ikke væsentligt højere end under spontan fyring).
- Vælg blandt de resterende elektroder, parret med den mindste overleap i svarene. Specifikt for hver stimulerende elektrode, beregner gennemsnittet spike tæller i hver optagelse elektrode, derefter beregne forskellen mellem tilsvarende elektroder til alle stimulerende elektroder par. Vælg parret for which summen af absolutte værdier af respons forskelle for alle optagelse kanaler er størst.
- Vælg en af disse elektroder til at kode sensorisk information fra venstre side af robotten, og den anden til at kode aflæsninger fra højre side: For at gøre dette, skal du trække musemarkøren over en elektrode, skal du højreklikke på MEA layout vælg »Føj til venstre sensorisk område« (eller »Tilføj til højre sensoriske område«).
4. grænseflade Neuronal Kultur med robotten: Valg af Kodning og afkodning Ordninger
- Set 'Kodning Type' i Coding formular til Linear.
- Definer mindste og største stimulering satser i Coding form. Brug standard området 0,5-2 Hz.
- Indstil "Jitter" parameter i Coding formularen til 0.
- Sæt dekodningsalgoritmen parametre i Afkodning Form (vægt og ekstinktionskoefficient) til 1, for en moderat aktiv kultur (~ 1 spike / sek pr kanaliel). Definer en ny parameter par hvis fyring satser kraftigt og konstant afviger fra denne værdi. Se diskussionen for den nøjagtige funktion af dekodning parametre.
- Indstil dekodningsalgoritmen burst parametre i dekodningen Form. Indstil vægt til 0 (henfaldstid derefter irrelevant), medmindre sondring mellem pigge og bursts er genstand for undersøgelsen.
BEMÆRK: De foreslåede i trin 4.4 værdier giver glatte robot bevægelser og hastigheder er kompatible med robot reaktionstider for moderat aktive rotte primære kulturer. Burst parametre har præcis samme funktion som beskrevet i trin 4.4, men den udløsende begivenhed er påvisning af en byge i stedet for en spike: den faktiske hastighed af hvert hjul er simpelthen summen af bidragene fra fundne pigge og brister.
5. Design af Navigation Arena til Robot
- I den virtuelle Arena Designer formular, vælge mellem afgrænses (grænserne for arenaen er synlige for robotten og jegmpassable) eller uendelig (Hvis robotten udgange fra den ene side af arenaen, det vil øjeblikkeligt genindtræde fra den modsatte én) arena og arena størrelse i pixels.
- Brug ikke bundne arenas mindre end 100 x 100 pixel, for at tillade en betydelig bevægelse. Brug ikke forhindringer med en radius mindre end 5 pixels, da de bare kan falde mellem linjerne i synet af robotten.
- Husk, at meget store arena størrelser kan forårsage computerens ydeevne til at nedbryde: hvis en stor arena er påkrævet, test software ydeevne med den ønskede arena, før du starter svære at gentagne forsøg.
- Indstil robot startposition enten manuelt (klik på 'Manual Selection' knappen i Virtual Arena Designer formular, så den ønskede placering) eller ved at angive koordinaterne for robotten ved eksperimentet starter i 'Robot startposition marker.
- Tilføj et vilkårligt antal ufremkommelige forhindringer inden for arenaen. Enten placere dem mandelt i arenaen efter klik på knappen "Tilføj Hindring manuelt" eller sæt antal og størrelse.
- Klik på "Generer Arena 'knappen for at generere arenaen med de valgte funktioner. Vil ske nogen ændringer, indtil der trykkes på denne knap.
- Gem designet arena og indlæse den relative fil, før anvendelse i et eksperiment, med kommandoen knapper i den nederste del af den virtuelle arena Designer form.
6. Valg af MEA elektroder til Record neuronaktivitet fra Kultur
- Vælg som midlertidige registreringselektroder dem, som forskellige svar, i trin 3.8, er iagttaget: elektroder, der viste større respons efter stimulering fra "venstre" (eller "højre") elektrode vil udgøre 'left' (eller "rigtige") optagelse elektroder. Brug ikke elektroder, der ikke udviste signifikante reaktioner på enten stimulerende elektrode til at styre robotten. From MEA layout i genvejsmenuen, vælg 'Føj til venstre motor område «(eller» Tilføj til højre motor område «) til at definere registreringselektroder.
- Vælg funktioner til at optage i eksperimentet manager form. På dette stadium, pigge og stimulering tidsstempler er de eneste relevante oplysninger.
- Udfør en 10 min prøvetur: starte robotten køre ved at klikke på Start Experiment knappen i Experiment manager formularen, skal du klikke på det igen efter der er gået 10 min.
BEMÆRK: Når alle parametre er indstillet (kodning og afkodning, robot arena, stimulerende og registrering elektroder, funktioner til record), vil et filnavn udvalg bede om indspillede filer navn og destination, så robotten vil begynde at bevæge sig i sin arena, efter de definerede regler. Alle de udvalgte funktioner gemmes automatisk i realtid. - Gentag trin 3.6 og 6.1 på data indhentet i trin 6.3, med henblik på at vælge registreringselektroder fra data indsamlet under en faktisk robot køre (se Discussion for begrundelsen for denne to-trins tilgang).
7. Udførelse af en Neuro-robot Experiment
- Vælg I eksperimentet manager danne data, der skal registreres: markere Spike, Robot og Stimuli data afkrydsningsfelter.
- Start en pre-learning robot køre: Klik på knappen "Start eksperiment" i eksperimentet manager form. Vælg nye filnavne for datafiler, når du bliver bedt om. Når 30 minutter er gået, skal du klikke på knappen 'Start Experiment "igen for at stoppe robotten køre.
- Tænd for læring protokol (markere "Lever tetaniske Stimulation Efter Hit 'afkrydsningsfelt i Experiment manager form) og udfører uddannelse robot køre, af samme længde som den forberedende uddannelse fase (dvs. 30 min). Husk at indtaste forskellige filnavne, når du bliver bedt om at undgå at overskrive data fra trin 7.2.
- Sluk for læring protokollen igen (Fjern markeringen i "Lever tetaniske Stimulation Efter Hit 'afkrydsningsfelt) Og udfører post-learning robot køre. Endnu en gang huske at ændre filnavne for at forhindre overskrivning.
8. Anden Reaktion Kort Computation
- Gentag trin 3,1-3,6. Brug af data fra disse optagelser for at teste, om der er fremkaldt ændringer enten i de spontane eller fremkaldte aktivitetsmønstre ved læring protokollen.
Representative Results
Den udviklede eksperimentelle rammer tillod afprøvning af, om en udveksling af oplysninger mellem en kultur af neuroner og den virtuelle realisering af en fysisk robot er mulig 34. Figur 1 viser flere prøver af opnåede stier rejste med en virtuel robot i 20 min forsøg under forskellige forhold : fra venstre til højre et korrekt lukket sløjfe eksperiment, en "tom MEA 'robot forsøg (ingen celler udplades på MEA for denne kontrol eksperiment) og en åben sløjfe robot eksperiment (stimulation er konstant i stedet for kodning sensor information) er repræsenteret. De repræsentative spor bekræfter, at det er nødvendigt en tovejs samspil mellem neuronale og kunstige elementer for at opnå gode navigationsydelse af robotten. Alligevel robotten oplever flere træffere mod forhindringer.
I figur 2 navigation ydeevne af robotten, expressed pixels rejste mellem efterfølgende hits, er vist i forskellige forhold. De første to kolonner viser fordelingen af afstande i kontrolforsøg, der er nævnt ovenfor ('tomme MEA «og åben sløjfe konfigurationer), mens tredje og fjerde kolonne viser ydeevnen uden og med henholdsvis levering af tetanisk stimulation efter hver hit mod en forhindring. Indførelsen af tetanisk stimulation (Jf Procedure, punkt 7.2) forbedrer den afstand mellem to på hinanden følgende hits og dermed forbedre navigationsydelse robottens 35.
I figur 3 er navigation udførelsen af en robot med forskellige afkodning betingelser fremlagt. Til dette formål har en anden arena konfiguration er vedtaget. Dette bidrog til at kvantificere en vellykket sejlads af robotten i Arenaen 36: som beskrevet i trin 4.1 i proceduren, er robottenpræsenteret en række korte spor. Den succesrate er simpelthen forholdet mellem antallet af vellykkede krydsede spor over antallet af præsenterede spor. Navnlig i de eksperimenter en tidstro identifikation af burst og isoleret spikes blev udført. Afkodning paradigmer adskiller sig fra hinanden på grund af de relative vægte af byger og isolerede pigge (Jf Procedure, peger 3,5-3,6 og diskussion).
Figur 1: en neuronal netværk og en robot har en tovejs udveksling af information Denne figur viser tre repræsentative kurver rejste af robotten i løbet af 20 minutter af eksperimentet.. Især lysegrønne områder er gratis for robotten til at bevæge sig i, mens mørkegrønne pixels repræsenterer ufremkommelige forhindringer, som robotten kan opfatte gennem sine afstandssensorer. I hvert forsøg, robotten starter in øverste venstre del af arenaen og rejser til sin endelige holdning, afbildet som en stor lyserød prik. De mindre sorte prikker repræsenterer hits mod en forhindring, mens farvekodede sti giver en indikation af den tid udviklingen i robot bevægelse. Farven bar til højre udtrykker forløbne tid fra begyndelsen af forsøget på få minutter. (A) Sti fulgt i et lukket kredsløb eksperiment. (B) Sti fulgt i en »tom« MEA eksperiment (ingen celler dyrkes på MEA overflade). (C) Sti følges under en open-loop eksperiment (stimulation er konstant gennem hele eksperimentet). Klik her for at se en større udgave af figuren.
Figur 2: Resultaterne er påvirket af lukketløkke og tetanisk stimulation. Denne graf rapporterer fordelingerne af strækninger af robotten mellem efterfølgende hits i forskellige forhold. Især udgør de to første fordelinger kontrolforsøg (tomkørsel til optagelser uden neuroner belagt på MEA, "Åben sløjfe (OL) til forsøg med en blind 'robot). De sidste to kolonner repræsenterer "Lukket sløjfe" tilstand uden (CL) og med (CL + TS) læringen protokol gennemføres via tetaniske Stimulation (TS), bliver leveret til kulturen efter hits mod en forhindring. I hver kasse, den centrale horisontale segment repræsenterer medianen af fordelingen, den tomme firkant middelværdien, den centrale bar strækker sig til den første og tredje kvartil og knurhår udvide til 5. og 95 th percentiler. Outliers er repræsenteret som diamanter. Statistik er blevet udført under anvendelse af Kruskall-Wallis envejs variansanalysepå rækker: Student-Newman-Keuls parvise sammenligning afslører, at alle medianværdier er signifikant forskellige med p <0,05.
Figur 3: Afkodning påvirker robot ydeevne Grafen ovenfor repræsenterer sandsynligheden for en given dekodningsalgoritme af robotten til at navigere succes gennem en kort spor i et begrænset tidsrum.. Identifikation af byger og isolerede spidser udføres i realtid under selve forsøget. I det første tilfælde (»Spikes«) alle registrerede pigge præsentere samme relative vægt, for det andet og tredje distributioner en vægt på 0 blev fastsat for henholdsvis isolerede pigge og pigge, der tilhører en byge. De sidste to kolonner repræsenterer de opnåede resultater i det tilfælde, hvor alle spikes behandles regnskabsmæssigt, men med en anden relative vægt i forhold til deres position.Især i fjerde kolonne isoleret spikes fik højere relativ vægt end brast begivenheder, mens vægtningen vendes til dekodning i forhold til den femte kolonne data. I hver graf, den centrale linje repræsenterer medianen af fordelingen, den tomme firkant middelværdien, mens den centrale bar strækker sig til den første og tredje kvartil og knurhår udvide til 5. og 95 th percentiler. Statistik er blevet udført under anvendelse af Kruskall-Wallis envejs variansanalyse på rækker. Den parvise sammenligning (Student-Newman-Keuls metode) afslører der kan observeres signifikante forskelle (p <0,05) mellem søjle 1 og 4, 2 og 4, 2 og 5, 2 og 3.
Discussion
I dette papir en neuro-robotic arkitektur baseret på et neuralt controller (dvs. et netværk af neuroner fra cortex eller hippocampus af embryonale rotter), tovejs forbundet til en virtuel robot, er præsenteret. Robotten, der har sensorer og hjul, er tvunget til at bevæge sig i en statisk arena med forhindringer og dets opgave består i at undgå kollisioner.
Den første og måske mest kritiske aspekt af den beskrevne procedure er forberedelsen af kulturer selv, da den fejlrate vil have tendens til at være væsentlig, selv i de bedste af de tekniske forhold. En detaljeret beskrivelse af dyrkningsteknikker er imidlertid uden for omfanget af den foreliggende arbejde. Som en generel retningslinje bør optagelser forekomme når netværket skudhastighed når et stabilt niveau, normalt efter 3 uger in vitro. En grov indikation af sunde kulturer er tilstedeværelsen af spontan elektrofysiologisk aktivitet i flere optagelse kanaliEls (mindst 20 kanaler over 60 tilgængelig). Sådanne kulturer er kendetegnet ved en høj grad af neuronal sammenkobling. Under sådanne betingelser, som regel neurale aktivitet bliver stærkt synkroniseret og til tider, viser den epilepsilignende begivenheder, med intens spiking efterfulgt af minutter lange stille perioder 37. Begge disse funktioner udgør et problem: overdreven synkronisering vil gøre det umuligt at skelne reaktioner på stimuli fra forskellige elektroder, mens kulturer udviser epileptiforme aktivitet vil reagere på det første stimulus præsenteret for en lang udbrud af aktivitet, efterfulgt af en tavs periode, uanset enhver successive stimuli leveret. Begge disse spørgsmål kan kraftigt forbedres ved ansættelse af mønstrede kulturer 35, hvor det neurale befolkning er opdelt i to eller flere svagt forbundne undergrupper.
Et andet problem er, at neurale reaktioner stærkt afhænge af fordelingen af indgående stimuli 38,39. I en lukket sløjfe eksperiment leveret stimulation er en funktion af føleraflæsninger, hvilket igen er en konsekvens af robotten bevægelse og derfor af de neurale reaktioner selv. Dette indebærer, at der ikke er nogen nem måde at etablere forhånd, hvad svarene vil blive observeret under selve forsøget. Som følge heraf skal valget af input-output-elektroder stole på hinanden følgende tilnærmelser. I den beskrevne protokol, en to-trins proces (dvs. trin 5.5 og 6.4) er implementeret til at forsøge at bestemme en forbindelse kort. I det første trin, leveres en regelmæssig sekvens af stimulationer og reaktioner på sådanne stimuli anvendes til at udlede et første forbindelse kort og en midlertidig sæt optagelse kanaler. Denne konfiguration bruges derefter til at udføre testen drev beskrevet i trin 6.4, og vælg optagelsen kanaler, vil blive overvåget i løbet af selve eksperimentet.
I afsnittet Resultater, en repræsentativ navigation resULT og de umiddelbare forbedringer som følge af indførelsen af en lærende paradigme præsenteres. I hele protokollen beskrivelse er flere andre mulige eksperimentelle varianter nævnt. For eksempel at de to store kodning systemer implementeret i HyBrainWare2 (lineære og stokastiske), hvor der er udviklet undersøge den nøjagtige rolle af tidsmæssige variation indgang på neurale kode 38. I den lineære tilfælde, øjeblikkelige stimulation er en funktion af brugerdefinerede parametre og robot sensorer optagelser. I den stokastiske tilfælde, hver gang eksempel har en given sandsynlighed for at blive valgt til at levere en stimulus. En sådan sandsynlighed automatisk beregnet af HyBrainWare2 så de forventede stimulering satser matche den tidligere sag. Muligheden for at tilføje jitter til lineær kodning giver en jævn overgang mellem de to sager, der er beskrevet ovenfor. På samme måde kan udforske forskellige kombinationer af parametre i afkodning sektion hjælpe kaste lys over PreciSE rolle bursting in vitro neurale netværk. Hastigheden af hvert hjul af robotten stiger proportionalt med vægten parameter, hver gang en hændelse detekteres i tilsvarende output området, mens ekstinktionskoefficienten angiver, hvor meget tid, i sekunder, et af bidragene tager at tabe 50% af sin værdi . Den henfald er en simpel eksponentiel. Der er allerede taget de varianter i betragtning i den nuværende udformning af HyBrainWare2, men mange flere forsknings muligheder åbne, hvis der kan indføres yderligere ændringer i softwaren eller forsøgsopstillingen.
En temmelig betydelig begrænsning af protokollen beskrevet her er kravet af den udviklede tilpassede software, HyBrainWare2 (frit tilgængelig på anmodning til alle interesserede brugere). Denne software er designet til en række komponenter (stimulator, erhvervelse bord, MEA forstærker) af en bestemt model og producent. Selv om det faktisk er muligt at tilpasse det til at virke på different opsætninger, vil konverteringen tage nogen programmering færdigheder. Tilsvarende de inkluderede muligheder dækker kun et begrænset sæt af alle de eksperimentelle spørgsmål, kunne undersøges gennem en sådan opsætning. For eksempel er spike detektionsalgoritmen implementeret i præsenteret arkitektur (præcise tidspunkt spike detektion 40) helt defineret af flere fastkodede parametre, som skal ændres, hvis genstand for registrering er meget forskellig fra dissocierede neurale netværk (f.eks hjerteceller eller skiver). Endelig indlæring protokol består af levering af en kort, høj frekvens (2 sek 20 Hz stimulering, hver stimulus impuls er den samme som dem, der anvendes til at kode sensorisk information) stimulation efter hver hindring hit. Hvis robotten rammer en forhindring med sin højre side, er det tetanisk stimulation leveret til elektroden, der normalt koder for højre side information og det samme gælder for venstre side hits. Denne protokol er hard-kodet og kan ikke be ændres af brugeren uden at ændre spændende software.
Mens opsætningen præsenteres her er ikke den første kropslige system til hybrid, lukkede kredsløb eksperimenter 20,23,27,41,42, var dem designet i fortiden fokuseret på en enkelt afhandling understøttes af data fra et begrænset antal analoge præparater . På den anden side har den beskrevne opsætning blevet anvendt til et stort antal forsøg (mere end 100 kulturer er blevet registreret siden 2012) med præparater afviger for modulopbygning og oprindelse, mens selve forsøgene forskellige spørgsmål (f.eks virkningen af tetanisk stimulation og relevans for sprængning, som præsenteres i resultaterne). I den nærmeste fremtid, er nye eksperimentelle sessioner planlagt til at kontrollere de varige virkninger af både tetanisk og lukkede kredsløb stimulation og forholdet mellem stimulation regelmæssighed og observerede reaktioner. Et andet spørgsmål, der skal behandles, er forbindelsen mellem spontan og observerede aktivitet, medtanken om at tilføje en ny dekodning algoritme, der tager hensyn til historien om tidligere aktiviteter og stimulering 43.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Ph.D. studerende Marta Bisio til dyrkning og vedligeholdelse af neuronale netværk end Micro-elektrode arrays og Dr. Marina Nanni og Dr. Claudia Chiabrera fra NBT-IIT for teknisk bistand til dissektion og dissociation procedurer. Den forskning, der fører til disse resultater, er udført med støtte fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (ICT-FET FP7 / 2007-2013 FET Young Explorers ordning) under tilskudsaftale n ° 284772 BRAIN BOW ( www.brainbowproject.eu ). Forfatterne vil også gerne takke Silvia Chiappalone for hendes hjælp i produktion af grafik, der anvendes i indledningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulus Generator 4002 | Multi Channel Systems | ||
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| NI 6255 Acquisition Card | National Instruments | ||
| Microsoft Visual Studio 2008 | Microsoft | ||
| 2078P Multichannel System-National Instruments adapter board | Developed at University of Genova (Italy) | ||
| Matlab 2010 | Mathworks | ||
| HyBrainWare2 | HyBrainWare2: Contact Information |
References
- Fetz, E. E. Volitional control of neural activity: implications for brain–computer interfaces. The Journal of Physiology. 579 (3), 571-579 (2007).
- Carmena, J. M., et al. Learning to control a brain–machine interface for reaching and grasping by primates. PLoS Biology. 1 (2), e42 (2003).
- Azin, M., Guggenmos, D. J., Barbay, S., Nudo, R. J., Mohseni, P. A miniaturized system for spike-triggered intracortical microstimulation in an ambulatory rat. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 58 (9), 2589-2597 (2011).
- Angotzi, G. N., Boi, F., Zordan, S., Bonfanti, A., Vato, A. A programmable closed-loop recording and stimulating wireless system for behaving small laboratory animals. Scientific Reports. 4, (2014).
- Maher, M., Pine, J., Wright, J., Tai, Y. -C. The neurochip: a new multielectrode device for stimulating and recording from cultured neurons. Journal of Neuroscience. 87 (1), 45-56 (1999).
- Olsson, R. H., Buhl, D. L., Sirota, A. M., Buzsaki, G., Wise, K. D. Band-tunable and multiplexed integrated circuits for simultaneous recording and stimulation with microelectrode arrays. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 52 (7), 1303-1311 (2005).
- Zanos, S., Richardson, A. G., Shupe, L., Miles, F. P., Fetz, E. E. The Neurochip-2: an autonomous head-fixed computer for recording and stimulating in freely behaving monkeys. Neural Systems and Rehabilitation Engineering. IEEE Transactions on. 19 (4), 427-435 (2011).
- Reger, B. D., Fleming, K. M., Sanguineti, V., Alford, S., Mussa-Ivaldi, F. A. Connecting brains to robots: an artificial body for studying the computational properties of neural tissues. Artificial Life. 6 (4), 307-324 (2000).
- Hales, C. M., Roston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 2056 (2010).
- Gross, G., Rieske, E., Kreutzberg, G., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2), 101-105 (1977).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1), 17-24 (2001).
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PLoS One. 5 (1), e8871 (2010).
- Marom, S., Shahaf, G. Development learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Quarterly reviews of biophysics. 35 (1), 63-87 (2002).
- Shahaf, G., Marom, S.
- Pelt, J., Vajda, I., Wolters, P. S., Corner, M. A., Ramakers, G. J. Dynamics and plasticity in developing neuronal networks in vitro. Progress in Brain Research. 147, 171-188 (2005).
- Chiappalone, M., Bove, M., Vato, A., Tedesco, M., Martinoia, S. Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development. Brain Research. 1093 (1), 41-53 (2006).
- Tateno, T., Jimbo, Y., Robinson, H. Spatio-temporal cholinergic modulation in cultured networks of rat cortical neurons: spontaneous activity. Neuroscience. 134 (2), 425-437 (2005).
- Masquelier, T., Deco, G. Network bursting dynamics in excitatory cortical neuron cultures results from the combination of different adaptive mechanism. PLoS One. 8 (10), e75824 (2013).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. The Journal of Neuroscience. 25 (3), 680-688 (2005).
- Martinoia, S., et al. Towards an embodied in vitro electrophysiology: the NeuroBIT project. Neurocomputing. 58-60, 1065-1072 (2004).
- Mussa-Ivaldi, F. A., et al. New perspectives on the dialogue between brains and machines. Frontiers in Neuroscience. 4 (1), 44 (2010).
- Warwick, K., et al. Controlling a Mobile Robot with a Biological Brain. Defence Science Journal. 60 (1), (2010).
- Kudoh, S. N., et al. Vitroid–the robot system with an interface between a living neuronal network and outer world. International Journal of Mechatronics and Manufacturing Systems. 4 (2), 135-149 (2011).
- Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons. Biophysical Journal. 76 (2), 670-678 (1999).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S.
- Mulas, M., Massobrio, P., Martinoia, S., Chiappalone, M. A simulated neuro-robotic environment for bi-directional closed-loop experiments. Paladyn. 1 (3), 179-186 (2010).
- Novellino, A., et al. Connecting neurons to a mobile robot: an in vitro bidirectional neural interface. Computational Intelligence and Neuroscience. 2007 (12725), 1-13 (2007).
- Bologna, L. L., et al. Investigating neuronal activity by SPYCODE multichannel data analyzer. Neural Networks. 23 (6), 685-697 (2010).
- Frega, M., et al. Cortical cultures coupled to micro-electrode arrays: a novel approach to perform in vitro excitotoxicity testing. Neurotoxicology and Teratology. 34 (1), 116-127 (2012).
- Quian Quiroga, R., Panzeri, S. Extracting information from neuronal populations: information theory and decoding approaches. Nature Reviews Neuroscience. 10 (3), 173-185 (2009).
- Donoho, D. L., Johnstone, J. M. Ideal spatial adaptation by wavelet shrinkage. Biometrika. 81 (3), 425-455 (1994).
- Martinez, J., Pedreira, C., Ison, M. J., Quian Quiroga, R.
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. Effective parameters for stimulation of dissociated cultures using multi-electrode arrays. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 27-37 (2004).
- Tessadori, J., Mulas, M., Martinoia, S., Chiappalone, M. Biomedical Robotics and Biomechatronics (BioRob), 2012 4th IEEE RAS & EMBS International Conference on. , 332-337 (2012).
- Tessadori, J., Bisio, M., Martinoia, S., Chiappalone, M. Modular neuronal assemblies embodied in a closed-loop environment: toward future integration of brains and machines. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
- Neural Engineering (NER). Tessadori, J., et al. 2013 6th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 899-902 (2013).
- Colombi, I., Mahajani, S., Frega, M., Gasparini, L., Chiappalone, M. Effects of antiepileptic drugs on hippocampal neurons coupled to micro-electrode arrays. Frontiers in Neuroengineering. 6, 10 (2013).
- Gal, A., Marom, S. Entrainment of the intrinsic dynamics of single isolated neurons by natural-like input. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7912-7918 (2013).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of neuroscience methods. 177 (1), 241-249 (2009).
- DeMarse, T. B., Wagenaar, D. A., Blau, A. W., Potter, S. M. The neurally controlled animat: biological brains acting with simulated bodies. Autonomous Robots. 11 (3), 305-310 (1023).
- Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task. Journal of Neural Engineering. 5 (3), 310-323 (2008).
- Truccolo, W., Hochberg, L. R., Donoghue, J. P. Collective dynamics in huma and monkey sensorimotor cortex: predicting single neuron spikes. Nature Neuroscience. 13 (1), 105-111 (2010).
