Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة بإذن من الدولة من ولاية سكسونيا وسكسونيا-أنهالت، Regierungspraesidium درسدن / هال، وفقا للمادة 8 من القانون الألماني لحماية الحيوان (24D-9168،11-1 / 2008-24).
عزل خلية 1
1.1 إعداد عظم الفخذ والساق
- تخدير الماوس باستخدام تركيز الأيزوفلورين 5٪ بواسطة تبخير الأيزوفلورين في صندوق مغلق. بعد الماوس قد توقفت عن الحركة لمدة 3 ثانية، تنفيذ خلع عنق الرحم.
- تطهير أطرافه الخلفية مع الإيثانول (96٪). إزالة الجلد والعضلات والعظام فصل مع مشرط معقم.
- تبدأ مع شق الجلد الإربي، وتوسيع شق نحو الكعب الإنسي وإجراء تشريح دائرية من الجلد حول انخفاض في ربلة الساق. إزالة الجلد في الساقين بالكامل من قبل تقشير أنه قريب.
- فصل عضلة الفخذ من عظم الفخذ مع مشرط حاد، وإزالة كل من الشظوي الأماميوالجماعات عضلة الساق وdisarticulate الساق في مفصل الورك من خلال تحديد موقع وتشريح الأربطة.
- بدء الأمامية والمضي قدما حول المفصل عن طريق تناوب بعناية ساقه وtransecting الأربطة، وبالتالي disarticulating المفصل.
- غسل عظم الفخذ والساق مع 96٪ من الإيثانول لمدة لا تقل عن 90 ثانية لضمان إعداد خلية العقيم. تستمر عملية الغسيل مع برنامج تلفزيوني العقيمة لشطف الإيثانول المتبقية.
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الخطوات اللاحقة معقمة لتجنب التلوث.
1.2 حصاد نخاع العظام
- قطع نهاية القريبة والبعيدة كل العظم مع زوج من مقص غرامة للوصول إلى مهاوي الفخذ وعظام الساق. كن حذرا مع هذه الخطوة، لأن هذه العظام كسر بسهولة جدا.
- مسح العظام مع المتوسط الدافئة (M199 + 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، + 1٪ البنسلين / الستربتوميسين). استخدام معقم 28-G إبرة، حقنة 1 مل، وبين 10-15 مل لكل متوسطةالعظام لالشطف.
- عقد العظام مع ملقط غرامة وشطف واحدا تلو الآخر حتى يتحول شبه شفافة. تطبيق بعناية لضغوط لنهاية المكبس حقنة من أجل تقليل الإجهاد الخلية.
- تصفية نخاع العظام من خلال 70 ميكرومتر شبكة النايلون وجمع الراشح. لاستخراج الكمية القصوى من نخاع العظام، وشطف مرارا وتكرارا من نهايات القاصي والداني.
- شطف غربال مع برنامج تلفزيوني وجمع الراشح. طرد بعناية الحطام والتكتلات الخلوية بواسطة التحريك لطيف وpipetting ل.
1.3 زراعة
- الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل وطاف resuspend الخلايا مع ما يقرب من 25 مل من المتوسط. أكرر مرة واحدة.
- resuspend الخلايا في 6 مل من المتوسط بعد خطوة الغسيل الثانية. مزيج 50 ميكرولتر من الحل زنزانة مع 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق. عدد الخلايا في غرفة الفرز تحت المجهر الضوئي. احسب عدد جells في الحل باستخدام هذه الصيغة:
- البذور الخلايا على 6 جيدا لوحات سطح مرفق منخفضة للغاية لمنع التصاق دائم في الجزء السفلي من لوحة. استخدام تركيز 10 6 خلايا لكل مل مع ما يصل الى 6 مل لكل بئر.
- تكملة تعليق مع 20 نانوغرام / مل M-CSF لتعزيز تمايز الخلايا.
- ثقافة الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ومراقبة يوميا.
1.4 حصاد الخلايا
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوات على الجليد. المضي قدما إما 1.4.1 أو 1.4.2 وفقا لذلك.
- عند هذه النقطة، حصاد ثقافة بأكملها، بما في ذلك الضامة المتباينة التي ستلتزم الثقافة لوحات، حتى لو كانت لوحات سطح فائقة منخفضة المرفق.
- حصاد ثقافة كاملة من قبل pipetting لطيف وفصل بمحلول مكون من 4 ° C PBS، 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA. كرر حتى لوحات واضحة ما تبقى من الخلايا الملتصقة - تأكيد تحت المجهر إذا لم تكن متأكدا.
- بدلا من ذلك، تجاهل الضامة ملتصقة عن طريق حصاد طاف مع الخلايا في تعليق، والتي تحتوي في الغالب حيدات.
- حصاد الخلايا غير ملتصقة مع حل PBS خالية من EDTA و 0.5٪ BSA. لا تنطبق الكثير من القوة من أجل تجنب طرد الضامة ملتصقة أقل ما يقال.
1.5 FACS-تحليل (اختياري)
ملاحظة: من الممكن أن تستنفد تعليق خلية من خلايا CD117 + stem- والسلف عن طريق استخدام MACS. استخدام بروتوكولات الشركة المصنعة لهذا الإجراء.
- حصاد الخلايا وفقا لخطوات إما 1.4.1 أو 1.4.2.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتكرار هذه الخطوة مرة أخرى.
- في resuspend 250،000 على الأقل الخلايا في 300 ميكرولتر من FACS بuffer في التحقيق.
- نقل الحل خلية على 96-جيدا لوحة (30 ميكرولتر لكل بئر).
- الطرد المركزي تعليق خلية في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إزالة طاف وإضافة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة إلى كل بئر (استخدام مصنع تمييع).
- وصمة عار على الخلايا مع الأجسام المضادة (بعد بروتوكولات المصنعة للحصول على phenotyping الخلية بعد خطوات 1.5.1-1.5.6. وتشمل علامات يشيع استخدامها لتحديد الوحيدات / بلعم CD11b، F4 / 80 (الشكل 3)، CD115 (الشكل 2)، وGr- 1.
ملاحظة: للحصول على وصف مزيد من الحلول المحمولة، ويوصى باستخدام علامات مثل CD4، CD8a، CD11c و، CD25، CD45، CD45R، CD62L، CD80، CD86، CD145، CD117، MHCⅡ، Ly6C، Ly6G، وCD192. تم الخصائص الخلوية ووصف سابقا 12. - احتضان تحقيقات لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- الطرد المركزي تحقيقات في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية و resuspend مع 200 ميكرولتر من العازلة FACS. تكرار عشرهو خطوة مرتين.
- نقل تحقيقات في أنابيب FACS وإجراء تحليل FACS 12.
- لتحليل FACS 12 يوم 0 و 3 و 5 لتحليل تمايز الخلايا.
2. الذيل الوريد حقن
2.1 إعداد
- تدفئة الحيوانات على لوحة التدفئة على 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. مراقبة الحيوانات في حين أن ارتفاع درجات الحرارة إلى التعرف على علامات الانهاك.
- Resuspend وحيدات، معزولة في الخطوات 1.1- 1.4، في 150 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم، وتحميل الخلايا في حقنة 1 مل الأنسولين بإبرة 30G. دوامة بخفة الحل قبل تحميل حقنة لضمان يتم حقن كل حيدات. التعامل دائما الخلايا على الجليد لتجنب التعلق بوساطة الحرارة وتفعيل حيدات.
2.2 الزجرية
- تجنب إزعاج الفئران الأخرى في القفص عند اختيار الماوس للحقن في الوريد.
- ضع الماوس في رادع. تجنب الكثير من العلاقات العامةessure ويكون حذرا مع الأطراف الخلفية. (الشكل 4)
ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدم التخدير العام لضمان معالجة الإجهاد خالية من الحيوانات. - تأكد من أن الفأر لديه مساحة للتنفس قبل أن يغلق رادع.
2.3 حقن
- تطهير مكان الحقن مع وكيل التطهير. رش على ذيل الماوس واسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة على الأقل.
- وقف تدفق الدم الوريدي من الذيل من خلال تطبيق ضغط لطيف على الجانب الذيل الأفقي فوق موقع الحقن، لتحسين الرؤية من الأوردة.
- تحويل الذيل 90 درجة، قبل الحقن. (الشكل 5)
- حقن في زاوية 45 درجة. حقن ببطء وليس أكثر من 5 غ لكل ميكرولتر لتجنب إيذاء الحيوانات.
- إذا كان هناك نفطة، وهو علامة على وجود حقن فشلت، والتوقف فورا عن تكرار الحقن أكثر قريب.
- وقف النزيف في الجانب حقن عن طريق تطبيق ع لطيفressure لمدة 1 دقيقة.
- في نهاية هذا الإجراء، فتح ضام ووضع الماوس في قفصه.
- مراقبة الماوس لمدة 20 دقيقة لضمان أن الحيوان لم تتضرر من الحقن ويتم الحفاظ الاستلقاء القصية. تمديد وقت الرصد حتى يستعيد وعيه الماوس كافية. العودة الماوس للشركة من الحيوانات الأخرى إلا بعد أن تعافى تماما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حل الخلية المستخرجة من نخاع عظام الفئران يتكون من أنواع الخلايا المختلفة. أنواع الخلايا الرئيسية هي اللمفاويات، وحيدات والمحببة. ويمكن تقدير أنواع الخلايا حسب الحجم وتحبب، والذي يظهر في الشكل رقم 1 لكلا تعليق الأم والخلايا تحصد بعد 5 أيام من التمايز. ملاحظة تكوين الخلايا المتغيرة خلال زراعة. ومع ذلك، تصنيف دقيق للسكان يجب أن تعتمد على التعبير مميزة من علامات الخلوية.
علامة أهم تستخدم لتحديد الخلايا للنظام MPS هي CD115، التي تعمل باسم مستقبلات M-CSF وأعرب تحديدا على الأسلاف الوحيدات، وحيدات والضامة. لذلك، قد لا يمكن استخدامها لتحديد المميزة MPS-مجموعات فرعية، ولكن يمكن تقدير موثوق المبلغ المطلق للخلايا يساقون إلى التمايز الوحيدات / البلاعم. انظر الشكل 2 لوضع جدول زمني لCD115 التعبير خلال تختلفentiation.
نضج علامة F4 / 80 مفيد للتمييز حيدات الأحداث، وحيدات ناضجة، والضامة. تظهر الضامة تعبير قوي عن F4 / 80 بالمقارنة مع الأحداث، الأسلاف الوحيدات، والتي هي سلبية للعلامة. تظهر حيدات ناضجة التعبير وسيطة من F4 / 80. لذا مزيج من CD115 وF4 / 80 علامات يمثل وسيلة عملية لقياس ومراقبة تمايز الخلايا (انظر الشكل 3).
مزيج من CD115 وF4 / 80 كافية لمراقبة الثقافة الروتينية ومراقبة الجودة قبل تطبيق الخلايا. فحص أكثر تفصيلا للحيدات المستمدة من النخاع العظمي، في يوم 5 من زراعة يؤكد الخصائص التركيبية والوظيفية في التوافق لتلك التي حيدات الدموية المحيطية 12.
من المهم لإصلاح الماوس بعناية في رادع، وتجنب التوتر على الذيل. تقييد freedoم الحركة قدر الإمكان دون تثبيط التنفس لتسهيل الحقن.
وتشمل تكوين أنواع الخلايا في يوم 1 في الثقافة أنواع الخلايا الليمفاوية، وحيدات والمحببة: الشكل 1. اللوحة اليسرى. اللوحة اليمنى: ملاحظة تكوين الخلايا المتغيرة خلال زراعة. ويشمل سكان الخلية حيدات والضامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الجدول الزمني للCD115 التعبير خلال التمايز. لاحظ أن> 95٪ من جميع الخلايا CD115 إيجابية بعد 5 أيام من التمايز، مشيرا الى ان واسعة الغالبية العظمى من الخلايا هي إما حيدات أو الضامة. يمكن أن يستند التصنيف على حجم الخلية وتحبب، ولكن علامات الخلوية محددة هي أكثر موثوقية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. زيادة التعبير عن الوحيدات / بلعم النضج علامة F4 / 80 يوم 5: لاحظ ظهور عدد سكانها مع وسيط F4 / 80 التعبير، وهو ما يتسق مع الوحيدات النمط الظاهري. يوم 7: لاحظ الصحيح التحول من F4 / 80 التعبير، بما يتفق مع نضوج بلعم الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ه 4 "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52347 / 52347fig4highres.jpg "/>
الشكل 4. ماوس الثابتة في رادع للحقن الوريد الذيل. تقييد بعد بعناية الماوس، وتناوب الذيل 90 درجة حتى عروق واضحة على الجانب الظهري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. المقطع العرضي تخطيطي للذيل الماوس. وتوضح الصورة موقع السفن داخل ذيل الماوس. وتقع الشرايين (الحمراء) على الجانب البطني والظهري، والأوردة على الجانب الوحشي من الذيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن تصف طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل كميات كبيرة من وحيدات الفئران من نخاع العظام. بالمقارنة مع غيرها من البروتوكولات باستخدام الدم المحيطي، التي تحصل على عائدات الوحيدات 5 من 1.4 X10 6، ونحن قادرون على الحصول على عائدات أعلى من 11 × 10 6 ± 3 × 10 6 حيدات من ماوس متبرع واحد.
وعند النظر في التحديات مع هذا الأسلوب، من المهم أن نشير إلى احتمال تلوث عند العمل تحت ظروف غير معقمة. إذا الشطف ولم يتم اتباع الخطوات التالية غسل صحيح، التلوث بالبكتيريا والفطريات ومن المرجح. بالإضافة إلى ذلك، يتكون النخاع العظمي من الايقاف الخلية غير متجانسة، بما في ذلك المحببة، الخلايا الليمفاوية وخلايا محمر. عادة هذه الخلايا تختفي بين يوم 2 و 3 من زراعة نظرا لعدم وجود عوامل النمو. بعد عامل النمو مدفوعا التمايز، الضامة هي المصدر الرئيسي للتلوث. للحفاظ على ركان عدد من الضامة منخفضة والتقليل من التفريق بين حيدات لالضامة، واستخدام لوحات مرفق منخفضة للغاية وخطوات الغسيل المذكورة أعلاه حاسمة.
ومن الصعب تحديد علامة التي هي حصرا الوحيدات محددة. التداخل بين علامات يتطلب استخدام علامة أكثر من واحد، وليس هناك تقلب في التفاصيل وحجم الخلايا في تحليل الخلية تعليق. علامات وأوصاف هو مبين في الأرقام 1-3 هي بدائل جيدة لأنواع الخلايا ممثلة في الثقافة. قد يكون من الصعب التمييز بين مختلف أنواع الخلايا، وخاصة بعد يوم 5. ولذلك أمر بالغ الأهمية لاستخدام علامات أخرى مثل CD115 وF4 / 80.
النظر في توسيع خلايا نخاع العظام في ظل ظروف خالية من الالتصاق، بلعم التمايز يمكن إطالة، ويمكن أن تتراكم وحيدات غير متمايزة. بلعم التمايز يشير تلوث؛ ومع ذلك، دوالبريد إلى الطبيعة لاصقة بهم حتى على غلاة المنخفض مرفق الأسطح زراعة، ويمكن التخلص منها بسهولة في حين حصاد فقط الخلايا غير لاصقة من الثقافة. في التجارب السابقة 1،3، والتلوث الضامة لم يؤد إلى آثار جانبية خطيرة السريرية. أظهر workup النسيجي من الأجهزة وعضلات الفئران بعد زرع الخلايا الضامة أن حقن استيعابها في أجهزة مثل الطحال والكبد أو الرئة. أظهرت استيعاب الضامة في هذه الأجهزة أي آثار السريرية الملحوظة في الفئران. الآلية الجزيئية الناجمة عن هذه الضامة يمكن أن يكون أسئلة مثيرة للاهتمام لمزيد من التحقيقات.
حيدات وكذلك الضامة تؤثر تخلق الشرايين في أمراض الشرايين الطرفية، وخاصة عند تطبيقها بشكل منتظم. الآثار الجانبية السريرية مثل انسداد أو التهاب النظامية هائل لا يمكن ملاحظة حتى بعد حقن أكثر من 2.5 مليون وحيدات، ولكن هذه الخلايا يمكن أن تؤدي إلى الالتهاب وبوتسبب كامنة تأثيرات جهازية شديدة. في التجارب على الانسان، من المرجح أن لها أهمية سريرية هذه الآثار. واثار من تخلق الشرايين يمكن أن يؤثر على نمو الورم أو اعتلال الشبكية السكري، وهذه الآثار النظامية الممكنة من ينبغي استكشافها في الدراسات المستقبلية حلول حقن الخلايا.
المنشورات السابقة 9 وصف الاختلافات بين خصائص حيدات بالدم والعظام الطرفية المشتقة من نخاع، التي تفسر لماذا خصائص حيدات من نخاع العظام يمكن أن تختلف عن تلك المعزولة من خلايا الدم الطرفية.
طريقة العزلة هو من مصلحة السريرية كذلك. سحب الدم بدلا من استخراج النخاع العظمي البشري هو أكثر واقعية في سياق الطب السريري. من المهم أن ننظر بعد رفاهية الحيوانات وتطبيق تسكين إذا لزم الأمر. لالحقن في الوريد، فمن الأهمية بمكان لممارسة التعامل مع كل من الحيوان والحقنة في نفس الوقت. إذا كان العاني واحدسوء يخضع الحقن متعددة، ونوعية الأوردة والجلد من الذيل تعاني.
وعلى الرغم من هذه العيوب، وهذه الطريقة مفيدة جدا لدراسة سلوك وخصائص وحيدات. التجارب في مجال تصلب الشرايين، وعلم المناعة أو التهاب يمكن أن تستفيد من هذا الأسلوب. ويلزم فقط 30 دقيقة من استخراج نخاع العظام إلى زرع البذور من الخلايا على 6 جيدا لوحات سطح مرفق منخفضة للغاية. يتم الحد من المخاوف الأخلاقية، لأن ارتفاع العائد من هذا البروتوكول يقلل من عدد الحيوانات اللازمة إلى الجهات المانحة الخلية. وهذه الطريقة الجديدة أن تكون مفيدة لكثير من الدراسات التي تنطوي على وحيدات.
لقد تم التركيز على زيادة العلاجي للنمو الأوعية الجانبية عن طريق زرع حيدات. طبيعة متعددة العوامل لهذه العملية قد يفسر لماذا يقترب عامل واحد للحصول على نتائج مختلطة قد ولدت من زيادة تخلق الشرايين 13،14. وقد أدى ذلك إلى فيلإجراء التحقيقات من العلاجات المستندة إلى الخلايا. وقد تم تحديد الجذعية والسلف الخلايا المشتقة من نخاع العظم ذاتي كخلايا المحتملة لزراعة الأعضاء، ولكن تم الإبلاغ فقط الفوائد السريرية المعتدلة 15. وإلى جانب الأبحاث على الجرعة، وأساليب العزل، وطرق الإدارة، لا تزال هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد نوع الخلية الأمثل. عيوب زرع الخلايا ذاتي يمكن أن يكون عدم قدرتها على تنشيط الاستجابة المناعية الفطرية و / أو التكيف، وكلاهما بالغ الأهمية لتخلق الشرايين. زيادة التهاب المحلي قد يمثل أفضل حافز لتخلق الشرايين 16.
الحقن في الوريد من وحيدات هو طريقة شائعة لزرع الخلايا داخل نماذج الماوس إذا كان المطلوب تسليم المخدرات النظامية. بسبب التأثيرات الشاملة، يمكن أن تحدث الآثار الجانبية أيضا. ضمان الوريد واستهداف للحقن. ومن الشائع أن نخلط بين الشرايين والأوردة، وخاصة عند حقن هيئة التصنيع العسكري المصطبغة بشكل كبيره. حقن الشرايين يمكن أن يسبب الصمات، التي تؤدي إلى القضايا المنهجية في الدورة الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
- Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
- Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
- Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
- Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
- Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
- Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
- Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
