Protocol
Este estudio se realizó con permiso del Estado de Sajonia y Sajonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, de acuerdo con el Artículo 8 de la Ley alemana de protección de los animales (24D-9168,11-1 / 2008-24).
Aislamiento 1 celular
1.1 Preparación de fémur y la tibia
- Anestesiar al ratón usando una concentración de isoflurano 5% mediante la vaporización de isoflurano en un contenedor cerrado. Después de que el ratón ha dejado de moverse durante 3 segundos, realice la dislocación cervical.
- Desinfectar las extremidades traseras con etanol (96%). Quite la piel y los músculos y separar los huesos con un bisturí estéril.
- Comience con una incisión en la piel inguinal, y extender la incisión hacia el maléolo interno y realizar una disección circular de la piel alrededor de la pantorrilla. Retire la piel de las piernas completamente por pelarla proximal.
- Separe el músculo cuádriceps del fémur con un bisturí afilado, eliminar tanto las peroneo anteriory los grupos de músculos gastrocnemios y desarticular la pierna en la articulación de la cadera mediante la localización y la disección de los ligamentos.
- Iniciar anterior y proceder alrededor de la articulación, girando con cuidado la pierna y seccionar los ligamentos, desarticulando con ello la articulación.
- Lavar fémur y la tibia con etanol al 96% durante un mínimo de 90 segundos para garantizar la preparación de células aséptico. Continuar el proceso de lavado con PBS estéril para enjuagar el etanol restante.
Nota: Todas las etapas posteriores deben ser estériles para evitar la contaminación.
1.2 La recolección de médula ósea
- Cortar el extremo proximal y distal de cada hueso con un par de tijeras finas para obtener acceso a los ejes femoral y tibial. Tenga cuidado con este paso, ya que estos huesos se rompen con mucha facilidad.
- Lavar los huesos con medio caliente (M199 + 10% de suero de ternera fetal (FCS), + 1% de penicilina / estreptomicina). Utilice una aguja estéril 28-G, una jeringa de 1 ml, y entre 10-15 ml por medio dehueso para enjuagar.
- Sostenga el hueso con pinzas finas y enjuague uno por uno hasta que se vuelva semi-transparente. Cuidado aplique presión al extremo del émbolo de jeringa con el fin de minimizar el estrés celular.
- Filtrar la médula ósea a través de una web nylon 70 micras y recoger el filtrado. Para extraer la cantidad máxima de médula ósea, enjuagar varias veces desde los extremos distal y proximal.
- Enjuague el tamiz con PBS y recoger el filtrado. Desalojar cuidadosamente escombros y conglomerados celulares por agitación suave y pipeta.
1.3 Cultivo
- Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 10 min a TA. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con aproximadamente 25 ml de medio. Repetir una vez.
- Resuspender las células en 6 ml de medio después de la segunda etapa de lavado. Mezclar 50 l de la solución de células con 50 l de azul de tripano. Contar las células en una cámara de recuento bajo un microscopio de luz. Calcular el número de cells en la solución utilizando esta fórmula:
- Seed las células en placas de superficie ultra-bajo de fijación 6 pocillos para evitar la adhesión permanente a la parte inferior de la placa. Utilice una concentración de 10 6 células por ml con un máximo de 6 ml por pocillo.
- Suplemento de la suspensión con 20 ng / ml de M-CSF para promover la diferenciación celular.
- Cultivar las células durante 5 días a 37 ° C y el dióxido de carbono al 5% y observar todos los días.
1.4 La recolección de células
Nota: Estos pasos se deben realizar en hielo. Proceda con cualquiera 1.4.1 o 1.4.2 en consecuencia.
- En este punto, efectuar toda la cultura, incluyendo macrófagos diferenciados que se adherirá a la cultura placas, incluso si son placas de superficie ultra bajo de apego.
- Efectuar toda la cultura por pipeteo suave y separar con una solución de 4 ° C PBS, 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA) y EDTA 2 mM. Repita hasta que las placas son claras de quedarse células adherentes - confirmar con un microscopio si no está seguro.
- Alternativamente, desechar los macrófagos adherentes al cosechar el sobrenadante con las células en suspensión, que contienen predominantemente monocitos.
- Recoger las células no adherentes con una solución de PBS-EDTA libre y 0,5% de BSA. No aplique demasiada fuerza con el fin de evitar que se desprenda macrófagos ligeramente adherentes.
1.5 FACS-análisis (Opcional)
Nota: Es posible agotar la suspensión celular de células progenitoras stem- y CD117 + por el uso de MACS. Utilice los protocolos del fabricante para este procedimiento.
- Recoger las células de acuerdo a cualquiera de los pasos 1.4.1 o 1.4.2.
- Centrifugar las células a 250 xg durante 10 min a 4 ° C y repetir este paso de nuevo.
- Volver a suspender al menos 250.000 células en 300 l de FACS bUffer por sonda.
- Transferencia de solución de células en un 96 pocillos de la placa (30 l por pocillo).
- Centrifugar la suspensión celular a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 25 l de anticuerpo a cada pocillo (dilución de uso del fabricante).
- Teñir las células con anticuerpos (siguientes protocolos del fabricante para el fenotipado de células después de los pasos 1.5.1-1.5.6. Marcadores comúnmente utilizados para la identificación de monocitos / macrófagos incluyen CD11b, F4 / 80 (Figura 3), CD115 (Figura 2), y Gr- 1.
Nota: Para obtener una descripción más amplia de soluciones de células, se recomienda el uso de marcadores como CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G y CD192. Características celulares se han descrito anteriormente 12. - Se incuban las sondas para 20 min a 4 ° C.
- Centrifugar las sondas a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y resuspender con 200 l de tampón FACS. Repita ªes el paso dos veces.
- Transferir las sondas en tubos de FACS y realizar el análisis FACS 12.
- Realizar análisis FACS 12 en el día 0, 3 y 5 para analizar la diferenciación celular.
2. vena de la cola de inyección
2.1 Preparación
- Calentar los animales en una placa de calentamiento a 37 ° C durante unos 10 minutos. Observar a los animales mientras se calentaba a reconocer los signos de sobrecalentamiento.
- Resuspender los monocitos, aislados en pasos 1.1- 1.4, en 150 l de NaCl, y cargar las células en una jeringa de 1 ml de insulina con una aguja 30G. Ligeramente agite la solución antes de cargar la jeringa para asegurar que todos los monocitos se inyectan. Siempre manipular células en hielo para evitar la fijación mediada por el calor y la activación de los monocitos.
2.2 Restricción
- Evitar molestar a otros ratones en la jaula la hora de elegir un ratón para inyección intravenosa.
- Coloque el ratón en el inmovilizador. Evite el exceso de prEssure y tenga cuidado con las extremidades posteriores. (Figura 4)
Nota: También puede utilizar anestesia general para garantizar el estrés libre manejo de los animales. - Asegúrese de que el ratón dispone de espacio para respirar antes de cerrar el inmovilizador.
2.3 Inyección
- Desinfectar el lugar de inyección con un agente de desinfección. Rocíe en la cola del ratón y dejar reposar durante al menos 1 min.
- Detenga el flujo de sangre venosa de la cola mediante la aplicación de una presión suave en la parte lateral de la cola por encima de la zona de inyección, para una mejor visibilidad de las venas.
- Gire la cola 90 grados, antes de la inyección. (Figura 5)
- Inyectar en un ángulo de 45 grados. Inyectar lentamente y no más de 5 l por g para evitar dañar a los animales.
- Si hay una ampolla, que es un signo de una inyección fallado, descontinuar inmediatamente y repetir la inyección más proximal.
- Detenga el sangrado en el lado de la inyección mediante la aplicación de p suaveresión durante aproximadamente 1 min.
- Al final del procedimiento, abra el retractor y colocar el ratón en su jaula.
- Observe el ratón durante 20 minutos para asegurarse de que el animal no se vea perjudicada por la inyección y decúbito esternal se mantiene. Extender el momento de la observación hasta que el ratón recupera la conciencia suficiente. Devuelva el ratón a la compañía de otros animales sólo después de que se ha recuperado totalmente.
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Representative Results
La solución de células extraída de la médula ósea murina se compone de diversos tipos de células. Los tipos de células principales son los linfocitos, granulocitos y monocitos. Los tipos de células pueden ser estimados por el tamaño y la granularidad, que se muestra en la Figura 1 para ambas suspensiones nativas y células cosechadas después de 5 días de diferenciación. Tenga en cuenta la composición celular cambiando durante el cultivo. Sin embargo, la clasificación exacta de las poblaciones debe confiar en la expresión distintivo de marcadores celulares.
El marcador más importante que se utiliza para identificar las células del sistema-MPS es CD115, que funciona como el receptor de M-CSF y se expresa específicamente en progenitores de los monocitos, los monocitos y los macrófagos. Por lo tanto, no puede ser utilizado para identificar distintivos MPS-subconjuntos, pero puede estimar de forma fiable la cantidad absoluta de células clavadas en la diferenciación de los monocitos / macrófagos. Vea la Figura 2 para una línea de tiempo de la expresión CD115 durante diferirciación.
El marcador de madurez F4 / 80 es útil para diferenciar los monocitos juveniles, monocitos y macrófagos maduros. Los macrófagos muestran una fuerte expresión de F4 / 80 en comparación con juvenil progenitores de monocitos, que son negativos para el marcador. Monocitos maduros muestran una expresión intermedia de F4 / 80. Una combinación de CD115 y F4 / 80 marcadores, por tanto, representa un método viable para la cuantificación y el seguimiento de la diferenciación celular (véase la Figura 3).
La combinación de CD115 y F4 / 80 es suficiente para la observación de cultivo de rutina y el control de calidad antes de la aplicación de las células. Un examen más detallado de los monocitos derivadas de la médula ósea en el día 5 de cultivo confirma sus propiedades estructurales y funcionales en concordancia con las de los monocitos de sangre periférica 12.
Es importante fijar el ratón cuidadosamente en el restrictor, evitando la tensión en la cola. Restringir freedom de movimiento tanto como sea posible sin inhibir la respiración para facilitar la inyección.
Figura 1. Panel izquierdo:. Composición de tipos de células en el día 1 en la cultura Tipos de células incluyen linfocitos, monocitos y granulocitos. Panel derecho: Tenga en cuenta la composición celular cambiando durante el cultivo. Población celular incluye monocitos y macrófagos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Línea de tiempo de la expresión de CD115 durante la diferenciación. Tenga en cuenta que> 95% de todas las células son CD115 positiva después de 5 días de diferenciación, lo que indica que la gran mayoría de las células son o bien los monocitos o macrófagos. La clasificación puede basarse en el tamaño celular y granularidad, pero los marcadores celulares específicos son más confiables. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El aumento de la expresión de monocitos / macrófagos marcador madurez F4 / 80 Día 5:. Nota la apariencia de una población con intermedio / 80 expresión F4, que es coherente con el fenotipo de los monocitos. Día 7:. Tenga en cuenta el derecho de cambio de F4 / 80 expresión, en consonancia con la maduración de los macrófagos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. Ratón fija en lo detiene para inyección en la vena de la cola. Restricción después cuidadosamente el ratón, gire la cola de 90 grados hasta que las venas son visibles en el lado dorsal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. sección transversal esquemática de la cola del ratón. La imagen ilustra la ubicación de los vasos dentro de la cola de ratón. Las arterias (rojo) se encuentran en la parte ventral y dorsal, y las venas están en el lado lateral de la cola. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se describe un método simple y rentable para aislar grandes cantidades de monocitos murinos de la médula ósea. En comparación con otros protocolos que utilizan la sangre periférica, que obtienen rendimientos de monocitos 5 de 1,4 x10 6, somos capaces de obtener mayores rendimientos de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocitos de un solo ratón donante.
Al considerar los desafíos con este método, es importante mencionar la posibilidad de contaminación cuando se trabaja en condiciones no estériles. Si el aclarado y las siguientes etapas de lavado no se siguen correctamente, la contaminación por bacterias y hongos es probable. Además, la médula ósea consiste en suspensiones de células heterogéneas, incluyendo los granulocitos, linfocitos y células eritroides. Normalmente estas células desaparecen entre el día 2 y 3 del cultivo debido a la falta de factores de crecimiento. Después de factor de crecimiento impulsado por la diferenciación, los macrófagos son la principal fuente de contaminación. Para mantener tél número de macrófagos bajas y para minimizar la diferenciación de monocitos a macrófagos, el uso de placas ultra-bajas de fijación y las etapas de lavado mencionados anteriormente son críticos.
Es difícil identificar un marcador que es exclusivamente monocito-específico. La interferencia entre los marcadores requiere el uso de más de un marcador, y hay variabilidad en la granularidad y tamaño de las células en el análisis de las suspensiones de células. Los marcadores y las descripciones que se muestran en las figuras 1-3 son buenas alternativas para tipos de células representativas de la cultura. Puede ser difícil distinguir los diversos tipos de células, especialmente después de día 5. Por lo tanto, es fundamental utilizar otros marcadores como CD115 y F4 / 80.
Teniendo en cuenta la expansión de las células de la médula ósea en condiciones libres de adherencias, la diferenciación de macrófagos puede ser prolongada y monocitos indiferenciados se puede acumular. Diferenciación de los macrófagos indica contaminación; sin embargo, due para su naturaleza adhesiva incluso en superficies de cultivo de ultra bajo de apego, puede ser fácilmente descartado, mientras que sólo la cosecha de células no adhesivas de la cultura. En experimentos previos 1,3, la contaminación por los macrófagos no ha dado lugar a graves efectos secundarios clínicos. Estudio diagnóstico histológico de los órganos y los músculos de los ratones después de un trasplante de células mostró que los macrófagos inyectados asimilados en órganos como el bazo, el hígado o los pulmones. La asimilación de los macrófagos en estos órganos no mostró efectos clínicos observables en ratones. El mecanismo molecular provocada por estos macrófagos puede ser cuestiones interesantes para futuras investigaciones.
Los monocitos, así como los macrófagos afectan arteriogénesis en la enfermedad arterial periférica, especialmente cuando se aplica sistémicamente. Efectos secundarios clínicos como embolia o inflamación sistémica masiva no pudieron observarse incluso después de la inyección de más de 2,5 millones de monocitos, pero estas células pueden provocar inflamación y pocialmente causar efectos sistémicos graves. En los ensayos en humanos, estos efectos pueden tener importancia clínica. La activación de arteriogénesis puede afectar el crecimiento del tumor o la retinopatía diabética, y tales posibles efectos sistémicos de soluciones de células inyectadas deben ser explorados en estudios futuros.
Publicaciones anteriores 9 describen las diferencias entre las características de los monocitos periféricos derivadas de médula de sangre y hueso, que explican por qué las propiedades de los monocitos de la médula ósea pueden diferir de las aisladas a partir de células de sangre periférica.
El método de aislamiento es de interés clínico también. La extracción de sangre en lugar de extraer la médula ósea humana es más práctico en el contexto de la medicina clínica. Es importante cuidar el bienestar de los animales y de aplicar analgesia si es necesario. Para inyecciones intravenosas, es crítico para la práctica de manejo tanto para el animal y la jeringa al mismo tiempo. Si un solo animal está experimentando múltiples inyecciones, la calidad de las venas y la piel de la cola sufren.
A pesar de estas desventajas, este método es muy útil para estudiar el comportamiento y las características de los monocitos. Los experimentos en el campo de la aterosclerosis, la inmunología o la inflamación pueden beneficiarse de este método. A sólo 30 minutos se requiere de la extracción de la médula ósea para la siembra de células en placas de superficie ultra bajo de fijación de 6 pocillos. Las preocupaciones éticas se reducen al mínimo, porque el alto rendimiento de este protocolo minimiza el número de animales necesarios como donantes de células. Este nuevo método será útil para muchos estudios con monocitos.
Nos hemos centrado en el aumento terapéutico de crecimiento de los vasos colaterales a través del trasplante de los monocitos. La naturaleza multifactorial de este proceso podría explicar por qué factor se acerca a los resultados mixtos de aumento de arteriogénesis han generado 13,14. Esto ha llevado a la envestigación de las terapias basadas en células. Células madre y progenitoras derivadas de la médula de hueso autólogo se han identificado como potenciales para el trasplante de células, pero sólo beneficios clínicos moderados se han reportado 15. Además de la investigación de la dosis, los métodos de aislamiento, y las vías de administración, aún se necesita más investigación para determinar el tipo celular óptimo. Una desventaja de trasplante autólogo de células podría ser su incapacidad para activar la respuesta inmune innata y / o adaptativa, y ambos son críticos para la arteriogénesis. El aumento de la inflamación local puede representar el mejor estímulo para arteriogénesis 16.
La inyección intravenosa de monocitos es un método común para el trasplante de células dentro de los modelos de ratón si se desea la entrega sistémica de fármacos. Debido a los efectos sistémicos, los efectos secundarios pueden ocurrir también. Asegúrese de que la vena se apunta para la inyección. Es común confundir las arterias y las venas, especialmente cuando se inyectan micrófono muy pigmentadae. Inyección arterial puede causar embolias, que conducen a problemas sistémicos en circulación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
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