Introduction
ويقدر أن نصف سكان الولايات المتحدة يعاني من كسر في سن 65 1. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من كسور المعالجة جراحيا، تشمل 500،000 إجراءات استخدام الكسب غير المشروع العظام 2 و من المتوقع أن يرتفع مع شيخوخة السكان على نحو متزايد 3 هذا العدد . على الرغم من أن العظام هي واحدة من عدد قليل من الأجهزة التي لديها القدرة على شفاء تماما بدون تندب، هناك حالات حيث فشل عملية 3،4. تبعا للظروف ونوعية العلاج، 2-30٪ من كسور العظام الطويلة تفشل، مما أدى إلى عدم النقابات 3،5. في حين لا يزال هناك بعض الجدل حول تعريف، فصال كاذب، وإصابات حرجة الحجم أو غير نقابية العظام تشير بصفة عامة إلى إصابة لا يلتئم على مدى عمر الطبيعي لهذا الموضوع (6). لأغراض تجريبية، هو تقصير هذه المدة إلى متوسط الوقت اللازم للشفاء التام من متوسط الحجم إصابة العظام. تحدث الآفات العظام غير نقابية لالأسطواناتأسباب erous، ولكن العوامل الرئيسية وتشمل الصدمة الشديدة مما أدى إلى وجود فجوة خطيرة الحجم، والعدوى، وضعف الأوعية الدموية، واستخدام التبغ، أو قدرة osteoregenerative تحول دون ذلك بسبب المرض أو العمر 7. حتى لو يتم التعامل غير النقابات بنجاح، فإنه يمكن أن تكلف ما يزيد على 60،000 دولار في الإجراء، وهذا يتوقف على نوع الإصابة والمناهج المستخدمة 8.
وفي الحالات المعتدلة، وتوظيف ذاتي ترقيع العظام. وتتضمن هذه الاستراتيجية استرداد العظام من موقع المانحة وغرس في موقع الإصابة. في حين أن هذا النهج هو فعالة للغاية، وحجم متاح العظام المستمدة المانحة محدود وينطوي على إجراء عملية جراحية إضافية، مما يؤدي إلى ألم مستمر في العديد من المرضى 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، فإن فعالية من الكسب غير المشروع العظام ذاتي يعتمد على صحة المريض. هي بدائل العظام مصنوعة من مواد تركيبية أو معالجتها العظام جثي متوافرة بكثرة 11-13، لكنها هكتارلقد قيود كبيرة، بما في ذلك سوء خصائص التصاق الخلية المضيفة، وانخفاض osteoconductivity، وإمكانية الرفض المناعي 14. ولذلك هناك حاجة ملحة لتقنيات تجديد العظام التي هي آمنة وفعالة ومتاحة على نطاق واسع.
لدينا القدرة على تحسين استراتيجيات التجدد العظام تعتمد بشكل كبير على القدرة على تقليد الصدمة العظام خطيرة في حيوانات التجارب، ولكن الجيل واستقرار الآفات العظام كبيرة يمثل تحديا تقنيا. في معظم الحالات، يتم تحاكي صدمة خطيرة العظام الطويلة تجريبيا من خلال إنشاء الخلل التي لن تلتئم بشكل طبيعي. على الرغم من أنه يمكن أن تختلف مع الأنواع 15، ويتحقق ذلك عن طريق الإزالة الكاملة للشريحة العظام أكبر من 1.5 مرة من قطر العظام المقطع العرضي 16. ثم يستقر العظام مع زرع المعادن للحفاظ على التوجه السليم من حواف كسر والسماح للتنقل. نظرا لصغر حجمها وهشاشةالعظام الطويلة، وإنشاء مثل هذه الآفات في الفئران هم أبعد من قدرات معظم المجموعات البحثية. على هذا النحو، تقتصر نماذج عيب العظام الطويلة للفئران والحيوانات الكبيرة. ومع ذلك، والفئران تحمل مزايا البحثية الهامة في أنها يمكن المعدلة وراثيا وتربيتها كما سلالات خطر المناعية التي لا نرفض الخلايا البشرية والأنسجة.
لالتطبيقات المستندة إلى خلية الإنسان والفئران خطر المناعية جذابة للعمل مع لأنها من الناحية الفسيولوجية تتميز بشكل جيد، وسهلة المنزل، وفعالة من حيث التكلفة، وسهولة تحليلها شعاعيا وتشريحيا. من الأهمية بمكان أن الفئران خطر المناعية لا يرفض الخلايا من مختلف الأنواع بما في ذلك البشر. يسمح صغر حجمها أيضا اختبار أعداد صغيرة جدا من الخلايا أو مجلدات من السقالات التجريبية في تطبيقات العظام. تم الإبلاغ عن عدة نماذج تقويم العظام الفئران التي تحمل درجات مختلفة من الاستقرار العظام 17،18. تلك التنفسيمللي التي تؤدي إلى مستويات عالية جدا من الاستقرار، مثل المثبتات الخارجية وتأمين لوحات تلتئم في الغالب من قبل التحجر داخل الغشاء على الرغم من أن الشفاء غضروفي وقد تم الإبلاغ عن 19. في المقابل، تلك التي تسمح بعض المتناهية الصغر و / أو الحركة الماكرو، مثل تلك التي تستخدم المسامير النخاعية غير المثبتة أو جزئيا ثابتة، وشفاء بشكل عام مع غلبة التحجر غضروفي 20،21. اتحاد تأخر أو عيوب غير نقابية من العظام الطويلة من الصعب بشكل خاص لتحقيق في الفئران بسبب مستوى إضافي من الاستقرار المطلوب. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن عدد من النهج، بما في ذلك دبابيس النخاعية مع المسامير المتشابكة، وتأمين لوحات والمثبتات الخارجية 22. هذه الأنظمة تعمل بشكل جيد عموما، ولكن نظرا تصميم معقد من أنها يمكن أن يكون تحديا تقنيا لتثبيت. على سبيل المثال، جارسيا وآخرون. 23 وضعت على المتشابكة نظام دبوس أنيق للاستخدام في الفئران، ولكن ينطوي على إجراء شقوق في اثنين الموقع مستقلالصورة وتعديل واسع من عظم الفخذ لاستيعاب الدبابيس. وأجريت هذه الإجراءات تحت المجهر تشريح.
هنا، نحن تصف دبوس النخاع الفخذ بسيط مع طوق المركزي تهدف إلى منع إغلاق عجز العظم 3 مم وكذلك ترسيم حواف الأصلية للعيب. في حين دبوس لم يحدد حتى العظم نفسه، وتحجيم دقيق لقطر دبوس والتوسيع من نتائج تجويف النخاع في التدخل كافية للحد من الحركة الالتوائية (الشكل 1). مع اختيار دقيق من العمر الفطرية ونوع الجنس والفئران المتطابقة سلالة، والنتيجة هي تكرار للغاية التصنع غير uniondefect-22 التي يمكن تقييمها بسهولة شعاعيا. وعلاوة على ذلك المناطق ذات الاهتمام يمكن تعريف بتكاثر بعد التصوير المقطعي-حسابها الصغرى (μCT) لقياس دي نوفو تكوين العظام والمعلمات histomorphological. تم نموذج أولي من المسامير في مختبرنا باستخدام أدوات متوفرة بسهولة.
الشكل 1: مبدأ التجريبي ملخص بياني للنموذج الخلل القطعي. يتم استئصاله وسط شريحة 3 ملم من 9-10 ملم عظم الفخذ الفئران جراحيا (يسار). يتم تمرير 3 مم طويل، 19 مقياس أنابيب الصلب الجراحية أكثر من 9 ملم طويلة، 22 G أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ وثابتة بمادة لاصقة في وسط الدقيق (يمين). تم تجهيز دبوس الناتجة في القنوات النخاعية ما تبقى من أجزاء القريبة والبعيدة للعظم الفخذ مع G طوق 19 استبدال جزء 3 ملم من العظم (أدناه، وسط).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لأنثى عارية (نيو / J) الفئران (18-25 غرام، 6 أسابيع) تم الحصول عليها من مختبرات جاكسون. منذ سلالات من الفئران تختلف قليلا من حيث التشريح ومعدل النمو، ونحن ننصح أن تلفيق من الدبابيس هو الأمثل لسلالة ونوع الجنس والسن من المتلقين قبل الزرع في المواد الحية. إذا تم مطابقة بعناية السلالات، وتناسب التداخل بين دبوس ونخاع تجويف هو تكرار للغاية. إجراءات للسكن، والنظام الغذائي وتربية الحيوانات العامة هي خارج نطاق هذا البروتوكول، ولكن تم إيواء جميع الفئران وفقا لدليل السياسات المؤسسية رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (8 الطبعة) والتي وضعتها رعاية الحيوان المؤسسية و اللجنة الاستخدام (IACUC) وقسم الطب المقارن (DCM) في سكوت ومستشفى الأبيض.
1. تصنيع دبابيس
- قطع بطول 9 ملم من 22 G أنابيب تحت الجلد المقاوم للصدأ، ويبلغ طوله 3 ملم من 19 G الأنابيب باستخدام الثقيلة قطع عجلة 23.8 ملم الألياف الزجاجية عززت قطر لتركيب أداة دوارة. استخدام كماشة ذات الرؤوس غرامة صغيرة لشل حركة أنابيب (الشكل 2A، أعلاه). ارتداء حماية العين المناسبة والتعامل مع أداة دوارة مع الرعاية.
- ضع كمية صغيرة (حوالي 10 ميكرولتر) من اصقة cyanoacrylate إلى منتصف 9 ملم رمح. تمرير 3 مم طوق على مدى 9 ملم رمح حتى في الوسط وتطور لتوزيع بالتساوي الغراء بين ذوي الياقات البيضاء ورمح. قياس الأبعاد مع زوج من الفرجار الرقمية ومقارنتها مع الشكل 1. السماح لوضع لا يقل عن 15 ساعة (الشكل 2A، وسط).
- استخدام 220 الحصباء المشبعة الصنفرة القرص لإزالة نتوءات والغراء الزائد.
- باستخدام أداة دوارة، تلميع دبوس باستخدام قرص تلميع شعر.
- شطف مع الماء منزوع الأيونات وجافة مع الضواغطالهواء ssed.
- اختبار النزاهة من خلال وضع 19 G إبرة حادة تحت الجلد على رمح من دبوس المصنوعة حديثا ودفع ضد ذوي الياقات البيضاء. تأكد من أن طوق يمكن أن تقاوم حوالي 25 غراما من وزنه.
- شطف دبوس في الفوسفات العقيمة التي تمت تصفيتها مخزنة المالحة (الشكل 2B، أعلى). ضمان رمح من دبوس يناسب بشكل مريح في تجويف النخاع الفخذ مع تدفق طوق ضد حواف قطع العظام (الشكل 2C). تشكيلات مختلفة النموذج لأغراض محددة من الدراسة والمتلقي (الشكل 2D). تأكد من أن ينتهي من دبوس تخترق العظام تربيقي من diaphysis وذلك لتحقيق أقصى قدر من تثبيت وتحسين تناسب تدخل (الشكل 2E).
ملاحظة: من المستحسن أن يصلح يتم اختبار على عينات العظام قبل زرع في الفئران الحية (مثل الشكل 2C). - استخدام 4 مم لكمة خزعة القاطع لخفض اسطوانةمن ورقة سميكة 5 ملم من الجيلاتين الإسفنج الجراحية. استخدام مشرط لخفض الاسطوانة إلى 3 ملم طول وتمرير إبرة تحت الجلد 20 G على طول الاسطوانة لتوليد ثقب (الشكل 2A، أدناه).
ملاحظة: لقد وجدنا أن المواقع من الجيلاتين أو الكولاجين سقالة في موقع الخلل يحسن الاحتفاظ الخلية ويدفع النمو الطولي على طول محور العظام. - تمرير اسطوانة رغوة الجيلاتين على دبوس وتتماشى مع ذوي الياقات البيضاء (الشكل 2B، وسط) والأوتوكلاف على دورة الجافة في 120 ° C في 15 رطل. سوف الرغوة الجيلاتين الجافة وتلقي بظلالها في اللون (الشكل 2B، أدناه).
2. تقنية جراحية
ملاحظة: يتم كتابة الإجراء التالي مراقبة جميع المبادئ التوجيهية التي وضعتها دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (8 الطبعة). يرجى مراعاة جميع السياسات إضافيةالتي وضعتها IACUC المحلي وضمان وجود بروتوكول استخدام الحيواني وافق IACUC (أو ما يعادلها) في المركز قبل الشروع في الأقسام التالية.
الشكل (3): الأدوات الجراحية. (A) عدة الجراحية. الدقيقة الحفر (1)، وقطع عجلة (2)، خياطة للامتصاص (3)، خياطة الخارجية (4)، شفرات المشرط (5)، والتعامل مع مشرط (6)، ودبابيس النخاعية العقيمة ملفوفة في احباط (7)، النخاع قياس عمق شكل جعلت أنابيب تحت الجلد (8)، ملقط الانف الدقيقة (9)، الجرذان ملقط الأسنان (10)، والإبر التوسيع حادة (11)، والسائقين الإبرة (12)، المرقأة الصغيرة (13)، مقص الدقيقة (14)، مصعد السمحاق (15)، ملقط تعديل كيرن (16) (B): التعديلات اللازمة لإنتاج الطراز كيرن العظام السيطرة على الفئران.
- اختر غرفة الجراحية الإجراء أو مختبر نظيفة مع باب محكمة السد ولا من خلال حركة المرور. تطهير والسطحية عمل مناسبةالبريد بمطهر نظافة مقرها الرباعية الصف السريري.
- في حين يرتدي قفازات معقمة المتاح ورداء، وإنشاء حقل معقمة حوالي 60 × 90 سم 2 على سطح العمل مطهرة مع ستائر القماش تعقيمها.
ملاحظة: من المستحسن أن يكون مساعدا إزالة التغليف الخارجي وتقديم المواد المعقمة للمحقق إقامة هذا المجال. - وضع وسادة التدفئة مطهرة لتركيب الماء الدافئ إعادة دائري على وثنى، وتغطي مع ستائر القابل للتصرف العقيمة. تدفئة التعقيم حبة إلى درجة حرارة التشغيل (250-265 ° C، وهذا يستغرق فترة تصل إلى 30 دقيقة).
- على حقل معقمة، وترتيب عدة الجراحية (الشكل 3A) لتوفير سهولة الوصول إلى كافة المكونات. أيضا، وتوفير معقم القطن الشاش (2 × 2 بوصة 2)، معقمة Q-نصائح، وعاء من الصلب معقم (500 مل) التي تحتوي على محلول ملحي معقم (0.9٪ ث / ت) تطبيقها، والكلورهيكسيدين مطهر / الآيزوبروبيل الجراحي الكحول.
- تجميع صغيرةوحدة التخدير الحيوان القادمة إلى الميدان العقيمة مع غرفة الاستقراء والتجمع الأنف مخروط وفقا للتوجيه البيطري ودليل المستخدم. استخدام الأكسجين الصف السريري كما إمدادات الغاز والأيزوفلورين، USP.
الشكل 4: إجراء العمليات الجراحية. (AC) نهج والتعرض لعظم الفخذ. (DE) الارتفاع والتخفيضات. (FK) التوسيع والتحجيم من القنوات النخاعية.
الشكل 5: إجراء العمليات الجراحية. (AB) تركيب دبوس. (CD) اختتام. (E) الصورة النموذجية من وضعه بشكل صحيح دبوس 24 ساعة بعد الجراحة.
- ضع الماوس في غرفة تحريض النظام التخدير وحد ذاتهار الإخراج إلى 2 L دقيقة -1 O 2 وتركيز الأيزوفلورين إلى 3٪ (ت / ت).
- تأكد من أن الفأر هو فاقد الوعي في حدود 1 دقيقة. رفع تركيز إلى 4٪ (ت / ت) إذا لزم الأمر. إزالة الماوس، ومكان على حقل معقمة مع لوحة التدفئة وضعه تحت وتطبيق مخروط الأنف. نقل تتدفق إلى مخروط، ويقلل من الأيزوفلورين إلى 2.5٪، والانتظار لمدة 20 ثانية أخرى، واختبار لطائرة الجراحية كافية وفقا لسياسة مؤسسية. عادة، عدم وجود رد فعل الأطراف الخلفية عند الضغط بلطف كافية لتحديد التخدير المناسب.
- خلال العملية برمتها، ويكون لها رصد مساعد للتنفس منتظم قوي وتلوين وردي من الأطراف ومنطقة الفم لضمان مستوى مناسب من الأوكسجين بينما اللاوعي. ضبط التخدير وفقا للتوجيه البيطري والسياسات المؤسسية إذا لزم الأمر. تطبيق معقم الدموع الاصطناعية زيوت التشحيم مرهم (15٪ (ت / ت) الزيوت المعدنية و 83٪ (ت / ت) WHالفازلين الفنار) إلى العينين.
- بدوره الماوس على جانب واحد لدى الأطراف الخلفية التي تواجه صعودا على ثنى المتاح جديدة. إذا لزم الأمر، وإزالة الفراء مع الحلاقة الكهربائية أو كريم إزالة الشعر. مسح الموقع بمحلول ملحي معقم وإزالة ثنى إضافية مع الفراء الزائد. وضع ثنى منوفذة جديدة خلال الماوس وذلك لتغطية جميع أجزاء ولكن بأسره القائمة الخلفية (الشكل 4A) ولكن الحفاظ على ضوء وجهه ومخلب لمراقبة تلوين والتنفس.
- تحديد الغايات القريبة والبعيدة للعظم الفخذ وشق الجلد لمدة 5-10 ملم على طول المحور الطولي (الشكل 4B). فصل طبقة الجلد من اللفافة مع # 15 مشرط، وفضح نهج الجانبي لعظم الفخذ ذات الرأسين الفخذية عبر والوحشية المتسعة. تحديد موقع حيث الحاجز من كلا العضلات تلبية (وهو خط من الأنسجة البيضاء ضد تلوين وردي من العضلات). مع مشرط، تشريح بعناية على طول الحدود بين العضلات حتىعظم الفخذ مرئيا (الشكل 4B).
- تطوير شق مع مصعد السمحاق حادة وذلك لفضح diaphysis بأكمله (الشكل 4C). استخدام المصعد لمواصلة فضح المركزية ثلثي عظم الفخذ مع الحرص على الحفاظ على حزمة الخلفي الوعائية العصبية على الجانب الإنسي (الشكل 4D). كشط بلطف الأنسجة اللينة الخروج من العظام مع مشرط، وجاف مع العقيمة Q-طرف أو ما يعادلها.
- تحديد موقع مركز من عظم الفخذ مع الفرجار إذا لزم الأمر وعلامة مع مشرط معقم أو علامة، ثم وضع علامة 1.5 ملم قريب وبشكل أقصى من المركز. فهم بلطف عظم الفخذ باستخدام زوج من ملقط غرامة الانف الطراز سابقا في أسلوب كيرن لمنع الضغط المفرط على العظام.
ملاحظة: يتم توفير الأبعاد الدقيقة للتعديلات في الشكل 3B. فإنه من المستحسن لاختبار ملقط على عينة الموت الرحيم قبل استخدامها لضمان العظام لن تنهار تحت ضغط تتطلبد لتجميد خلال عدة قطاعات. - باستخدام الحفر غرامة مزودة غرامة الماس حصى المغلفة عجلة القطع (8 ملم قطر × 0.1 ملم العرض)، وجعل أول خطوة من نوعها مع المصعد في مكان لحماية الأنسجة أدناه (الشكل 4E). رفع قطع عظم الفخذ إلى 45 درجة في حين عقد بحزم أقصى من diaphysis، جعل خفض الثاني، وإزالة شريحة 3 مم.
ويوصى حماية الوجه في هذه المرحلة: ملاحظة. - مع العظم يجمد بواسطة ملقط، ماعون من الورق بعناية تجاويف النخاع من كل طرف مع 23 G إبرة تحت الجلد حادة. باستخدام عمق عيار مسبقة الصنع مصنوعة من طول 22 G أنابيب وضعت في 19 G أنابيب (الشكل 3A، ط تيم 8)، وتقييم عمق تجويف النخاع موسع وضمان أنها 3 مم (الشكل 4F-K) . إذا تجويف النخاع يقاوم 22 G مقياس العمق، ماعون من الورق مرة أخرى مع 22 G إبرة تحت الجلد حادة.
- إدراج بعناية دبوس النخاع في الداني القاصي ثم ج النخاعيةavities لجلب عظم الفخذ مرة أخرى إلى طوله الأصلي وإنشاء مستقر 3 ملم الفجوة (الشكل 5A، B). إذا لزم الأمر، وتطبيق كمية صغيرة من الضغط اليدوي لتحقيق نوبة التدخل الجيد للقضيب مع العظم القشري من عظم الفخذ. تأكد من أن دبوس يناسب بشكل مريح في تجاويف النخاع من كلا الجانبين، وحواف قطع العظام والاحمرار مع ذوي الياقات البيضاء. إذا كان هناك فجوة، ماعون من الورق مرة أخرى مع إبرة حادة 22 G.
- إعادة العضلات والأنسجة الطرفية على دبوس وإغلاق مستمر مع امتصاص 5-0 خياطة (الشكل 5C). انهيار شق الجلد مع 5-7 عقدة مربع النايلون 5-0 الغرز وختم بمادة لاصقة الجراحية (الشكل 5D).
3. إجراءات ما بعد الجراحة
- بعد إغلاق شق الجلد، وسحب التخدير، ولكن تسمح O 2 لتبقى تتدفق حتى يبدأ الماوس لنقل، هذا ينبغي أن تأخذ أقل من 1 دقيقة. إذا بقي الماوس بلا حراك بعد 5 دقائق منO 2 الإدارة، والرجوع إلى السياسات المؤسسية على التدخل البيطري.
- عندما يبدأ الماوس لنقل، ونقل برفق إلى قفص يفضل أن تحتوي على الجاف، والفراش تعقيمها.
- وضع القباني من نوع عش في كل قفص وسوف الماوس تراجع فيه، والحد من الحركة. تحقق من أن الماوس يتعافى التنقل القائمة الخلفية 5-10 دقيقة بعد استرداد وعيه.
- أداء الرصد اليومي بعد العملية الجراحية وفقا لسياسات مؤسسية. توفير الماء والغذاء مهيلم على أرضية القفص لأيام 5-7 أول وإدارة التسكين ورصد ما بعد الجراحة وفقا للسياسات المعتمدة مؤسسيا.
ملاحظة: نحن إدارة 0،05-،1 ملغم كغم -1 البوبرينورفين 24 ساعة مع 0.25 مل المالحة تحت الجلد مرتين يوميا لأول 3 أيام، وبعد ذلك إذا كان الماوس لا فائدة استعادة العادية.
- بعد ساعة 24 الأولى من الانتعاش، وأداء الحيوانات الحية التصوير بالأشعة السينية undeالتخدير r لتصور دبوس التنسيب (الشكل 4E). إذا تم خلع دبوس، والنظر في تنقيح جراحة فورية.
- في يوم 7 بعد الجراحة، وإزالة الغرز تحت التخدير ومنزل في مجموعات وفقا لسياسات تربية الحيوانات المؤسسي.
- بعد 2-5 أسابيع، والموت ببطء إنسانية الحيوانات وفقا للجمعية الأميركية للطب البيطري وافقت أساليب القتل الرحيم 25.
ملاحظة: حقنة داخل الصفاق المتاحة تجاريا كوكتيل الباربيتورات-الجمع بين القتل الرحيم هو فعال وإنساني، ولكن ينبغي اتباع السياسات المؤسسية المحلية على القتل الرحيم. - تشريح بعناية بعيدا-أطرافهم هند من خلال تعريض عظم الفخذ القريبة والحوض من الجانب الإنسي. اضغط بلطف المفصل الداخل من الجانب الوحشي من أطرافهم في حين فصل رأس الفخذ من لحق (تجويف الورك) مع مشرط. قطع المتبقية العضلات والجلد مع مشرط حاد أو مقص الصغيرة، والإفراج عنالطرف بأكمله تشكل الحوض. مع زوج حاد من رينجرز أو مقص الثقيلة، وقطع أقل هند-أطرافهم (الساق / الشظية) حوالي 5 ملم تحت مفصل الركبة.
ملاحظة: من المستحسن أن جميع العينات يتم تخزين بطريقة مماثلة قبل التحليل. - إزالة الجلد، ولكن ترك العضلات في المكان. إصلاح الأنسجة في 10٪ من الفورمالين مخزنة تستكمل مع 10 ملي CaCl 2 تثبيتي ل1 أسبوع تليها تخزين في الفوسفات مخزنة المالحة تستكمل مع 10 ملي CaCl 2 لمدة تصل إلى 1 في الشهر قبل التصوير. أداء التثبيت وتخزين عند 4 درجات مئوية. بدلا من ذلك، تفحص العينات فورا دون تثبيت.
4. تحليل العينات
يمكن تقييم شفاء العظام من جانب مجموعة متنوعة واسعة من المنهجيات التي هي خارج نطاق هذا البروتوكول: ملاحظة. ما يلي هو الأسلوب الذي نحن قد استخدمت بنجاح باستخدام عينة microCT (μCT) تصوير. فمن المستحسن أن المعلمات التالية عالبريد اختبارها في البداية، ثم الأمثل لاحتياجات المحددة للمشروع.
- التفاف العينة في طبقة رقيقة من البلاستيك ختم الفيلم وضعه عموديا في غرفة الصك. تأكد من أن عظم الفخذ هو عمودي على مرحلة عينة أثناء الفحص بأكمله. تعيين المسح الضوئي إلى المعلمات التالية. الجهد = 29 كيلو فولت، الحالية = 661 أمبير، الطاقة = 19 W، وحجم الصورة بكسل (ميكرون) = 21.00. 360 درجة دوران = نعم. الإطار المتوسط = على (5)؛ خطوة دوران (درجة) = 1.00، حركة عشوائية = جرا. حفظ الصور كملفات JPEG في مجلد وجهة واحدة في المسح (على سبيل المثال الشكل 6A).
ملاحظة: يجب أن يكون مسح كامل في 57 دقيقة. - الاستفادة من برنامج إعادة الإعمار لتوليد صور المحورية على أساس المعايير التالية: تمهيد = على (4)، اختلال التعويض = على، والحد من حلقة قطعة أثرية = على (5)، وتصحيح تصلب شعاع (40٪)، CS دوران (درجة) = 0.00. تعيين الإخراج إلى 2،000-15،000 وحدة هاونسفيلد. حفظ الصور كملفات JPEGفي مجلد وجهة واحدة في المسح الضوئي.
- باستخدام الصور المحورية والبرامج التحليلية، وتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من خلال وضع لأول مرة الداني والقاصي حواف الخلل الأصلي. تحقيق ذلك من خلال اختيار المقاطع التي تشمل ذوي الياقات البيضاء فقط. لأن طوق هو أكثر سمكا من دبوس النخاع، وتعرف هذه الفروع بسهولة (الشكل 6B، يسار). استبعاد طوق من العمليات الحسابية من خلال الاعتماد على المنطقة المحظورة حول ذلك (مع هامش 100 ميكرون)، ونقل المنطقة إلى كل قسم من الأقسام في العائد على الاستثمار (الشكل 6B، يمين).
ملاحظة: لحظات القطبية من الجمود، وإعادة البناء 3D والحسابات مثل حجم عظام جديدة (الشكل 6C، D) يمكن بسهولة أن يتحقق باستخدام البرنامج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الفئران عادة استرداد وعيه والقائمة الخلفية التنقل 5-10 دقائق بعد انسحاب التخدير. خلال 5 أيام الأولى، فمن المستحسن لإيواء الفئران بشكل فردي وإدخال تخصيب البيئي لمنع استخدام الفائض من أطرافهم. لهذا الغرض، القباني من نوع أعشاش تقلل من الحاجة لبناء العش وتشجع يستريح. وقد لاحظنا أيضا أن توفير الغذاء وهيدروجيل على أرضية القفص يقلل من احتمال دبوس النزوح. خلال فترة 5 أيام، وينبغي أن تدار تسكين كما هو مطلوب وفقا للسياسات المعتمدة مؤسسيا. فقدان الوزن تصل إلى ما يقرب من 15٪ من الوزن الأصلي قبل العملية ممكنة خلال فترة ما بعد الجراحة لمدة 5 أيام. بعد أربع وعشرين ساعة عملية جراحية، ويوصى X-أشعة الطرف المصاب لتقييم دبوس التنسيب. دبابيس ينبغي إدراج تماما في القريبة والبعيدة القنوات النخاعية مع حواف دافق عيب ضد طوق (الشكل 2C،2E، الشكل 5E، والشكل 6A). في حالات نادرة (<5٪ من الحالات)، يمكن أن تصبح دبابيس خلع في المراحل الأولى من الشفاء والحيوانية بروتوكولات استخدام ينبغي أن توفر للجراحة مراجعة إذا كان هذا يحدث. في حين أنه من الصعب فنيا لقياس الحركة الالتوائية على عظام الفخذ الفئران، أكد الجس اليدوي للعينات التي التوائية والحركة الطولية هامشية بعد 7 أيام مع تراكم النسيج الضام حول دبوس. بعد 5 أيام من المراقبة بعد الجراحة، ويمكن إرجاع الفئران في السكن الجماعي القياسية وفقا للسياسات المعتمدة مؤسسيا.
دون تدخل علاجي، حواف عيب تمتد عادة 0.5 ملم خلال 21 أيام ولكن في بعض الحالات النادرة، يمكن للنمو العظام الجديدة أن تصل إلى 1 مم (الشكل 6A). الاعتقالات نمو العظام بعد هذه الفترة المراحل التهابات والابتنائية من وقف تجديد مما أدى إلى وجود خلل غير للعمل النقابي. بعد 14-21 يوما من الشفاء، وحجم سو دي نوفو العظام يمكن تحديد بسهولة من الصور المحورية التي تولدها μCT المسح. باستخدام المسح الضوئي، وإجراءات إعادة الإعمار واختيار ROI المحورية موضح في البروتوكول، وحجم عظام جديدة ولدت يزداد مع الوقت، ولكن لا يتجاوز عادة ما مجموعه 1 مم 3 في غياب التدخل العلاجي (الشكل 6C) مقارنة 6- 7 مم 3 في منطقة تعادل تشريحيا من عظم الفخذ لم يصب. في حين اختبار النشاط الحيوي التقليدي يمثل تحديا تقنيا نظرا لحجم العينة وطبيعة طريقة التثبيت، لحظة القطبية من الجمود (PMI)، وهو تقدير قدرة المواد على مقاومة الالتواء على أساس مساحة المقطع العرضي والكثافة، وكان تبين أن تمثل تقدير مناسب للقوة في العظام الطويلة 26،27. باستخدام هذه الطريقة، يمكن اختيار المحورية المقاطع العرضية على مسافات مختلفة من حواف الآفة لتحليلها. بعد 21 يوما، وPMI دي نوفو العظام 0.25 ملم الابام الآفة حواف يتراوح من بين 0،05-0،35 مم 4 مقارنة 0،02-0،08 مم 4 في مركز الآفة مزيد مؤكدا وجود غير نقابيين في الحالات غير المعالجة (الشكل 6D). مؤشر مديري المشتريات من عظم الفخذ لم يصب في مكان ما يعادل تشريحيا يتراوح عادة ما بين 0،5-0،7 مم 4 باستخدام الشروط الموضحة هنا.
الشكل 6: نتائج النموذجية. بالاشعة (A) الأشعة السينية من عظام الفخذ في يوم 7 و 14 و 21 بعد الجراحة التي تبرز نشوب محدود من العظام لوحة (ب): تمثيل بياني من المعلمات ROI لقياس العظام الحجمي. المحوري تمثيلية المقطع العرضي مع منطقة الحظر (EX) على دبوس ذوي الياقات بما في ذلك 100 ميكرون هامش استبعاد قياس القطع الأثرية في واجهة الأنسجة المعدنية (يسار). فحص العظام الكامل (صآيت، العلوي) مما يدل على العائد على الاستثمار الطولي الذي حدده أقسام العظام بين حواف من ذوي الياقات البيضاء مع النسيج العظمي الأصلي استبعاد (EX). وتقع على حواف الآفة الأصلية في الأقسام المحورية باستخدام الفرق بين القطر من دبوس وطوق (يمين، أدناه). (C) القياسات الحجمية النموذجية في يوم 7 و 14 و 21 وظيفة عملية جراحية مع أي تدخل علاجي (يعني مع الانحرافات المعيارية، ن = 3). (D) القياسات PMI في أقسام المحورية 0.25 مم من الداني والآفة البعيدة حواف ومنتصف نقطة (يعني مع الانحرافات المعيارية، ن = 3). (جزءا لا يتجزأ من البارافين-ملطخة بالترسيب E) ماسون القسم (يسار) خفض في الاتجاه الطولي مما يدل على نمو العظام تتكون من الغضاريف (كاليفورنيا) وعظم اسفنجي (ب) (مقياس شريط = 0.5 ملم). يشار إلى موقف ميدانية على مسح الأشعة السينية (يمين). (F) غير decalcifi-الطبعه، ميتاكريليت الميثيل جزءا لا يتجزأ من قسم الاكليلية من الخلل القديم يوم 1 ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (مقياس شريط = 1.0 ملم). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
زوال الكلس للأنسجة وعادة ما يستغرق 10-14 أيام باستخدام الظروف القياسية، ويتم رصد بسهولة عن طريق المسح الضوئي للأشعة السينية. فإنه من المستحسن أن الاحتفاظ ببعض الجهاز العضلي على العينات خلال زوال الكلس لتحسين الاستقرار خلال المناولة. بعد زوال الكلس، ودبابيس يمكن إزالتها بعناية مع مشرط حاد السماح تضمين البارافين والأنسجة. ماسون ثلاثي الألوان تلطيخ المقاطع الطولية يسمح التصور من داخل الغضروف ثمرة العظام مع حافة الرائدة في الغضروف (كاليفورنيا)، يليه عظم اسفنجي (CB) (الشكل 6E). في حين أن بعض الضرر سيحدث لا محالة خلال تشريح، وهيكل النسيجي للعظموتبقى الأنسجة الضامة واضحة إذا تمت إزالة دبوس بعناية. بدلا من ذلك، الميثيل ميتاكريليت التضمين وباجتزاء مقاطع غير المنزوعة يمكن أداؤها مع دبوس في مكان (الشكل 6F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف طريقة بسيطة لتوليد عيب الحرجة الحجم استقرت دبوس من عظم الفخذ الفئران باستخدام المختبر القياسية والمعدات البيطرية. في حين أن التجمع من المسامير وإجراء العمليات الجراحية في حد ذاته يتطلب الممارسة، فإنه على ما يرام في حدود قدرات عالم أبحاث الطب الحيوي المدربين تدريبا جيدا أو طبيب بيطري.
يتم وضع دبوس في القناة النخاعية دون تثبيت إضافية، مما يجعل الإجراء من الناحية الفنية أكثر جدوى من النهج الأكثر تعقيدا التي تستخدم المثبتات الخارجية أو مسامير المتشابكة. بينما قد تحدث بعض الحركة الالتوائية خلال المراحل المبكرة للشفاء، وهذا هو الحد الأدنى من الاهتمام الدقيق لقطر دبوس والتوسيع كافية من القناة النخاعية وذلك لتحقيق نوبة التدخل الحازم بين الزرع والسمحاق الداخلي المبطن للتجويف النخاعي. مع اختيار دقيق من سلالة الفطرية ومطابقة من العمر، والجنس، وتناسب يصبح قويا بتكاثر في غضون أيام قليلة. ومع ذلك، وايعشر ظهور تقنيات الطباعة 3D، فمن المتوقع أن الحركة الالتوائية يمكن تخفيض مزيدا من الإصدارات أكثر تطورا من دبوس التي تتضمن السطوح الخشنة و / أو مواقع الحجز الشائكة. سهولة دبوس تلفيق وتوفر مجموعة واسعة من الأحجام أنابيب تحت الجلد يسمح أيضا الاستفادة المثلى من هذه التقنية عمليا أي شخص بالغ الماوس الفطرية، بغض النظر عن النمط الظاهري العظام الطبيعية أو التجريبية.
فريدة من نوعها تصميم دبوس ذوي الياقات يخدم غرضين: (ط) لمنع تضييق الشاذة من العيب والضرر في الأطراف العظام من خلال انزلاق طولي، و (ثانيا) لتوفير المعالم التي تحدد حواف الأصلية للعيب. كما قياسات من هذا القبيل، الحجمي وPMI يمكن أن يتم بسهولة باستخدام ماسح ضوئي عينة μCT مثل Skyscan 1174. وفي الواقع، فإن هذا النهج يسمح مستوى الكميات التي لا يمكن الحصول عليها بسهولة مع تقنيات كسر الحجم غير الحرجة القياسية التي غالبا ما تظهر متغير أو برازتعريف RLY إصابات. في حين أن وحدة μCT هو الأفضل لتحديد الكميات من الشفاء، والتقييم من قبل تقييم موضوعي للالمتعامدة صور الأشعة السينية أو 2D تقنيات تحليل الصور قد تمثل البدائل الممكنة. نظرا لحجم صغير ومنخفض نسبيا المحتوى المعدني، وأطرافه الفئران يمكن إعداد بسهولة للالأنسجة والتي شنت كما العينات كلها لhistomorphometry التقليدي. هذه القضايا يرفض أخذ العينات كثيرا ما يواجهها الباحثون إجراء تحليلات القياس النسيجي لكسور الحيوانات الكبيرة.
في التجارب وصفها هنا، كانت المرة الشفاء قصيرة نسبيا في 3 أسابيع، والتي تتطابق مع، المرحلة الابتنائية السريع لالتئام العظام. بعد ذلك، إعادة تشكيل العظام هو عملية بطيئة جدا 28. عموما، إذا لم يتم سد احظ بعد 4 أسابيع، وتضميد الجراح من غير المرجح أن تحدث وبالاتفاق، نلاحظ القليل جدا من نمو العظام إضافي بعد 4 أسابيع في هذا النظام. وعلاوة على ذلك، هناك فجوة 3 مم تلبي معايير مفتاح وآخرون لل. 16 لعيب الحجم الحرج وجارسيا وآخرون أظهرت أن هناك فجوة ضيقة مثل 1.8 ملم لا تلتئم بشكل كاف بعد 10 أسابيع، وهذا يمكن أن يتأخر إلى 15 أسبوعا مع perichondrium جردت 23.
في حين أن حجم وهشاشة عظامهم التحديات التقنية الخطيرة الحالية للأبحاث العظام، واستخدام الفئران هو مفيد من نواح عديدة. على سبيل المثال، هناك مجموعة متنوعة من سلالات للخطر في مأمن التي تسمح اختبار خلايا الإنسان والبروتينات دون خوف من الرفض المناعي، وصغر حجمها يقلل من الحاجة إلى كميات زائدة من قيمة المواد التجريبية، والخلايا أو المركبات. ويتمثل ذلك من خلال دراستنا الأخيرة مما يدل على فعالية الخلايا الجذعية البشرية البالغة والبروتينات من خارج الخلية لosteoregeneration 29. عمر قصير نسبيا من الفئران يقدم أيضا فرصة للبحث في الشيخوخة (30) وتشكيلة واسعة من السلالات الفطرية PERMIT دراسة النمط الجيني العالمي على الشفاء 31. وهناك أيضا عدد من النماذج المرض التي يتم وضعها بسهولة في الفئران مثل مرض السكري وهشاشة العظام 32،33. وتجدر الإشارة الهامة هو توافر العديد من الفئران المعدلة وراثيا التي يمكن استخدامها مع هذه التقنية لزيادة فهمنا للعلم وظائف الأعضاء العظام التجدد في ظل ظروف الصدمة الشديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ونحن نشكر الموظفين والأطباء البيطريين في وزارة سكوت ومستشفى الأبيض الطب المقارن، معبد بولاية تكساس، للحصول على المشورة التي لا تقدر بثمن والمساعدة خلال تطوير هذه التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من معهد الطب التجديدي أموال البرنامج، سكوت اند وايت RGP منحة # 90172، NIH 2P40RR017447-07 وNIH R01AR066033-01 (NIAMS). نشكر الدكتورة سوزان زيتوني لعزل المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
References
- Brinker, M. R., O'Connor, D. P. The incidence of fractures and dislocations referred for orthopaedic services in a capitated population. J Bone Joint Surg Am. 86, 290-297 (2004).
- Cheung, C. The future of bone healing. Clin Podiatr Med Surg. 22, 631-641 (2005).
- Rosemont, I. L. United States Bone and Joint Decade: The burden of musculoskeletal diseases and musculoskeletal injuries. , American Academy of Orthopedic Surgeons. (2008).
- Tzioupis, C., Giannoudis, P. V. Prevalence of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S3-S9 (2007).
- Marsh, D. Concepts of fracture union, delayed union, and nonunion. Clin Orthop Relat Res. , S22-S30 (1998).
- Spicer, P. P., et al. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nat Protoc. 7, 1918-1929 (2012).
- Green, E., Lubahn, J. D., Evans, J. Risk factors, treatment, and outcomes associated with nonunion of the midshaft humerus fracture. J Surg Orthop Adv. 14, 64-72 (2005).
- Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. The health economics of the treatment of long-bone non-unions. Injury. 38, Suppl 2. S77-S84 (2007).
- Dimitriou, R., Mataliotakis, G. I., Angoules, A. G., Kanakaris, N. K., Giannoudis, P. V. Complications following autologous bone graft harvesting from the iliac crest and using the RIA: a systematic review. Injury. 42, Suppl 2. S3-S15 (2011).
- Boer, H. H. The history of bone grafts. Clin Orthop Relat Res. , 292-298 (1988).
- Aro, H. T., Aho, A. J. Clinical use of bone allografts. Ann Med. 25, 403-412 (1993).
- Burstein, F. D. Bone substitutes. Cleft Palate Craniofac. J. 37, 1-4 (2000).
- Kao, S. T., Scott, D. D. A review of bone substitutes. Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 19, 513-521 (2007).
- Boden, S. D. Overview of the biology of lumbar spine fusion and principles for selecting a bone graft substitute. Spine. (Phila Pa 1976). 27, S26-S31 (1976).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials). J Craniofac Surg. 1, 60-68 (1990).
- Key, J. The effect of local calcium depot on osteogenesis and healing of fractures. J. Bone Joint Surg. (Am). 16, 176-184 (1934).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration). J Orthop Trauma. 23, S31-S38 (2009).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49, 591-599 (2011).
- Cheung, K. M., et al. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21, 685-690 (2003).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11, 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).
- Garcia, P., et al. Development of a reliable non-union model in mice. J Surg Res. 147, 84-91 (2008).
- Flecknell, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Lab Anim. 18, 147-160 (1984).
- Guidelines on the Euthanasia of Animals. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, IL 60173. (2013).
- Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50, 1357-1367 (2012).
- Bagi, C. M., et al. The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA. Bone. 38, 136-144 (2006).
- Hadjiargyrou, M., et al. Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair. J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).
- Clough, B. H., et al. Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins. J Bone Miner Res. , (2014).
- Lu, C., et al. Cellular basis for age-related changes in fracture repair. J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).
- Jepsen, K. J., et al. Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing. J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).
- Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).
- Jee, W. S., Yao, W. Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).
