Protocol
Denna studie utfördes med tillstånd från delstaten Sachsen och Sachsen-Anhalt, Regierungspräsidium Dresden / Halle, enligt 8 § i den tyska lagen om djurskydd (24D-9168,11-1 / 2008-24).
1 Cell Isolering
1.1 Beredning av lårben och skenben
- Bedöva musen med hjälp av en isofluran koncentration 5% genom förångning isofluran i en sluten behållare. Efter att musen har slutat röra sig i 3 sek, utföra halsdislokation.
- Desinficera bakbenen med etanol (96%). Ta bort hud och muskler och separera benen med en steril skalpell.
- Börja med en ljumskhud snitt, och förlänga snittet mot mediala fotknölen och utför en cirkulär dissektion av huden runt nedre vaden. Ta bort huden på benen helt genom att dra den proximalt.
- Lossa quadriceps muskler från lårbenet med en vass skalpell, ta bort båda de främre peroneusoch gastrocnemius muskelgrupper och disarticulate benet i höftleden genom att lokalisera och dissekera ligamenten.
- Börja anteriort och fortsätt runt leden genom att försiktigt vrida benet och transecting ligamenten och därmed disarticulating fogen.
- Tvätta lårben och skenben med 96% etanol i minst 90 sek för att säkerställa aseptisk cellberedning. Fortsätt tvättprocessen med steril PBS för att skölja bort återstående etanol.
Obs: Alla efterföljande steg måste vara sterila för att undvika kontaminering.
1.2 Skörd av benmärg
- Skär den proximala och distala änden av varje ben med ett par fina saxar för att få tillgång till lårbens- och skenbensaxlar. Var försiktig med det här steget, eftersom dessa ben bryts väldigt lätt.
- Spola benen med varmt medium (M199 + 10% fetalt kalvserum (FCS), + 1% penicillin / streptomycin). Använd en steril 28 G-nål och en 1 ml spruta, och mellan 10 till 15 ml medium perben för sköljning.
- Håll benet med en fin pincett och skölj en efter en tills den blir halvgenomskinlig. Tillämpas försiktigt trycket till slutet av sprutkolven för att minimera cellstress.
- Filtrera benmärgen genom ett 70 pm nylon webb och samla filtratet. För att få ut maximal mängd benmärg, skölj upprepade gånger från de distala och proximala ändar.
- Skölj sikten med PBS och samla filtratet. Noggrant lösgöra skräp och cellulära konglomerat genom försiktig omröring och pipettering.
1,3 Odling
- Centrifugera cellsuspensionen vid 250 xg under 10 min vid RT. Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellerna med ca 25 ml medium. Upprepa en gång.
- Resuspendera cellerna i 6 ml medium efter det andra tvättsteget. Blanda 50 ìl av celllösningen med 50 pl trypanblått. Räkna cellerna i en räkningskammare under ett ljusmikroskop. Beräkna antalet calnar i lösningen med hjälp av denna formel:
- Seed cellerna på 6-brunnars ultralåg fästyta plattorna för att förhindra permanent vidhäftning till botten av plattan. Använd en koncentration av 10 6 celler per ml med upp till 6 ml per brunn.
- Komplettera suspensionen med 20 ng / ml M-CSF för att befrämja celldifferentiering.
- Kultur cellerna för 5 dagar vid 37 ° C och 5% koldioxid och observera dagligen.
1.4 Skörd av celler
OBS: Dessa steg bör utföras på is. Fortsätt med antingen 1.4.1 eller 1.4.2 i enlighet därmed.
- Vid denna punkt, fånga hela kulturen, inklusive differentierade makrofager som kommer att följa kulturplåtar, även om de är extremt låg fäst ytplattoma.
- Skörda hela kulturen genom försiktig pipettering och demontering med en lösning av 4 ° C PBS, 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA. Upprepa tills plattorna är klara för återstående vidhäftande celler - bekräfta i mikroskop om du är osäker.
- Alternativt, kasta vidhäftande makrofager genom att skörda supernatanten med cellerna i suspension, som till övervägande del innehåller monocyter.
- Skörda icke vidhäftande celler med en lösning av EDTA-fri PBS och 0,5% BSA. Använd inte för mycket kraft för att undvika att rubba milt vidhäftande makrofager.
1.5 FACS-analys (tillval)
OBS: Det är möjligt att utarma cellsuspension av CD117 + stem- och progenitorceller genom användning av MACS. Använd tillverkarens protokoll för detta förfarande.
- Skörda cellerna enligt endera steg 1.4.1 eller 1.4.2.
- Centrifugera cellerna vid 250 xg under 10 min vid 4 ° C och upprepa detta steg en gång.
- Resuspendera minst 250.000 celler i 300 pl FACS bUffer per prob.
- Överför cell lösningen på en 96-brunnars-platta (30 pl per brunn).
- Centrifugera cellsuspensionen vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 25 | il av antikropp till varje brunn (användning tillverkaren utspädning).
- Färga cellerna med antikroppar (efter tillverkarens protokoll för cell fenotypning efter steg 1.5.1-1.5.6. Vanligen använda markörer för monocyt / makrofag identifiering inkluderar CD11b, F4 / 80 (Figur 3), CD115 (Figur 2), och Gr- 1.
Obs: För ytterligare beskrivning av celllösningar, är användningen av markörer som CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G och CD192 rekommenderas. Cellular egenskaper har tidigare beskrivits 12. - Inkubera prober för 20 min vid 4 ° C.
- Centrifugera sonder användas vid 250 xg under 5 min vid 4 ° C och återsuspendera med 200 | il FACS-buffert. Upprepa thär steg två gånger.
- Överför sonder i FACS rör och genomfört FACS-analys 12.
- Utför FACS-analys 12 på dag 0, 3 och 5 för att analysera celldifferentiering.
2. injektion i svansvenen
2,1 Framställning
- Värm djuren på en värmeplatta vid 37 ° C under ca 10 min. Observera djuren under värmning att känna igen tecken på överhettning.
- Resuspendera monocyter, isolerade i steg 1,1- 1.4, i 150 | il NaCl, och ladda cellerna i en spruta 1 ml insulin med en 30G nål. Lätt virvel lösningen innan du lägger sprutan för att säkerställa alla monocyter injiceras. Hantera alltid celler på is för att undvika värme medierad infästning och aktivering av monocyter.
2.2 Besöksförbud
- Undvik att störa andra möss i buren när man väljer en mus för intravenös injektion.
- Placera musen i som hindrar. Undvik för mycket prEssure och vara noga med bakbenen. (Figur 4)
Obs: Du kan också använda narkos för att garantera stressfri djurhanteringen. - Se till att musen har plats för att andas innan du stänger som hindrar.
2,3 Injektion
- Desinficera injektionsstället med desinfektionsmedel. Spraya på svansen på musen och låt stå i minst 1 minut.
- Sluta venösa blodflödet i svansen genom ett lätt tryck på den laterala sidan svansen ovanför injektionsstället, för bättre synlighet i venerna.
- Vrid svansen 90 grader, före injektion. (Figur 5)
- Injicera vid en 45 graders vinkel. Injicera långsamt och högst 5 l per g för att undvika att skada djuren.
- Om det finns en blåsa, vilket är ett tecken på en misslyckad injektion, sluta omedelbart och upprepa injektionen mer proximalt.
- Stoppa blödning vid injektionssidan genom ett lätt pryck under ca 1 min.
- Vid slutet av förfarandet öppnar sårhaken och placera musen i sin bur.
- Observera musen i 20 minuter för att se till att djuret inte skadas av injektionen och bröst VILA bibehålls. Förläng tiden för observation tills musen återfår tillräcklig medvetenhet. Återgå musen till sällskap av andra djur endast när den har återhämtat sig helt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellen lösningen extraherades från murin benmärg består av olika celltyper. De stora celltyper är lymfocyter, granulocyter och monocyter. Celltyper kan uppskattas genom storlek och granularitet, vilken visas i figur 1 för både nativa suspensioner och celler skördas efter fem dagar av differentiering. Notera skiftande cellulära sammansättning under odling. Dock måste korrekt klassificering av populationer lita på distinkt uttryck för cellulära markörer.
Den viktigaste markör används för att identifiera celler av MPS-systemet är CD115, vilken fungerar som den M-CSF-receptor och är specifikt uttryckt på monocyt progenitorceller, monocyter och makrofager. Därför kan den inte användas för att identifiera distinkta MPS-delmängder, men kan en tillförlitlig uppskattning av absoluta mängden celler som drivs in i monocyt / makrofag differentiering. Se figur 2 för en tidslinje över CD115 uttryck under skiljerentiation.
Löptiden markör F4 / 80 är användbar för att skilja unga monocyter, mogna monocyter och makrofager. Makrofager visar starkt uttryck av F4 / 80 i jämförelse med ungdoms monocyt stamceller, vilka är negativa för markören. Mogna monocyter visar mellan uttryck av F4 / 80. En kombination av CD115 och F4 / 80 markörer utgör därför ett genomförbart metod för att kvantifiera och övervaka celldifferentiering (se figur 3).
Kombinationen av CD115 och F4 / 80 är tillräcklig för rutinodling observation och kvalitetskontroll före applicering av celler. En närmare granskning av benmärgs-härledda monocyter vid dag 5 i odling bekräftar deras strukturella och funktionella egenskaper i överensstämmelse med de av perifera blodmonocyter 12.
Det är viktigt att fixera musen försiktigt i rainer, undvika spänningar på svansen. Begränsa freedom av rörelse så mycket som möjligt utan att hämma andning för att underlätta injektionen.
Figur 1. Vänster panel:. Sammansättning av celltyper vid dag 1 i kultur celltyper inkluderar lymfocyter, monocyter och granulocyter. Höger panel: Notera skiftande cellulära sammansättning under odling. Cellpopulation omfattar monocyter och makrofager. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Timeline av CD115 uttryck under differentiering. Notera att> 95% av alla celler CD115 positiv efter 5 dagar av differentiering, vilket tyder på att den stora Majoriteten av celler är antingen monocyter eller makrofager. Klassificering kan baseras på cellstorlek och kornighet, men specifika cellulära markörer är mer tillförlitliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Öka uttryck av monocyt / makrofag löptid markör F4 / 80 Dag 5:. Notera utseendet på en population med mellanliggande F4 / 80 uttryck, vilket överensstämmer med monocyt fenotyp. Dag 7:. Notera den högra förskjutning av F4 / 80 uttryck, i linje med makrofag mognad klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
e 4 "src =" / filer / ftp_upload / 52.347 / 52347fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Musen fast i rainer för svansvenen injektion. Efter att noggrant hållande musen, rotera svansen 90 grader tills venerna syns på ryggsidan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Schematiskt tvärsnitt av musens svans. Bilden illustrerar placeringen av fartyg inom musens svans. De artärer (röd) är placerade på den ventrala och ryggsidan, och vener är på den laterala sidan av svansen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en enkel och kostnadseffektiv metod för att isolera stora mängder av murina monocyter från benmärg. I jämförelse med andra protokoll som använder perifert blod, vilket erhåller monocyt avkastning 5 av 1,4 x10 6, har vi möjlighet att få högre avkastning på 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocyter från en enda donator mus.
När man överväger utmaningar med denna metod är det viktigt att nämna risken för förorening vid arbete under icke-sterila betingelser. Om sköljning och följande tvättsteg inte följs ordentligt, förorening av bakterier och svampar är troligt. Dessutom, benmärg består av heterogena cellsuspensioner, inklusive granulocyter, lymfocyter och erytroida celler. Normalt dessa celler försvinna mellan dag 2 och 3 i odling på grund av bristen av tillväxtfaktorer. Efter tillväxtfaktor driven differentiering, makrofager är den största föroreningskällan. För att hålla than antal makrofager låga och för att minimera differentiering av monocyter till makrofager, användning av ultralåga fastsättningsplattor och tvättningsstegen som nämns ovan är kritiska.
Det är svårt att identifiera en markör som är exklusivt monocyt-specifika. Interferens mellan markörer nödvändiggör användning av mer än en markör, och det finns variation i kornighet och storlek på celler vid analys cellsuspensioner. Markörerna och beskrivningar som visas i figurerna 1-3 är bra alternativ för representativa celltyper i odling. Det kan vara svårt att skilja de olika celltyper, särskilt efter dag 5. Därför är det viktigt att använda andra markörer som CD115 och F4 / 80.
Med tanke på expansionen av benmärgsceller under vidhäftningsfria betingelser, kan makrofagdifferentiering förlängas och odifferentierade monocyter kan ackumuleras. Makrofagdifferentiering indikerar förorening; emellertid, due till sin vidhäftande naturen även på extremt låg fästodlingsytor, kan de lätt kastas medan endast skörda icke vidhäftande celler från kultur. I tidigare experiment 1,3, har kontamine av makrofager inte lett till allvarliga kliniska biverkningar. Histologisk upparbetning av organ och muskler i möss efter celltransplantation visade att injicerade makrofager assimileras i organ som mjälte, lever eller lunga. Assimilering av makrofager i dessa organ visade några observer kliniska effekter hos möss. Den molekylära mekanismen utlöses av dessa makrofager kan vara intressanta frågor för ytterligare undersökningar.
Monocyter samt makrofager påverkar arteriogenes i perifer arteriell sjukdom, särskilt när den tillämpas systemiskt. Kliniska biverkningar såsom emboli eller massiv systemisk inflammation kunde inte observeras ens efter injektion av mer än 2,5 miljoner monocyter, men dessa celler kan utlösa inflammation och potentially orsaka allvarliga systemiska effekter. I försök på människa, dessa effekter är sannolikt har klinisk betydelse. Den utlösning av arteriogenes kan påverka tumörtillväxt eller diabetesretinopati, och sådana möjliga systemiska effekter av injicerade celllösningar bör undersökas i framtida studier.
Tidigare publikationer 9 beskriver skillnader mellan egenskaper perifera blod- och benmärgsderiverade monocyter, som förklarar varför egenskaper monocyter från benmärg kan skilja sig från de som isolerats från perifera blodceller.
Metoden för isolering är av kliniskt intresse samt. Ritning blod i stället för att utvinna human benmärg är mer praktiskt i samband med klinisk medicin. Det är viktigt att ta hand om djurens välbefinnande och att tillämpa smärtlindring om det behövs. För intravenösa injektioner, är det kritiskt att öva hantering av både djuret och sprutan samtidigt. Om en enda animal genomgår flera injektioner, kvaliteten på venerna och huden på svansen drabbas.
Trots dessa nackdelar, är denna metod mycket användbar för att studera uppträdande och egenskaper hos monocyter. Experiment i området för ateroskleros, immunologi eller inflammation kan dra nytta av denna metod. Endast 30 min krävs från utvinning av benmärg till sådd av celler på 6 brunnar extremt låg fäst ytplattoma. Etiska problem minimeras, eftersom den höga avkastningen av detta protokoll minimerar antalet djur som krävs som celldonatorer. Denna nya metod kommer att vara till hjälp för många studier med monocyter.
Vi har fokuserat på terapeutisk förstärkning av säkerheter kärltillväxt genom transplantation av monocyter. Den multifaktoriella karaktären av denna process kan förklara varför enskilda faktorn metoder för förstärkning av arteriogenes har genererat blandade resultat 13,14. Detta har lett till att iVestigation av cellbaserade terapier. Autolog benmärgsderiverade stamceller och progenitorceller har identifierats som potentiella celler för transplantation, men endast måttliga kliniska fördelar har rapporterats 15. Förutom forskning om dosering, isoleringsmetoder, och administrationsvägar, fortfarande behövs ytterligare forskning för att bestämma den optimala celltyp. En nackdel med autolog celltransplantation kan vara deras oförmåga att aktivera det medfödda och / eller adaptiva immunsvaret, och båda är kritiska för arteriogenes. Ökande lokal inflammation kan representera den bästa stimulansen för arteriogenes 16.
Intravenös injektion av monocyter är en vanlig metod för celltransplantation inom musmodeller om systemisk läkemedelsleverans önskas. På grund av systemiska effekter, kan biverkningar förekomma också. Se till att venen är riktad för injektion. Det är vanligt att blanda ihop artärer och vener, speciellt när injektions kraftigt pigmenterad mice. Arteriell injektion kan orsaka embolier, som leder till systemfrågor i omlopp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
- Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
- Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
- Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
- Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
- Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
- Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
- Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
