Vastus lateralis की बायोप्सी, शुद्ध माइटोकॉन्ड्रिया की तैयारी, और respirometric प्रोफाइलिंग के लिए तरीके वर्णित हैं। छोटे मांसपेशियों की मात्रा का उपयोग नैदानिक अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए इस तकनीक का उपयुक्त बनाता है।
पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा सामान्यतः इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला समारोह जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम एक बाह्य प्रवाह (एक्सएफ) विश्लेषक का उपयोग एक, मानव vastus lateralis के नमूने प्राप्त करने के कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों की न्यूनतम मात्रा से माइटोकॉन्ड्रिया के लिए अलग तरीका है, और प्लेट आधारित respirometric रूपरेखा का वर्णन है। 1.0, 2.5 और माइटोकॉन्ड्रिया के 5.0 माइक्रोग्राम प्रति का उपयोग कर प्राप्त respirometric प्रोफाइल के तुलना 1.0 माइक्रोग्राम प्रति श्वसन मापने के लिए पर्याप्त है कि संकेत मिलता है और 5.0 माइक्रोग्राम प्रति मानक त्रुटियों की तुलना के आधार पर सबसे अनुरूप परिणाम प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर कॉक्स चतुर्थ और गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ऊतक मार्कर GAPDH के लिए पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण इस प्रोटोकॉल का उपयोग सीमित गैर माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण है कि वहाँ से संकेत मिलता है। मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में छोटा रूप में 20 मिलीग्राम में mitochondrial respirometry अध्ययन करने की क्षमता उपयोगकर्ताओं नैदानिक में कई अध्ययन समापन के लिए व्यक्तिगत बायोप्सी का उपयोग करने की अनुमति देता हैअनुसंधान परियोजनाएं।
माइटोकॉन्ड्रिया कोशिका में प्राथमिक ऊर्जा उत्पादन साइटों रहे हैं और उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में भी इस तरह के हृदय रोग, अल्जाइमर रोग, मधुमेह, कैंसर, और मोटापे के रूप में विभिन्न आयु संबंधी विकारों है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ईटीसी) समारोह का सीधा विश्लेषण प्रदान करता है और mitochondrial जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ और स्वास्थ्य और रोग में अपनी भूमिका के लिए काफी योगदान दिया है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति मानव विषयों से प्राप्त कंकाल की मांसपेशी ऊतक बायोप्सी से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के respirometric विश्लेषण की अनुमति के लिए अनुकूलित किया गया है आदि सब्सट्रेट परिवहन, एटीपी synthase गतिविधि, प्रोटॉन रिसाव, जैसे बायोइनरजेटिक्स के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस पांडुलिपि में वर्णित बायोप्सी प्रोटोकॉल पिछले 12 वर्षों के लिए हमारे कर्मचारियों द्वारा उपयोग किया गया है। हमारे समूह, विभिन्न उम्र के वयस्कों पर 700 से अधिक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया है90 साल की उम्र तक है, और किसी भी प्रतिकूल सुरक्षा के मुद्दों के बिना विभिन्न पुरानी बीमारी शर्तों के साथ। इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण पहलू यह विशेष रूप से इस तरह नैदानिक अनुसंधान अध्ययन में इसके उपयोग को सुविधाजनक बनाने, ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग करने के लिए बनाया जाता है।
विभिन्न प्रोटोकॉल माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए विकसित किया गया है। फर्नांडीज-Vizarra एट अल। 1,2 विभिन्न चूहे के ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से संवर्धित कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। गार्सिया-Cazarin एट अल। 3 चूहा और माउस से कंकाल की मांसपेशियों से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए एक विधि की सूचना है। चूहे के मस्तिष्क से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए एक विधि भी इग्लेसियस-गोंजालेस एट अल। 4 सकल द्वारा सूचित किया गया है, एट अल। 5 barocycler और / या पीसीटी तकलीफ का उपयोग कर माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने की एक विधि की सूचना दी। हाल ही में, Franko एट अल। 6 विरोधी का उपयोग करते हुए अत्यधिक संवर्धित माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने की एक विधि सूचना दी-TOM22 चुंबकीय मोती।
इन प्रोटोकॉल उत्कृष्ट परिणाम उपज है, जबकि ऊतक आकार की आवश्यकताओं को इस पांडुलिपि में वर्णित विधि की तुलना में अधिक हैं। उदाहरण के लिए, सकल एट अल। 5 gastrocnemius मांसपेशियों की 1.5-1.8 जी, और गुर्दे ऊतक के बारे में 2 जी का इस्तेमाल किया। इसी तरह, फ्रेंको एट अल। 6 500 मिलीग्राम माउस जिगर ऊतक का इस्तेमाल किया। हमारे अनुभव से, ठेठ पैदावार कंकाल की मांसपेशी (vastus lateralis) के percutaneous सुई बायोप्सी से उम्मीद की जा करने के लिए 100-200 मिलीग्राम से लेकर। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग मांसपेशियों के ऊतकों की 20-50 मिलीग्राम में mitochondrial समारोह का आकलन करने की क्षमता अन्य आणविक जीव विज्ञान के प्रयोगों में भविष्य में इस्तेमाल के लिए बायोप्सी प्रति और दुकान के नमूने के लिए कई आकलन प्रदर्शन करने के लिए उपयोगकर्ताओं को अनुमति देता है। इस नैदानिक अनुसंधान और नमूने के मेहनती उपयोग की आवश्यकता होती है कि अन्य अध्ययन में एक महत्वपूर्ण विशेषता है। यह पहले से जमे हुए माइटोकॉन्ड्रिया oute के लिए युग्मित श्वसन के कारण अध्ययन के लिए अच्छा नहीं कर रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिएmitochondrial झिल्ली को नुकसान और साइटोक्रोम ग गतिविधि का नुकसान आर। हमारे विधि अनुकूलित और चैपल और पेरी 7 द्वारा प्रकाशित विधि से संशोधित किया गया है।
इस पांडुलिपि में वर्णित विधियों का उपयोग करना, हम हाल ही में मानव vastus से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के respirometric प्रोफ़ाइल सीधे चाल की गति के रूप में 8 मापा शारीरिक क्षमता, साथ जोड़ा जाता है lateralis कि सूचना दी है।
पृथक माइटोकॉन्ड्रिया अक्सर सब्सट्रेट परिवहन और TCA चक्र समारोह सहित आदि समारोह की भूमिका है, साथ ही अन्य माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधियों की जांच कि पढ़ाई में उपयोग किया जाता है। अलग अंगों का उपयोग कर Respirometric assays के ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के बुनियादी प्रक्रियाओं और आदि के आंतरिक गुणों का सीधा परीक्षा की अनुमति पूरे कोशिकाओं या permeabilized मांसपेशी फाइबर की तुलना में अलग माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा अपेक्षाकृत आसान डेटा व्याख्या के फायदे और mitochondrial जन / जीवजनन में गैर-माइटोकॉन्ड्रियल प्रक्रियाओं या परिवर्तन से "हस्तक्षेप" का अभाव है। डेटा का सामान्यीकरण जिससे नमूनों के बीच माइटोकॉन्ड्रिया का सीधा पार तुलना की इजाजत दी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन सामग्री पर आधारित है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के Respirometric रूपरेखा अध्ययन का उद्देश्य अंतर्निहित तंत्र और आदि जैसे घटक के रूप में विशिष्ट लक्ष्यों की पहचान निर्धारित करने के लिए जब एक पसंदीदा तरीका हैएस / परिसरों, या माइटोकॉन्ड्रियल परिवहन तंत्र।
छोटे ऊतकों के नमूनों से पेशी बायोप्सी और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल है वर्णित है। हाथ Dounce homogenizers संचालित बनाम इस विधि की वजह से एक स्वचालित homogenizer का उपयोग करने के लिए उपयोगकर्ताओं के बीच प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम पैदावार। माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव मांसपेशियों के ऊतकों के रूप में छोटा रूप में 20 मिलीग्राम के साथ किया जा सकता है। इस नमूने का आकार से प्राप्त किया जा सकता है कि पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की राशि आगे आणविक विश्लेषण के लिए अन्य प्रयोगों और भंडारण के लिए अधिशेष माइटोकॉन्ड्रिया जाते वक्त Seahorse थाली आधारित respirometry चलाने के लिए पर्याप्त है। यह इस विधि माइटोकॉन्ड्रिया की भी छोटी मात्रा (प्रति अच्छी तरह से 1-2 माइक्रोग्राम प्रति) का इस्तेमाल किया जा सकता है, जहां एक्सएफ 96, करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है कि उल्लेख किया जा सकता है।
अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के लिए कई प्रोटोकॉल प्रारंभिक ऊतक विघटन के लिए Dounce homogenizers पर भरोसा करते हैं। इस पद्धति का एक दोष यह है कि हाथ पर प्रारंभिक ऊतक का स्वभाव हैhomogenization के। homogenizer में मूसल की शक्ति और गति ऑपरेटरों 6 के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं। यह प्रयोग करने के लिए प्रयोग भिन्नता है, साथ ही प्रयोगशाला करने वाली प्रयोगशाला विभिन्नता में परिणाम है, और प्रयोगों के बीच डेटा की तुलना में कठिनाई की ओर जाता है सकते हैं। प्रतिभागियों से डेटा आम तौर पर इलाज से पहले और बाद में, और संभवतः कई स्थलों पर, अलग समय बिंदुओं पर एकत्र कर रहे हैं जब यह मानव हस्तक्षेप के अध्ययन में विशेष चिंता का विषय है। हम सीमित व्यक्ति-से-व्यक्ति भिन्नता के साथ और अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम है कि पैदावार अधिक सुसंगत दृष्टिकोण के लिए एक स्वचालित homogenizer का उपयोग करें। तैयारी की गति भी एक ही समय में कई नमूने से निपटने के लिए उपयुक्त इस दृष्टिकोण बनाता है। आमतौर पर, अप करने के लिए तीन प्रयोगों में एक ही दिन में किया जा सकता है।
यहाँ वर्णित तकनीक की क्षमता सीमाओं पृथक organelles के उपयोग और एक प्लेट आधारित प्रारूप के उपयोग से उत्पन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, पिकार्ड एट अल। दानव हैपृथक माइटोकॉन्ड्रिया permeabilized myofibers में बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया के उन लोगों से मौलिक रूप से अलग है कि कार्यात्मक विशेषताओं के अधिकारी उस strated। वे माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव तकनीक ऐसे अधिक से अधिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन में 13 के साथ permeabilized myofibers की तुलना में काफी वृद्धि हुई है रेसकोर्स रोड के रूप में बदल bioenergetic समारोह में परिणाम है कि प्रस्ताव रखा। Permeabilized मांसपेशी फाइबर की तुलना में, माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव अब तैयारी के समय की आवश्यकता है। इसके अलावा, सेलुलर सामग्री के नुकसान के शारीरिक प्रासंगिकता, पूरे कोशिकाओं और भी permeabilized फाइबर में बनाए रखा है कि कुछ घटता है। वर्णित तकनीक परमिट के साथ थाली-आधारित respirometry के उपयोग के प्रति नमूना रन दोहराने। हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया में अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे का पालन करना होगा। यह विन्यास अपने सामान्य वातावरण से अलग है और कार्यात्मक विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग, वहाँई अभी भी माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी में endoplasmic जालिका (ईआर) से संदूषण हो सकता है। ईआर संदूषण में मतभेद माइटोकॉन्ड्रियल उपज और प्रभाव के परिणाम के निर्धारण को प्रभावित कर सकता है।
अंत में, इस अध्ययन में इस प्रक्रिया का उपयोग कर ऊतकों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया कार्यात्मक रूप से सक्रिय हैं और अध्ययन / कंकाल की मांसपेशी नमूनों की न्यूनतम राशि से उच्च गुणवत्ता वाले पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पुष्टि की है कि डेटा प्रस्तुत करता है। इस पद्धति का लाभ यह है कि: मैं) यह कंकाल पेशी के न्यूनतम मात्रा से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए संभव है, द्वितीय) प्रक्रिया, तृतीय) थाली आधारित तकनीक के साथ, यह एक ही समय में कई नमूने को चलाने के लिए संभव है, जल्दी है और चतुर्थ) नमूना भंडारण और अन्य आणविक जैविक जांच के लिए bioenergetic परख के बाद पर्याप्त अधिशेष ऊतक और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया है।
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Equipment | ||
Name of the Equipment | Company | |
Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
60cc syringe | Fisher Scientific | |
96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
Consumables | ||
Name | Company | Catalog Number |
XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
100867-100 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |