Metoder til biopsi af vastus lateralis, udarbejdelse af renset mitokondrier, og respirometrisk profilering beskrives. Brugen af små muskler volumen gør denne teknik er egnet til klinisk forskning applikationer.
Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier er almindeligt anvendt til at undersøge elektron transportkæde funktion. Vi beskriver en fremgangsmåde til opnåelse af prøver af humane vastus lateralis, isolering mitokondrier fra minimale mængder af skeletmuskelvæv og plade baseret respirometrisk profilering ved anvendelse af en ekstracellulær flux (XF) analysator. Sammenligning af respirometriske profiler fremstillet ved hjælp 1,0, 2,5 og 5,0 ug mitokondrier viser, at 1,0 ug er tilstrækkelig til at måle respiration og at 5,0 ug giver mest konsistente resultater baseret på en sammenligning af standard fejl. Western blot analyse af isolerede mitokondrier for mitokondrie markør COX IV og ikke-mitokondrie væv markør GAPDH indikerer, at der er begrænset ikke-mitokondrie forurening ved hjælp af denne protokol. Evnen til at studere mitokondriel respirometri i så lidt som 20 mg muskelvæv giver brugerne mulighed for at udnytte de enkelte biopsier for flere studier endepunkter i kliniskforskningsprojekter.
Mitokondrier er de primære energiproduktion produktionssteder i cellen og har vigtige roller i aldring samt forskellige aldersrelaterede lidelser, såsom hjerte-kar-sygdom, Alzheimers sygdom, diabetes, kræft, og fedme. Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier giver direkte analyse af elektron transportkæden (ETC) funktion og har bidraget væsentligt til vores forståelse af mitokondrie biologi og dens rolle i sundhed og sygdom. Isolerede mitokondrier bruges til at undersøge forskellige aspekter af bioenergetik som substrat transport ATP-syntase-aktivitet, proton lækage etc. er beskrevet i dette manuskript metode er optimeret til at tillade respirometrisk analyse af mitokondrier isoleret fra skeletmuskelvæv biopsier opnået fra humane individer. Den biopsi protokollen beskrevet i dette manuskript er blevet udnyttet af vores personale i de sidste 12 år. Vores gruppe har udført over 700 procedurer på voksne i forskellige aldre,op til 90 år, og med forskellige kroniske sygdomstilstande uden nogen negative sikkerhedsspørgsmål. Et centralt aspekt af denne protokol er, at det er specielt designet til at udnytte minimale mængder af væv, hvilket letter dens anvendelse i kliniske forskningsundersøgelser.
Forskellige protokoller er blevet udviklet til at isolere mitokondrier. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 beskrives en fremgangsmåde til isolering af mitokondrier fra forskellige rottevæv samt dyrkede celler. Garcia-Cazarin et al. 3 har rapporteret en metode til isolering af mitokondrier fra skeletmuskler fra rotter og mus. En fremgangsmåde til isolering af mitokondrier fra rottehjerne er også blevet rapporteret af Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross, et al. 5 rapporteret en fremgangsmåde til isolering af mitokondrier hjælp af barocycler og / eller PCT shredder. For nylig Franko et al. 6 rapporteret en fremgangsmåde til isolering af højt beriget mitokondrier anvendelse af anti-TOM22 Magnetiske perler.
Mens disse protokoller give fremragende resultater, er høje krav væv størrelse i forhold til den, der er beskrevet i dette manuskript metode. For eksempel Gross et al. 5 anvendes 1,5-1,8 g musculus gastrocnemius og ca. 2 g af nyrevævet. Tilsvarende Franco et al. 6 anvendes 500 mg mus levervæv. Fra vores erfaring, at typiske udbytter kan forventes af perkutan nål biopsi af skeletmuskulaturen (vastus lateralis) spænder fra 100-200 mg. Evnen til at vurdere mitokondriefunktion i 20-50 mg af muskelvæv under anvendelse af protokollen beskrevet her tillader brugerne at udføre flere vurderinger pr biopsi og til at gemme prøver til senere brug i andre molekylærbiologiske eksperimenter. Dette er et afgørende træk i klinisk forskning og andre undersøgelser, der kræver omhyggelig brug af prøver. Det skal bemærkes, at tidligere frosne mitokondrier er ikke godt for at studere koblet respiration grund outer mitochondriebeskadigelse membran og tab af cytochrom C aktivitet. Vores metode er blevet tilpasset og ændret fra metoden udgivet af Chappell og Perry 7.
Ved hjælp af metoderne beskrevet i dette manuskript, har vi for nylig rapporteret, at respirometrisk profil mitokondrier isoleret fra human Vastus lateralis er direkte korreleret med fysisk formåen, målt som gangart hastighed 8.
Isolerede mitokondrier er ofte anvendt i studier, der undersøger rolle ETC funktion, samt andre mitochondriale aktiviteter, herunder substrat transport og TCA cyklus funktion. Respirometriske assays under anvendelse af isolerede organeller tillader direkte undersøgelse af grundlæggende processer for oxidativ phosphorylering og iboende egenskaber ETC. Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier i sammenligning med hele celler eller permeabiliserede muskelfibre har fordelene ved forholdsvis let fortolkning af data og den manglende "indblanding" fra ikke-mitokondrie processer eller ændringer i mitokondrie masse / biogenese. Normalisering af data er baseret på mitokondrie proteinindhold, hvorved enkel cross-sammenligning af mitokondrier mellem prøverne. Respirometrisk profilering af isolerede mitokondrier er en foretrukken fremgangsmåde, når målet med undersøgelsen er at bestemme underliggende mekanismer og identificere specifikke mål såsom ETC komponents / komplekser eller mitokondrie transportmekanismer.
Beskrevet er en protokol til muskel biopsi og isolering af funktionel mitokondrier fra små vævsprøver. Denne metode giver reproducerbare resultater mellem brugere på grund af udnyttelse af en automatiseret homogenisator versus håndbetjent dounce homogenisatorer. Isolering af mitochondrier kan udføres med så lidt som 20 mg af muskelvæv. Mængden af isolerede mitokondrier, der kan opnås fra denne stikprøve er tilstrækkelig til at køre Seahorse plade-baserede respirometri mens overskydende mitokondrier til andre eksperimenter og opbevaring for yderligere molekylære analyser. Det kan bemærkes, at denne metode kan oversættes til XF 96, hvor selv mindre mængder af mitokondrier kan anvendes (1-2 ug per brønd).
Adskillige protokoller til isolering mitokondrier afhængige dounce homogenizers for første væv forstyrrelser. En ulempe ved denne metode er praktisk karakter af den oprindelige vævhomogenisering. Den kraft og hastighed støder i homogenisatoren kan variere betydeligt mellem operatører 6. Dette kan resultere i forsøg-til-forsøg variation samt lab-to-lab variation, og fører til vanskeligheder med at sammenligne data mellem eksperimenter. Dette er af særlig bekymring i interventionsstudier humane når data fra deltagerne samles på separate tidspunkter, typisk før og efter behandling, og der kan blive flere steder. Vi bruger en automatiseret homogenisator for en mere sammenhængende tilgang, der giver mere reproducerbare resultater med begrænset fra person til person variation. Hastigheden af præparatet også gør denne fremgangsmåde egnet til håndtering af flere prøver samtidigt. Typisk kan op til tre forsøg udføres i en enkelt dag.
Potentielle begrænsninger af teknikken beskrevet her stammer fra anvendelsen af isolerede organeller og anvendelse af en plade-baseret format. For eksempel Picard et al. har dæmonstrated at isolerede mitokondrier har funktionelle egenskaber, der adskiller sig fundamentalt fra de intakte mitokondrier i permeabiliserede myofibre. De foreslog, at mitokondrielle isoleringsteknikker resulterer i ændret bioenergetic funktion, såsom væsentligt forøget RCR forhold til permeabiliserede myofibre ledsaget af en større reaktiv ilt arter produktion 13. Sammenlignet med permeabiliserede muskelfibre, er isolering af mitokondrier kræve længere forberedelsestid. Også tab af cellulære indhold formindsker fysiologiske relevans, noget der er bevaret i hele celler og endda permeabiliserede fibre. Anvendelsen af plade-baserede respirometri med de beskrevne teknik tillader replikere kørsler pr prøve. Dog skal mitokondrier klæbe til bunden af hver brønd. Denne konfiguration er forskellig fra deres normale miljø og kan påvirke funktionelle egenskaber. Desuden skal det bemærkes, at ved hjælp af denne protokol for mitokondrie isolation ther,e kan stadig være forurening fra endoplasmatiske reticulum (ER) i den mitokondriske præparat. Forskelle i ER forurening kan påvirke bestemmelsen af mitokondrielle udbytte og påvirke resultatet.
Afslutningsvis denne undersøgelse præsenterer data, der bekræfter, at mitokondrier isoleret fra væv ved hjælp af denne procedure er funktionelt aktive og kan bruges til undersøgelser / applikationer, der kræver høj kvalitet isolerede mitokondrier fra minimal mængde af skeletmuskulaturen prøver. Fordelen ved denne metode er, at: i) det er muligt at isolere mitokondrier fra minimale mængder af skeletmuskulatur, ii) fremgangsmåden er hurtig, iii) med pladen baseret teknologi, er det muligt at køre flere prøver på samme tid, og iv) der er nok overskydende væv og isolerede mitokondrier efter bioenergetic assay for prøve opbevaring og andre molekylærbiologiske undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.
Equipment | ||
Name of the Equipment | Company | |
Homogenizer Bio-Gen PRO200 | BioExpress | |
Eppendorf Centrifuge 5804 R | Fisher Scientific | |
Deepwell late Rotor | Fisher Scientific | |
6mm University College Hospital Needle | Cadence | |
60cc syringe | Fisher Scientific | |
96-well plate reader | Tecan (Genios-basic) | |
Seahorse XF 24-3 analyzer | Seahorse Biosciences, Inc. | |
Protein gel system | Life Technologies (Invitrogen) | |
Kodak Gel Logic 112 | Carestream Health, Inc | |
Kodak camera assembly | Carestream Health, Inc | |
Consumables | ||
Name | Company | Catalog Number |
XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 100850-001 |
100867-100 | ||
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich Co | 221473 |
Hydrochloric acid (HCl) | Acros | 12421-0010 |
Dulbecco's Phosphate buffered saline | Lonza | 17-512F |
Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P333 |
MOPS | Fisher Scientific | BP308 |
EDTA | Fisher Scientific | BP118 |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich Co | M7506 |
ATP | Sigma-Aldrich Co | A9187 |
Fatty acid-free BSA | Calbiochem | 126575 |
Sucrose | Sigma-Aldrich Co | S0389 |
Bacterial proteinase | Sigma-Aldrich Co | P-8038 |
D-Mannitol | Sigma-Aldrich Co | M9546 |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich Co | M9272 |
HEPES | Sigma-Aldrich Co | H3784 |
EGTA | Sigma-Aldrich Co | E3889 |
BCA protein assay kit | Sigma-Aldrich Co | PI23227 |
Succinic Acid* | Sigma-Aldrich Co | S3674 |
Pyruvic acid* | Sigma-Aldrich Co | P5280 |
Malic acid* | Sigma-Aldrich Co | 2288 |
ADP(K+ salt)* | Sigma-Aldrich Co | A5285 |
XF Cell mito stress test kit | Seahorse Biosciences | 101706 |
Tween-20 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-29113 |
NuPAGE 12% Bis-Tris Gel | Life Technologies (Invitrogen) | NP0343BOX |
Immobilin Transfer Membranes (0.45um) | Millipore | IPVH20200 |
MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml | Life Technologies (Invitrogen) | NP0001 |
NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter | Life Technologies (Invitrogen) | NP0006-1 |
Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin) | Abcam | ab14734 |
Primary antibodies (mAB to GAPDH) | Abcam | ab9484 |
Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF822E001EA |
Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled | PerkinElmer | NEF812E001EA |
*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only |