Protocol
이 연구는 동물 보호 (24D-9168.11-1 / 2008-24)에 대한 독일 법률 제 8 항에있어서, 작센 및 작센 - 안할 트, Regierungspraesidium 드레스덴 / 할레의 국가의 허가 하였다.
1 세포 분리
대퇴골과 경골의 1.1 준비
- 폐쇄함에 이소 플루 란을 기화 5 % 이소 플루 란을 이용하여 농도 마우스를 마취. 마우스가 3 초 동안 이동을 중지 한 후, 자궁 경부 전위를 수행합니다.
- 에탄올 (96 %)로 두 다리를 소독. 피부와 근육을 제거하고 멸균 메스와 뼈를 분리합니다.
- 사타구니 피부 절개로 시작하고 내과쪽으로 절개를 확장하고 낮은 송아지 주위 피부의 원형 절개를 수행합니다. 근위을 벗겨 완전히 다리의 피부를 제거합니다.
- 날카로운 메스와 대퇴골에서 대퇴사 두근 근육을 분리, 전방 peroneus 모두 제거과 비복근의 근육 그룹 및 위치 및 인대를 해부하여 고관절에서 다리 관절이 어긋나 다.
- 전방 시작하고 신중하게하여 관절을 disarticulating, 다리를 회전하고 인대에 병행하여 관절 주위를 진행합니다.
- 무균 세포의 준비를 보장하기 위해 90 초 최소 96 % 에탄올로 대퇴골과 경골을 씻으십시오. 에탄올 나머지 씻어 멸균 PBS로 세척 과정을 계속합니다.
참고 : 모든 후속 단계는 오염을 방지하기 위해 멸균해야합니다.
골수의 1.2 수확
- 대퇴골과 경골의 축에 접근하도록 미세 가위 뼈 각각의 근위 및 원위 단부를 잘라. 이 뼈는 쉽게 깰 때문에,이 단계에주의하십시오.
- 따뜻한 배지로 뼈에 플러시 (M199 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)을, + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 멸균 28 G 바늘, 1 ML의 주사기, 10 ~ 15 ml의 매체 당 사이에 사용린스 뼈.
- 미세 집게로 뼈를 잡고는 반투명를 꺼질 때까지 하나 하나 씻어. 조심스럽게 세포 스트레스를 최소화하기 위해 주사기 플런저의 단부에 압력을 적용한다.
- 70 ㎛의 나일론 웹을 통해 골수를 여과하고 여액을 수집. 골수의 최대 양을 추출하려면, 근위 끝에서 반복 씻어.
- PBS와 체를 씻어 여과 액을 수집합니다. 조심스럽게 파편과 부드러운 교반과 피펫 팅에 의해 세포 대기업을 제거.
1.3 재배
- RT에서 10 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 매체의 약 25 ml의 세포를 재현 탁. 한 번 반복합니다.
- 2 차 세척 공정 후, 6 ㎖의 배지에서 세포를 재현 탁. 트리 판 블루 50 μL와 세포 용액 50 μl를 섞는다. 광학 현미경 하에서 계수 챔버에서 세포를 카운트. (C)의 수를 계산이 식을 이용하여 용액의 ELL :
- 플레이트의 저부에 영구 부착을 방지하기 위해 6 웰 초저 부착면 플레이트상에서 세포를 시드. 물론 당 최대 6 ml로 1 ㎖ 당 10 6 세포의 농도를 사용합니다.
- 세포 분화를 촉진하기 위해 20 NG / ㎖의 M-CSF와 서스펜션을 보완.
- 배양은 37 ℃에서 5 일간 세포를 5 % 이산화탄소 및 매일 관찰한다.
세포의 1.4 수확
주의 :이 단계는 얼음을 수행하여야한다. 따라서 1.4.1 또는 1.4.2 중 하나를 진행합니다.
- 이 시점에서, 그들은 초저 부착면 판하더라도 배양 플레이트에 부착 차별화 된 대 식세포를 포함한 전체 배양 수확.
- 부드러운 피펫 팅하여 전체 문화를 수확, 4 ° C PB 용액으로 분리S, 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 2 mM의 EDTA. 잘 모르는 경우 현미경으로 확인 - 플레이트가 부착 세포를 나머지의 명확한 때까지 반복합니다.
- 다른 방법으로, 주로 단핵 세포를 포함하는 현탁액 세포와 상층 액을 수확하여 대 식세포를 폐기합니다.
- EDTA가없는 PBS 용액 및 0.5 % BSA와 함께 비 - 부착 세포 수확. 온화하게 대 식세포를 빠지 방지하기 위해 너무 많은 힘을 가하지 마십시오.
1.5 FACS 분석 (선택 사항)
참고 : MACS의 사용에 의해 CD117 + stem- 및 전구 세포의 세포 현탁액을 고갈시킬 수있다. 이 절차에 대한 제조 업체 프로토콜을 사용합니다.
- 하나가 1.4.1 또는 1.4.2 단계에 따라 세포를 수확.
- 4 ° C에서 10 분 동안 250 XG에서 세포를 원심 분리기 다시이 단계를 반복합니다.
- FACS (b)의 300 μL에 재현 탁 적어도 25 만 셀프로브 당 uffer.
- 96 웰 플레이트 (물론 당 30 μL)에 세포 솔루션을 전송합니다.
- 4 ℃에서 5 분 동안 250 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 각 웰 (사용 제조 업체 희석)에 항체의 25 μl를 추가합니다.
- 단계 후 세포 표현형에 대한 제조 업체 프로토콜 다음 항체 (와 세포 1.5.1-1.5.6. 단핵구 / 대 식세포의 식별을 위해 일반적으로 사용되는 마커는 CD11b, F4 / 80 (그림 3), CD115을 포함 얼룩 (그림 2), GR- 1.
참고 : 셀 솔루션의 또 다른 설명은 CD4, CD8a, 중 CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G 및 CD192 같은 마커를 사용하는 것이 좋습니다. 휴대 특성은 이전 12 설명했다. - 4 ° C에서 20 분 동안 프로브를 품어.
- 원심 분리기 4 ° C에서 5 분 250 XG에 프로브 및 FACS 완충액 200 μL에 재현 탁은. 반복 일두 번 단계입니다.
- FACS 튜브에 프로브를 전송하고 FACS 분석 (12)을 수행합니다.
- 세포 분화를 분석 일 0, 3 및 5에서 FACS 분석을 수행한다 (12).
2. 꼬리 정맥 주입
2.1 준비
- 약 10 분 동안 37 ℃에서 가열 플레이트에 동물을 따뜻하게. 과열 징후를 인식 할 수 승온하면서 동물을 관찰한다.
- NaCl을 150 μL에, 단계 1.1 및 1.4에 고립 된 단핵 세포를 재현 탁하고, 30G 바늘을 1 ml의 인슐린 주사기로 세포를로드합니다. 가볍게 모든 단핵 세포가 주입 보장하기 위해 주사기를로드하기 전에 솔루션을 소용돌이. 항상 열 매개 부착 및 단핵구의 활성화를 방지하기 위해 얼음에 세포를 처리합니다.
2.2 금지
- 정맥 주사에 대한 마우스를 선택할 때 우리에 다른 쥐를 방해하지 마십시오.
- 제한 수단에 마우스를 놓습니다. 너무 많은 홍보를하지 마십시오essure는 뒷다리에주의합니다. (그림 4)
참고 : 다른 방법으로, 동물의 스트레스없는 취급을 보장하기 위해 전신 마취를 사용합니다. - 마우스가 제한 수단을 닫기 전에 호흡 공간이 있는지 확인하십시오.
2.3 주입
- 소독제로 주사 부위를 소독. 마우스의 꼬리에 스프레이를 최소한 1 분간 방치 할 수 있습니다.
- 혈관의 가시성을 위해, 주입 부위의 위 측면 꼬리쪽으로 약간 힘을인가하여 꼬리 정맥 혈류를 중지.
- 주입하기 전에 꼬리를 90도 돌립니다. (그림 5)
- 45도 각도로 주입한다. 천천히 주입 및 g 당 최대 5 μl의 해치는 동물을 피하기 위해.
- 실패한 주입의 표시이다 물집이 있으면 즉시 중단하고 더 근접하게 주사를 반복합니다.
- 부드러운 P를 적용하여 사출 측 지혈약 1 분 동안 ressure.
- 프로 시저의 끝에서, 리 트랙터를 열고 그 장에 마우스를 배치했다.
- 20 분은 동물이 주입에 의해 피해를 입지되지 않아 흉골 드러 누움이 유지되도록하는 마우스를 관찰합니다. 마우스가 충분한 의식을 차릴 때까지 관찰의 시간을 연장합니다. 완전히 회복 된 후에 만 다른 동물의 회사에 마우스를 돌려줍니다.
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Representative Results
뮤린 골수로부터 추출 된 세포 용액은 다양한 종류의 세포로 구성된다. 주요 종류의 세포는 림프구, 과립구와 단핵구 수 있습니다. 세포 유형은 분화 5 일 후에 수확 네이티브 현탁 세포도 1에 도시되어 크기 및 입도 (granularity)에 의해 추정 될 수있다. 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 그러나 인구의 정확한 분류는 세포 마커의 독특한 표현에 의존해야합니다.
MPS-시스템의 셀들을 식별하는 데 가장 중요한 마커는 M-CSF 수용체로서 작용하고 특별히 전구 세포, 단구, 대 식세포 및 단핵구상에서 발현되는 CD115이다. 따라서, MPS-독특한 서브 세트를 식별하는 데 사용되지 않을 수도 있지만 확실 단핵구 / 대 식세포로 분화 구동 세포의 절대 양을 추정 할 수있다. 다른시 CD115 발현의 타임 라인은 그림 2를 참조하십시오entiation.
성숙 마커 F4 / 80 청소년 단핵구, 성숙한 단핵 세포, 대 식세포를 구별하는 데 유용합니다. 대 식세포는 마커에 대한 부정적 단핵 세포 전구 세포를, 청소년에 비해 F4 / 80의 강한 표현을 보여줍니다. 성숙한 단핵구는 F4 / 80의 중간 표현을 보여줍니다. CD115 및 F4 / 80 마커의 조합은 따라서 세포 분화 (그림 3 참조) 정량화 및 모니터링을위한 실현 가능한 방법을 나타냅니다.
CD115 및 F4 / 80의 조합은 종래의 세포 배양 애플리케이션 루틴 감시 및 품질 관리를 위해 충분하다. 배양 5 일째 골수 유래 단핵구의 더욱 상세한 검사는 말초 혈액 단핵 세포 (12)의 것과 일치 그들의 구조적 및 기능적 성질을 확인한다.
그것은 꼬리에 긴장을 피하고, 제한 수단에 조심스럽게 마우스를 해결하는 것이 중요합니다. freedo 제한주사를 용이하게하기 위해, 호흡 저해하지 않고 최대한 이동 m.
그림 1. 왼쪽 패널 :. 문화의 날 (1)에서 세포 유형의 구성 세포 유형은 림프구, 단핵구와 과립구를 포함한다. 오른쪽 패널 : 재배 동안 이동 셀룰러 조성합니다. 셀 인구는 단핵 세포와 대 식세포를 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분화 동안 CD115의 발현 그림 2. 타임 라인. 모든 세포의> 95 %를 주는 광대 한 것을 나타내는, 차별화 5 일 후 긍정적 인 CD115된다 세포의 대부분은 단핵구 또는 대 식세포 중 하나입니다. 분류가 세포의 크기와 입도,하지만 특정 세포 마커가 더 신뢰할 수있는 기반으로 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
.의 단핵구 / 대 식세포의 성숙 마커 F4 / 80 일 5 식 증가 그림 3. : 단핵 세포 표현형과 일치 중간 F4 / 80 식을 가진 인구의 모양을합니다. 7 일 :. 대식 세포의 성숙과 일치 F4 / 80 식의 오른쪽 시프트 참고 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4. 마우스, 후 조심스럽게 마우스를 억제. 꼬리 정맥 주입에 대한 제한 수단에 고정 된 정맥 등의 측면에서 볼 때까지 꼬리를 90도 회전합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
마우스 꼬리도 5의 개략적 인 단면도가. 포토 마우스 꼬리 혈관 내에서의 위치를 도시한다. 동맥 (빨간색)이 복부와 등의 측면에 위치하며, 정맥 꼬리의 측면에있는된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 골수로부터 단핵구 뮤린 다량 격리시키는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명한다. 단구 수율 X10 6 5 1.4을 수득 말초 혈액을 사용하는 다른 프로토콜에 비해, 우리는 단일 공여자 마우스에서 11 × 106 ± 3 × 106 단핵구 높은 수율을 얻을 수있다.
이 방법의 문제점을 고려할 때, 비 멸균 조건 하에서 작업 할 때 오염 가능성을 언급하는 것이 중요하다. 헹굼 다음 세척 단계가 제대로 따라 박테리아 및 진균에 의한 오염 가능성이없는 경우이다. 또한, 골수 과립구, 림프구 및 적혈구 세포를 포함 이종 세포 현탁액로 구성되어 있습니다. 일반적으로 인해 이들 세포 성장 인자의 부족 일 2와 3 사이의 재배 사라진다. 성장 인자 분화 구동 후 마크로파지는 오염의 주요 원인이다. T를 유지대 식세포 및 단핵 세포의 분화를 최소화하기 위해, 초저 부착 플레이트의 사용과 전술 한 세척 단계가 중요 낮은 식세포 그 번호.
이는 배타적 단핵구 특이 마커를 식별하는 것이 곤란하다. 마커 사이의 간섭은 하나 이상의 표지의 사용을 필요로하고, 가변성은 세포 현탁액을 분석하는 입도 및 세포의 크기가있다. 마커 및 그림 1-3과 같이 설명은 문화의 대표적인 세포 유형에 대한 좋은 대안이다. 그것은 일 5. 따라서 그것은 CD115 및 F4 / 80과 같은 다른 마커를 사용하는 것이 특히 중요하다 후, 다양한 유형의 세포를 구별하기 어려울 수있다.
접착력이없는 조건에서 골수 세포의 팽창을 고려하면, 마크로파지 분화는 연장 될 수 있으며, 미분화 단핵구 축적 할 수있다. 대식 세포의 분화는 오염을 나타내고, 그러나, 뒤단지 문화에서 비 접착 세포를 수확하는 동안도 초저 부착 재배 표면에 자신의 밀착성에 전자, 그들은 쉽게 폐기 할 수있다. 이전 실험 1,3에서 대 식세포에 의한 오염은 심각한 임상 적 부작용에지도 않았습니다. 장기와 세포 이식 후 쥐의 근육의 조직 학적 정밀 검사 주입 대 식세포는 비장, 간이나 폐 등의 장기에 동화 것으로 나타났다. 이들 기관에서 대 식세포의 동화는 쥐에서 더 관찰 임상 효과를 입증하지 않습니다. 이러한 대 식세포에 의해 유발 분자 메커니즘은 더 연구에 대한 흥미로운 질문이 될 수 있습니다.
전신적으로 적용될 때 단핵구 대 식세포뿐만 아니라, 특히, 말초 동맥 질환 동맥 형성에 영향을 미친다. 이러한 색전증 또는 대규모 전신 염증 임상 부작용은 더 이상 250 만 단핵 세포를 주입 한 후 관찰되지 않을 수 있지만,이 세포는 염증과 포를 트리거 할 수 있습니다에 잠재적 인 심각한 전신 효과가 발생합니다. 인간 시험에서, 이러한 효과는 임상 적 중요성을 가질 가능성이 높다. 동맥 신생의 트리거는 종양의 성장 또는 당뇨 망막 병증, 미래의 연구에서 탐구해야 주입 셀 솔루션 등 가능한 전신 효과에 영향을 줄 수 있습니다.
이전 서적 골수 단핵구의 속성 말초 혈액 세포로부터 분리 다를 수있는 이유를 설명 말초 혈액 - 골수 유래 단핵구의 특성 차이를 설명하는 구.
단리의 방법뿐만 아니라 임상 적 관심사이다. 혈액을 그리기 대신에 인간의 골수를 추출하는 임상 의학의 맥락에서 더 실용적입니다. 그것은 동물의 복지를 돌봐하고 필요한 경우 진통제를 적용하는 것이 중요하다. 정맥 내 주사의 경우, 동물과 동시에 주사기를 모두 처리 실천하는 것이 중요하다. 하나의 애니 경우말은 여러 주사를 겪고, 정맥의 품질과 꼬리의 피부는 고통.
이러한 단점에도 불구하고,이 방법은 행동과 단핵 세포의 특성을 연구하는 데 매우 유용하다. 죽상 동맥 경화증, 면역학 또는 염증의 분야에서 실험이 방법 혜택을 누릴 수 있습니다. 만 30 분은 6 자 초저 부착 표면 접시에 세포의 파종에 골수를 추출에서 필요합니다. 이 프로토콜의 높은 수율이 도너 세포로서 필요한 동물의 수를 최소화하기 때문에 윤리적 문제가 최소화된다. 이 새로운 방법은 단핵구와 관련된 많은 연구에 도움이 될 것입니다.
우리는 단핵 세포의 이식을 통해 담보 혈관 성장 치료 확대에 초점을 맞추고있다. 하나의 요인은 동맥 신생의 증가가 생성 한 혼합 된 결과 13, 14에 대한 접근 왜이 과정의 인성 특성을 설명 할 수 있습니다. 이에하게되었다세포 기반 치료법 비롯하여 조사. 자가 골수 유래 줄기 세포 및 선조 세포는 세포 이식에 잠재적으로 식별되고 있지만 임상 적 이점은 보통 15보고되었다. 투여, 분리 방법 및 투여 경로에 대한 연구 외에, 더 많은 연구가 여전히 최적 셀 타입을 결정하기 위해 필요하다. 자가 세포 이식의 단점은 선천성 및 / 또는 적응 면역 반응을 활성화하기 위해 자신의 무능력이 될 수 있으며, 둘 동맥 형성에 중요하다. 로컬 염증의 증가는 동맥 신생 16 가장 자극을 나타낼 수있다.
전신성 약물 투여가 요구되는 경우에는 정맥 내 주사의 단핵구는 마우스 모델 내의 세포 이식을위한 일반적인 방법이다. 때문에 전신 효과, 부작용도 발생할 수있다. 정맥 주사의 대상이되어 있는지 확인합니다. 그것은 특히 심하게 착색 된 마이크를 주입 동맥과 정맥을 혼동하는 것이 일반적이다전자. 동맥 주사는 순환의 전신 문제로 이어질 색전을 일으킬 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
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