Introduction
Si stima che la metà della popolazione degli Stati Uniti sperimentare una frattura all'età di 65 1. Per i pazienti con fratture trattate chirurgicamente, 500.000 procedure comportano l'uso di un innesto osseo 2 e questo numero è destinato ad aumentare con una popolazione sempre più anziana 3 . Sebbene osso è uno dei pochi organi che ha la capacità di guarire completamente senza cicatrici, ci sono casi in cui il processo non riesce 3,4. A seconda delle circostanze e la qualità del trattamento, 2-30% delle fratture delle ossa lunghe fallire, con conseguente non-union 3,5. Mentre rimane qualche dibattito sulla definizione, pseudoartrosi, lesioni ossee critici-size o non sindacalizzati in genere si riferisce a un infortunio che non guarisce tutta la durata naturale del soggetto 6. Ai fini sperimentali, tale durata è ridotta al tempo medio necessario per la completa guarigione di una ferita di medie dimensioni delle ossa. Lesioni ossee non sindacali si verificano per nummotivi erous, ma i principali fattori includono traumi estremi conseguente gap critico dimensioni, infezione, povero angiogenesi, uso di tabacco, o la capacità osteoregenerative inibito a causa di malattie o 7 anni. Anche se non unioni sono trattati con successo, può costare oltre $ 60.000 al procedimento, a seconda del tipo di lesione e gli approcci impiegati 8.
In casi moderati, innesto osseo autologo è impiegato. Questa strategia comporta il recupero di osso da un sito donatore e l'impianto nel sito di lesione. Mentre questo approccio è estremamente efficace, il volume di osso disponibile donatore-derivato è limitata e la procedura prevede un ulteriore intervento chirurgico, che si traduce in dolore persistente in molti pazienti 9,10. Inoltre, l'efficacia dell'innesto osseo autologo dipende della salute del paziente. Sostituti ossei in materiali sintetici o di osso da cadavere elaborati sono disponibili in abbondanza 11-13, ma HAve significative limitazioni, tra cui scarse proprietà di adesione della cellula ospite, ridotto osteoconduttività, e la possibilità di rigetto immunitario 14. Vi è quindi un urgente bisogno di tecnologie di rigenerazione ossea che sono sicuri, efficaci e ampiamente disponibile.
La nostra capacità di migliorare le strategie di rigenerazione dell'osso è criticamente dipendente dalla capacità di imitare gravi traumi ossei in animali da laboratorio, ma la generazione e la stabilizzazione di grandi lesioni ossee è tecnicamente impegnativo. Nella maggior parte dei casi, gravi traumi delle ossa lunghe è imitato sperimentalmente stabilendo un difetto che non guarire naturalmente. Anche se può variare con specie 15, questo si ottiene la rimozione completa di un segmento osseo che è maggiore di 1,5 volte il diametro dell'osso sezione 16. L'osso viene poi stabilizzato con un impianto metallico per mantenere il corretto orientamento dei bordi di frattura e consentire la mobilità. A causa della loro piccola dimensione e la fragilitàle ossa lunghe, la creazione di tali lesioni nei topi sono oltre le capacità della maggior parte dei gruppi di ricerca. Come tale, i modelli difettosi delle ossa lunghe sono limitati a ratti e animali più grandi. Tuttavia, i topi offrono notevoli vantaggi di ricerca in quanto possono essere geneticamente modificati e allevati come ceppi immunocompromessi che non rifiutano le cellule e tessuti umani.
Per le applicazioni basate sulle cellule umane, i topi immunocompromessi sono attraenti per lavorare con perché sono fisiologicamente ben caratterizzati, facile da casa, redditizio, e facilmente analizzati radiologicamente e istologicamente. Di fondamentale importanza è che i topi immunocompromessi non rifiutano le cellule di specie diverse, tra cui l'uomo. Le loro piccole dimensioni permette anche la sperimentazione di un numero esiguo di cellule o volumi di ponteggi sperimentali in applicazioni ortopediche. Diversi modelli murini ortopedici sono stati segnalati che offrono vari gradi di stabilità ossea 17,18. Quelli systems che si traducono in livelli molto elevati di stabilità, come fissatori esterni e piastre di bloccaggio prevalentemente guarire da ossificazione intramembranosa anche se la guarigione endochondral è stato segnalato 19. Al contrario, quelli che permettono alcune micro e / o macro-motion, come quelle che impiegano i perni midollari non fissati o parzialmente fissi, in genere guariscono con una predominanza di encondrale 20,21. Unione ritardata o difetti non sindacali di ossa lunghe sono particolarmente difficili da realizzare nei topi a causa del livello extra di stabilizzazione necessaria. Tuttavia, una serie di approcci sono stati segnalati, tra cui i perni midollari con chiodi ad incastro, piastre di bloccaggio e fissatori esterni 22. Questi sistemi generalmente funzionano bene, ma data la loro progettazione complicata possono essere tecnicamente difficile da installare. Ad esempio, Garcia et al. 23 escogitato un elegante sistema pin incastro per l'uso nei topi, ma la procedura prevede due incisioni a sito separatos ed una sostanziale modifica del femore per accogliere i perni. Queste procedure sono state eseguite sotto un microscopio da dissezione.
Qui, descriviamo un semplice perno midollare femorale con un collare centrale progettata per impedire la chiusura di un deficit ossea 3 mm e anche delineare i bordi originali del difetto. Mentre il perno non è stato fissato all'osso stesso, accurato dimensionamento del diametro del perno e alesatura dei risultati cavità midollare in interferenza sufficiente a minimizzare il movimento torsionale (Figura 1). Con un'attenta selezione di età inbred, genere e topi ceppo corrispondenza, il risultato è un altamente riproducibile ipertrofica non uniondefect 22 che può essere facilmente valutata radiologicamente. Inoltre le regioni di interesse possono essere definite in modo riproducibile dopo micro-tomografia computerizzata (μCT) per la misura di de novo formazione ossea e parametri istomorfologici. I perni sono stati prototipati nel nostro laboratorio utilizzando strumenti facilmente reperibili.
Figura 1: principio sperimentale sintesi schematica del modello di difetto segmentale.. Il segmento centrale 3 mm un femore murino 9-10 mm viene asportato chirurgicamente (a sinistra). A, 19 calibro tubo di acciaio chirurgico, lunga 3 mm, è passata sopra a 9 mm di lunghezza, 22 G tubo di acciaio inox e fissato con adesivo al centro esatto (a destra). Il perno risultante è montato nei canali midollari dei restanti porzioni prossimali e distali del femore con il collare 19 G sostituzione del segmento 3 mm dell'osso (di seguito, al centro).
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Protocol
NOTA: Questo protocollo è progettato per nude (Nu / J) femmine di topo (18-25 g, 6 settimane) acquisito da Jackson Laboratories. Dal momento che i ceppi di topi variano leggermente in termini di anatomia e il tasso di crescita, si consiglia che la fabbricazione dei pin è ottimizzato per il ceppo, il sesso e l'età dei destinatari prima dell'impianto in soggetti vivi. Se i ceppi sono accuratamente abbinati, l'accoppiamento ad interferenza tra il perno e osseo cavità è altamente riproducibile. Procedure per l'edilizia abitativa, la dieta e l'allevamento degli animali in generale sono oltre la portata di questo protocollo, ma tutti i topi sono stati alloggiati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (8 ° edizione) e politiche istituzionali stabilito dalla cura degli animali e Istituzionale Utilizzare Comitato (IACUC) e Dipartimento di Medicina comparativa (DCM) a Scott e White Hospital.
1. Realizzazione di pin
- Tagliare una lunghezza 9 millimetri di 22 G tubi ipodermico acciaio, e una lunghezza di 3 mm 19 tubo G con un pesante ruota di cut-off 23,8 millimetri in fibra di vetro rinforzata di diametro montato su un utensile rotante. Utilizzare una pinza a punta fine per immobilizzare il tubo (Figura 2A, sopra). Indossare adeguata protezione per gli occhi e gestire utensile rotante con cura.
- Inserire una piccola quantità (circa 10 ml) di adesivo cianoacrilato per mezzo dell'albero 9 mm. Passare il Collare 3 mm su dell'albero 9 mm, fino al centro e torsione di distribuire uniformemente il collante tra il collare e l'albero. Misurare dimensioni con un paio di pinze digitali e confrontare con la Figura 1. Lasciare riposare per almeno 15 ore (Figura 2A, al centro).
- Utilizzare un disco smeriglio impregnato grana 220 per eliminare sbavature e colla eccessivi.
- Utilizzando lo strumento rotativo, lucidare il perno con un disco di lucidatura feltro.
- Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con Comprearia ssed.
- Integrità test inserendo un ago ipodermico smussato 19 G sull'albero del perno appena fatto e spinta contro il collare. Assicurarsi che il collare può resistere a circa 25 g di peso.
- Sciacquare il perno in sterile filtrata tampone fosfato (Figura 2B, in alto). Assicurarsi che l'albero del perno si inserisce perfettamente nel canale midollare del femore con il filo collare contro i bordi del taglio dell'osso (Figura 2C). Prototype varie configurazioni per gli scopi specifici dello studio e del destinatario (Figura 2D). Assicurarsi che le estremità del perno penetrano nel tessuto osseo trabecolare della diafisi modo da massimizzare fissazione e migliorare l'interferenza (figura 2E).
NOTA: Si raccomanda che l'adattamento è testato su campioni ossei prima dell'impianto in topi vivi (ad esempio Figura 2C). - Utilizzare un 4 mm di diametro punch-biopsia taglierina per tagliare un cilindroda un foglio di spessore 5 mm chirurgica spugna di gelatina. Utilizzare un bisturi per tagliare il cilindro 3 mm di lunghezza e passare un ago ipodermico 20 G lungo la lunghezza del cilindro per generare un foro (Figura 2A, di seguito).
NOTA: Abbiamo scoperto che il posizionamento di una gelatina o collagene ponteggio nel sito del difetto migliora la ritenzione cellulare e induce la crescita lungo l'asse longitudinale dell'osso. - Passare il cilindro in schiuma di gelatina sul perno e allineare con il collare (Figura 2B, centro) e autoclave su un ciclo a secco a 120 ° C a 15 psi. La schiuma di gelatina si asciuga e scurire colore (Figura 2B, in basso).
2. Tecnica chirurgica
NOTA: La seguente procedura è scritto rispettando tutte le linee guida fissate dalla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (8 ° edizione). Si prega di osservare tutte le politiche aggiuntivefissato dal IACUC locale e garantire un protocollo di uso animale IACUC approvato (o equivalente) sia in posizione prima di procedere con le seguenti sezioni.
Figura 3: Strumenti chirurgici. (A) Kit chirurgico. Micro-trapano (1), taglio ruota (2), sutura assorbibile (3), sutura esterna (4), lame di bisturi (5), la maniglia bisturi (6), sterili perni midollari avvolti in un foglio (7), profondimetro midollare forma fatta tubo ipodermico (8), pinza sottile naso (9), ratto-denti pinza (10), aghi alesatura smussati (11), i driver ago (12), piccoli hemostats (13), forbici sottili (14), scollaperiostio (15), pinze modificate Kern (16) (B):. Modifiche necessarie per produrre in stile Kern osso-grip per topi.
- Selezionare una sala chirurgica procedura o di laboratorio pulito con una porta chiudibile e non nel traffico. Sterilizzare un surfac lavoro adeguatoe con un detergente disinfettante a base-quaternario grado clinico.
- Indossando guanti sterili monouso e vestaglia, ha istituito un campo sterile di circa 60 x 90 cm 2 sul piano di lavoro igienizzata con drappi di stoffa autoclave.
NOTA: E 'consigliabile avere un assistente rimuovere l'imballaggio esterno e presentare i materiali sterili per la creazione del campo di investigatore. - Posizionare una piastra elettrica sterilizzata montato acqua calda ri-circolatore sul telo e coprire con teli sterili monouso. Warm uno sterilizzatore tallone di temperatura di funzionamento (250-265 ° C, questo richiede fino a 30 minuti).
- Sul campo sterile, organizzare kit chirurgico (Figura 3A) per fornire un comodo accesso a tutti i componenti. Inoltre, fornire garza sterile di cotone (2 x 2 cm 2), sterile Q-punte, una ciotola di acciaio sterile (500 ml) contenente soluzione fisiologica sterile (0,9% w / v) applicatori, e clorexidina disinfettanti / alcool isopropilico chirurgica.
- Assemblare un piccoloUnità anestesia degli animali accanto al campo sterile con una camera di induzione e testata cono in conformità con la guida veterinaria e il manuale utente. Usare l'ossigeno di grado clinico come la fornitura di gas e isoflurano, USP.
Figura 4: Procedura chirurgica. (AC) Approccio e l'esposizione del femore. (DE) Elevation e tagli. (FK) Alesaggio e dimensionamento dei canali midollari.
Figura 5: Procedura chirurgica. (AB) Installazione di pin. (CD) Chiusura. (E) tipica immagine di posizionato correttamente pin 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
- Collocare un mouse nella camera di induzione del sistema anestesia e set l'uscita 2 L min -1 O 2 e la concentrazione isoflurano al 3% (v / v).
- Verificare che il mouse è incosciente entro 1 min; aumentare la concentrazione al 4% (v / v) se necessario. Rimuovere il mouse, posto sul campo sterile con la piastra elettrica posizionata sotto e applicare il cono. Trasferimento flusso al cono, e ridurre il isoflurano al 2,5%, attendere altri 20 secondi, e di prova per un adeguato piano chirurgico in conformità con la politica istituzionale. Tipicamente, la mancanza di un riflesso dell'arto posteriore quando spremuto leggermente è adeguato per determinare l'anestesia adeguata.
- Durante tutto il processo, hanno un monitor assistente forte respirazione regolare e la colorazione rosa delle estremità e della regione della bocca per assicurare un adeguato livello di ossigenazione durante dell'inconscio. Regolare l'anestesia in conformità con la guida veterinaria e politica istituzionale, se necessario. Applicare sterile lacrime artificiali lubrificante unguento (15% (v / v) olio minerale, 83% (v / v) whpetrolato ite) per gli occhi.
- Ruotare il mouse su un lato con l'arto posteriore rivolto verso l'alto su un nuovo telo monouso. Se necessario, rimuovere pelliccia con un rasoio elettrico o crema depilatoria. Pulire il sito con soluzione salina sterile e rimuovere il telo supplementare con un eccesso di pelliccia. Inserire un nuovo telo fenestrato il mouse in modo da coprire tutte le parti, ma l'intero arto posteriore (Figura 4A), ma mantenere vista della faccia e zampa per monitorare la colorazione e la respirazione.
- Individuare le estremità prossimali e distali del femore e incidere la pelle per 5-10 mm lungo l'asse longitudinale (Figura 4B). Separare lo strato di pelle dalla fascia con un # 15 bisturi, esponendo un approccio laterale al femore via bicipite femorale e vasto laterale. Individuare dove i setti di soddisfare entrambi i muscoli (che è una linea di tessuto bianco contro la colorazione rosa del muscolo). Con un bisturi, sezionare con cura lungo il confine intermuscolare finoil femore è visibile (Figura 4B).
- Sviluppare l'incisione con un scollaperiostio smussato in modo da esporre l'intera diafisi (Figura 4C). Utilizzare l'ascensore per esporre ulteriormente le centrali due terzi del femore avendo cura di preservare il fascio posteriore neurovascolare sul lato mediale (Figura 4D). Raschiare delicatamente tessuti molli fuori dell'osso con un bisturi, e asciugare con un sterile Q-tip o equivalente.
- Individuare il centro del femore con pinze se necessario e segnare con un bisturi sterile o pennarello, quindi segnare 1,5 millimetri prossimale e distale dal centro. Afferrare il femore con un paio di belle dal naso pinze precedentemente modellate nello stile Kern per evitare un'eccessiva pressione sull'osso.
NOTA: Le dimensioni esatte per le modifiche sono forniti in Figura 3B. Si consiglia di testare la pinza su un campione eutanasia prima dell'uso per garantire l'osso non si rompe sotto pressione richieded per l'immobilizzazione durante il taglio. - Utilizzando una multa trapano munito di rotella di taglio raffinato diamante a grana patinata (8 mm di diametro x 0,1 mm di larghezza), fare il primo taglio con l'ascensore in atto per proteggere il tessuto al di sotto (figura 4E). Aumentare il femore taglio a 45 ° mentre tiene saldamente all'estremità della diafisi, fare il secondo taglio, la rimozione di un segmento 3 mm.
NOTA: Protezione viso è raccomandato in questa fase. - Con l'osso immobilizzato da una pinza, risma attentamente le cavità midollare di ogni estremità con un ottuso 23 G ago ipodermico. Utilizzando un pre-made profondità calibro fatta da una lunghezza di 22 G tubo posto in 19 tubi G (Figura 3A, i TEM 8), valutare la profondità della cavità midollare alesato e assicurarsi che sia 3 mm (Figura 4F-K) . Se cavità midollare resiste profondimetro 22 G, risma di nuovo con un ottuso 22 G ago ipodermico.
- Inserire con cautela il perno midollare nella prossimale distale poi midollare cavities portare femore indietro alla sua lunghezza originale e stabilire una stalla 3 mm di aria (Figura 5A, B). Se necessario, applicare una piccola quantità di stress manuale per ottenere un buon accoppiamento con interferenza dello stelo con l'osso corticale del femore. Assicurarsi che il perno si inserisce perfettamente nella cavità midollare di entrambe le parti ed i bordi di taglio dell'osso sono a filo con il collare. Se vi è una lacuna, alesare ancora una volta con un ago smussato 22 G.
- Riposizionare il muscolo e tessuto periferico sul perno e chiudere con un continuo assorbibile 5-0 sutura (Figura 5C). Chiudi incisione cutanea con 5-7 piazza nodo nylon 5-0 punti di sutura e la tenuta con adesivo chirurgico (Figura 5D).
3. Procedure postoperatorie
- Dopo aver chiuso l'incisione cutanea, ritirare l'anestesia, ma permettono O 2 di rimanere scorre fino il mouse comincia a muoversi; questo dovrebbe richiedere meno di 1 min. Se il mouse resta immobile dopo 5 min diO 2 amministrazione, fare riferimento a politiche istituzionali in materia di intervento veterinario.
- Quando il mouse comincia a muoversi, delicatamente trasferirlo ad una gabbia contenente preferibilmente secco, biancheria autoclavato.
- Inserire un igloo di tipo nido in ogni gabbia e il mouse si ritirerà in esso, riducendo il movimento. Verificare che il mouse recupera la mobilità arti posteriori 5-10 minuti dopo il recupero della coscienza.
- Eseguire il monitoraggio postoperatorio quotidiana in conformità con le politiche istituzionali. Fornire idratazione gelatinizzato e cibo sul pavimento della gabbia per i primi 5-7 giorni e somministrare analgesia e il monitoraggio postoperatorio in conformità con le politiche istituzionalmente approvate.
NOTA: Noi amministriamo 0,05-0,1 mg kg -1 buprenorfina 24 con 0,25 ml di soluzione salina per via sottocutanea, due volte al giorno per i primi 3 giorni e, successivamente, se il mouse non recuperare utility normale.
- Dopo le prime 24 ore di recupero, esibirsi dal vivo su animali di imaging a raggi X under anestesia di visualizzare il posizionamento del perno (Figura 4E). Se il perno è dislocata, prendere in considerazione un intervento chirurgico immediato di revisione.
- Al giorno 7 dopo l'intervento chirurgico, rimuovere punti di sutura sotto anestesia e la casa in gruppi in accordo con le politiche di allevamento istituzionale.
- Dopo 2-5 settimane, umanamente euthanize animali secondo l'American Veterinary Medical Association ha approvato metodi di eutanasia 25.
NOTA: un'iniezione intraperitoneale di commercialmente disponibile barbiturico-combinazione eutanasia cocktail è efficace e umana, ma le politiche istituzionali locali eutanasia dovrebbero essere seguite. - Sezionare con attenzione via la arti posteriori esponendo femore prossimale e il bacino dal lato mediale. Premere delicatamente il giunto verso l'interno dal lato laterale dell'arto, mentre staccando la testa del femore dalla dell'acetabolo (la presa anca) con un bisturi. Tagliare restante muscolo e pelle con un bisturi affilato o micro-forbici, rilasciandotutto l'arto formano il bacino. Con un forte paio di rongeurs o forbici pesanti, tagliare la cerva-dell'arto inferiore (tibia / perone) di circa 5 mm al di sotto del ginocchio.
NOTA: Si consiglia di tutti i campioni sono memorizzati in modo identico prima dell'analisi. - Togliere la pelle, ma lasciare il muscolo in luogo. Fissare il tessuto in 10% formalina tamponata supplementato con 10 mM CaCl 2 fissativo per 1 settimana seguito da stoccaggio in tampone fosfato supplementato con 10 mM CaCl 2 per un massimo di 1 mese prima di imaging. Eseguire fissazione e conservazione a 4 ° C. In alternativa, eseguire la scansione di campioni immediatamente senza fissazione.
4. Analisi dei campioni
NOTA: Osso guarigione può essere valutata da una grande varietà di metodologie che sono oltre la portata di questo protocollo. Quanto segue è un metodo che abbiamo utilizzato con successo con un esemplare microCT (μCT) imager. Si raccomanda che i seguenti parametri are testato inizialmente, quindi ottimizzata per le esigenze specifiche del progetto.
- Avvolgere provetta in un sottile strato di film plastico e posizionarlo verticalmente nella camera strumento. Assicurarsi che il femore è perpendicolare alla fase campione per l'intera scansione. Impostare la scansione per i seguenti parametri; Tensione = 29 kV, corrente = 661 μA, potenza = 19 W, dimensione dell'immagine pixel (micron) = 21.00; Rotazione di 360 gradi = yes; Telaio media = a (5); fase di rotazione (gradi) = 1.00, movimento casuale = on. Salva le immagini come file JPEG in una singola cartella di destinazione per scansione (ad esempio figura 6A).
NOTA: La scansione deve essere completa in 57 min. - Utilizzare il software di ricostruzione per generare immagini assiali sulla base dei seguenti parametri; smoothing = a (4), la compensazione disallineamento = on, riduzione anello artefatti = a (5), fascio indurimento correzione (40%), la rotazione CS (gradi) = 0.00. Impostare uscita 2,000-15,000 unità Hounsfield. Salva le immagini come file JPEGin una sola cartella di destinazione per scansione.
- Usando le immagini assiali e software analitico, definire la regione di interesse (ROI) impostando prima prossimale e distale bordi del difetto originale. Raggiungere questo selezionando le sezioni che comprendono solo il collare. Poiché il collare è più spesso del perno midollare, queste sezioni sono facilmente definiti (Figura 6B, sinistra). Escludere il collare dai calcoli disegnando una zona di esclusione intorno (con un margine di 100 micron) e trasferire la zona a ciascuna delle sezioni del ROI (Figura 6B, destra).
NOTA: i momenti di inerzia polare, ricostruzioni 3D e calcoli, come il volume di nuovo osso (Figura 6C, D) possono essere facilmente raggiunti tramite il software.
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Representative Results
Mice tipicamente recuperare coscienza e arti posteriori mobilità 5-10 minuti dopo la sospensione di anestesia. Durante i primi 5 giorni, è consigliabile ospitare topi singolarmente e introdurre arricchimento ambientale per impedire l'utilizzo eccesso dell'arto. A questo scopo, igloo di tipo nidi riducono la necessità di costruzione del nido e incoraggiare riposo. Abbiamo anche osservato che la fornitura di cibo e idrogel sul pavimento della gabbia riduce la probabilità di dislocamento pin. Durante il periodo di 5 giorni, analgesia deve essere somministrato come richiesto in conformità con le politiche istituzionalmente approvati. Perdita di peso fino a circa il 15% del peso iniziale pre-operatoria è possibile durante il periodo postoperatorio 5 giorni. Ventiquattro ore dopo l'intervento, radiografie dell'arto interessato sono invitati a valutare le pin-placement. I perni devono essere completamente inseriti nei prossimali e distali canali midollari con i bordi del filo difetto contro il collare (Figura 2C,2E, Figura 5E, e Figura 6A). In rari casi (<5% dei casi), i pin possono diventare dislocati nelle fasi iniziali di protocolli di utilizzo di guarigione e animali dovrebbe prevedere la chirurgia di revisione se questo si verifica. Mentre è tecnicamente impegnativo per quantificare il movimento di torsione su femori murini, palpazione manuale di campioni ha confermato che il movimento torsionale e longitudinale è marginale dopo 7 giorni, come tessuto connettivo si accumula intorno al perno. Dopo 5 giorni di monitoraggio post-operatorio, i topi possono essere restituiti alla casa comunale standard come da politiche istituzionalmente approvati.
Senza un intervento terapeutico, i bordi del difetto tipicamente estendono 0,5 millimetri per 21 giorni, ma in rari casi, una nuova crescita delle ossa possono essere fino a 1 mm (figura 6A). Arresti crescita ossea dopo questo periodo come le fasi infiammatorie e anabolizzanti di cessate rigenerazione conseguente difetto di non-union. Dopo 14-21 giorni di guarigione, il volume of de novo osso può essere facilmente determinata da immagini assiali generate dalla scansione μCT. Utilizzando la scansione, le procedure di ricostruzione e di selezione ROI assiali descritti nel protocollo, il volume di nuovo osso generati aumenta con il tempo, ma generalmente non supera un totale di 1 mm 3, in assenza di un intervento terapeutico (Figura 6C) rispetto al 6- 7 millimetri 3 in una regione anatomicamente equivalente di femore uninjured. Durante il test biomeccanico convenzionale è tecnicamente difficile a causa delle dimensioni del campione e la natura del metodo di fissazione, il momento di inerzia polare (PMI), una stima della capacità di un materiale di resistere torsione basato su sezione trasversale e la densità, è stato rivelati una stima adeguata di forza in ossa lunghe 26,27. Usando questo metodo, assiali sezioni trasversali a varie distanze dai bordi della lesione possono essere selezionati per l'analisi. Dopo 21 giorni, il PMI di de novo osso 0,25 millimetri from lesione bordi varia da tra 0,05-0,35 mm 4 rispetto a 0,02-0,08 mm 4 al centro della lesione conferma ulteriormente la presenza di unione non in casi non trattati (Figura 6D). Il PMI del femore illeso in una posizione anatomicamente equivalente varia tipicamente tra 0,5-0,7 mm 4 utilizzando le condizioni qui descritte.
Figura 6: I risultati tipici. Scansioni (A) a raggi X di femori al giorno 7, 14 e 21 post-operatorio dimostrando ingrowth limitato di osso Panel B:. Rappresentazione schematica dei parametri ROI per la misurazione delle ossa volumetrica. Assiale rappresentativa sezione trasversale con una zona di esclusione (EX) nel pin colletti compreso un margine di 100 micron di escludere misurazione artefatti all'interfaccia metallo-tessuto (a sinistra). Scansione completa ossea (restra, all'inizio) dimostrando il ROI longitudinale definita dalle sezioni di osso tra i bordi del collare con tessuto osseo originale esclusa (EX). I bordi lesione originali trovano nelle sezioni assiali utilizzando la differenza tra il diametro del perno e il collare (a destra, sotto). (C) misurazioni volumetriche tipiche al giorno 7, 14 e 21 dopo la chirurgia senza intervento terapeutico (con mezzi deviazioni standard, n = 3). (D) le misure PMI a sezioni assiali 0,25 millimetri dai bordi prossimali e lesione distale e mid-point (significa con deviazioni standard, n = 3). (tricromica macchiato E) di Masson incluso in paraffina sezione (a sinistra) tagliato in senso longitudinale dimostrando escrescenza ossea composto di cartilagine (ca) e osso spugnoso (b) (scala bar = 0.5 mm). La posizione del campo è indicato sulla scansione a raggi X (destra). (F) non decalcified, metacrilato di metile incorporato sezione coronale di 1 giorno-vecchio difetto macchiato con ematossilina eosina (scala bar = 1,0 mm). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Decalcificazione dei tessuti richiede tipicamente 10-14 giorni utilizzando condizioni standard, ed è facilmente monitorato mediante scansione X-ray. Si consiglia di conservare una certa muscolatura sui provini durante decalcificazione per migliorare la stabilità durante la movimentazione. Dopo la decalcificazione, pin possono essere accuratamente rimossi con un bisturi tagliente che permette paraffina e istologia. Di Masson tricromica colorazione di sezioni longitudinali consente di visualizzare endocondrale escrescenza ossea con un bordo d'attacco della cartilagine (ca), seguita da osso spugnoso (CB) (Figura 6E). Mentre alcuni danni inevitabilmente verificarsi durante la dissezione, la struttura istologica del tessuto osseoe del tessuto connettivo rimane chiaro se il perno viene rimosso con attenzione. In alternativa, metil metacrilato incasso e sezionamento delle sezioni non demineralizzata possono essere eseguite con il perno in posizione (Figura 6F).
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Discussion
Qui, si descrive un metodo semplice per generare un difetto critico-sized pin-stabilizzato del femore murino utilizzando standard di laboratorio e veterinari. Mentre l'assemblea dei perni e la procedura chirurgica in sé richiede pratica, è bene alla portata di un ricercatore biomedico ben addestrato o veterinario.
Il perno è posizionato nel canale midollare senza fissazione aggiuntiva, rendendo il procedimento tecnicamente più fattibile rispetto agli approcci più complicati che impiegano fissatori esterni o viti di collegamento. Mentre alcuni di movimento torsionale può verificarsi durante le prime fasi di guarigione, questo è minimizzato attenzione al diametro del perno e adeguata alesatura del canale midollare in modo da raggiungere un accoppiamento con interferenza stabile tra l'impianto e endosteum. Con un'attenta selezione di ceppo inbred e la congruenza di età e sesso, la misura diventa riproducibile robusta nel giro di pochi giorni. Tuttavia, wi° l'avvento delle tecniche di stampa in 3D, si prevede che il movimento torsionale può essere ulteriormente ridotto dalle versioni più sofisticate del perno che incorporano le superfici ruvide e / o siti di attacco spinato. La facilità di fabbricazione perno e la disponibilità di una vasta gamma di misure dei tubi ipodermici consentono anche l'ottimizzazione della tecnica per qualsiasi topo adulto inbred, indipendentemente fenotipo osso naturale o sperimentale.
Il design unico pin-collare serve a due scopi: (i) per evitare restringimento aberranti del difetto e il danno delle estremità ossee attraverso slittamento longitudinale, e (ii) per fornire punti di riferimento che definiscono i bordi originali del difetto. Come tale, volumetrici e PMI misurazioni possono essere effettuate facilmente usando uno scanner esemplare μCT come un Skyscan 1174. Infatti, questo approccio consente un livello di quantificazione che non è facilmente ottenibile con tecniche frattura dimensioni non critiche standard che spesso presentano variabile o poorly definito lesioni. Mentre una unità μCT è preferibile per la quantificazione di guarigione, valutazione da valutazione oggettiva delle immagini radiografiche ortogonali o tecniche di analisi di immagine 2D possono rappresentare alternative praticabili. A causa delle loro piccole dimensioni e relativamente basso contenuto di minerali, gli arti murini possono essere facilmente preparati per istologia e montati come esemplari interi di istomorfometria convenzionali. Questo respinge questioni di campionamento spesso affrontate dai ricercatori che effettuano analisi istomorfometrici di fratture di origine animale di grandi dimensioni.
Negli esperimenti qui descritti, il tempo di guarigione era relativamente corta 3 settimane, che corrisponde alla rapida, fase anabolica di guarigione ossea. Successivamente, rimodellamento osseo è un processo molto lento 28. In generale, se bridging non si osserva dopo 4 settimane, la guarigione è improbabile che si verifichi e d'intesa, si osserva molto poco la crescita ossea supplementare dopo 4 settimane in questo sistema. Inoltre, uno spazio 3 millimetri soddisfa i criteri di Key et unl. 16 per un difetto di dimensioni critiche e Garcia et al. hanno dimostrato che uno spazio così stretto come 1,8 millimetri non sufficientemente guarire dopo 10 settimane e questo potrebbe essere ritardata a 15 settimane, con pericondrio spogliato 23.
Mentre le dimensioni e la fragilità delle ossa presentano seri problemi tecnici per la ricerca ortopedici, l'uso di topi è vantaggiosa in molti modi. Ad esempio, vi è una varietà di ceppi immunocompromessi che consentono test di cellule umane e proteine senza timore di rigetto immunologico, e loro piccola dimensione riduce la necessità di quantità eccessive di preziose materie sperimentali, cellule o composti. Questo è esemplificato dal nostro recente studio che dimostra l'efficacia delle cellule staminali umane adulte e le loro proteine extracellulari per osteoregeneration 29. La durata relativamente breve di topi presente anche la possibilità per la ricerca di invecchiamento 30 e la grande varietà di ceppi inbred peRMIT lo studio del genotipo globale sulla guarigione 31. Ci sono anche una serie di modelli di malattia che possono essere facilmente stabilito in topi come il diabete e l'osteoporosi 32,33. Di nota significativa è la disponibilità di molti topi transgenici che possono essere utilizzate con questa tecnica per migliorare la nostra comprensione della fisiologia rigenerativa ossea in condizioni di estrema trauma.
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Acknowledgments
Ringraziamo il personale e veterinari presso il Dipartimento di Medicina comparativa, Tempio, Texas Scott & White Hospital, per i loro consigli e la preziosa collaborazione durante lo sviluppo di questa tecnica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da L'Istituto per la medicina rigenerativa Programma Fondi, Scott & White RGP concessione # 90172, NIH 2P40RR017447-07 e NIH R01AR066033-01 (NIAMS). Ringraziamo il dottor Suzanne Zeitouni per proofing il manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pin assembly | |||
| Dremel rotary tool | Dremel | 8220 | or equivalent |
| Heavy duty cut off wheel | Dremel | 420 | |
| Surgical tubing 19 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8LY | OD 1.07 mm, ID 0.889 mm |
| Surgical tubing 21 G | Small Parts (Amazon) | B000FMZ8YQ | OD 0.82 mm, ID 0.635 mm |
| Surgical tubing 22 G | Small Parts (Amazon) | B000FMYLZS | OD 0.719 mm, ID 0.502 mm |
| Surgical tubing 23 G | Small Parts (Amazon) | B000FN0SY0 | OD 0.643 mm, ID 0.444 mm |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 1365882 | |
| Emery disc | Dremel | 413 | |
| Rubber polishing point | Dremel | 462 | |
| Felt polishing disc | Dremel | 414 | |
| Gelatin sponge | Surgifoam/Ethicon | 1974 | |
| Punch biopsy cutter | Miltex | 33-34 | |
| Surgery/post-operative | |||
| Warm pad and circulator pump | Stryker/Thermocare | TP700, TP700C, TPP722 | |
| Coverage quaternary spray | Steris | 1429-77 | |
| Bead sterilizer | Germinator/CellPoint Scentific | Germinator 500 | |
| Anesthesia system | VetEquip Inc | 901806 or 901807/901809 | |
| Isofluorane anesthetic | VETone/MWI | 501017, 502017 | |
| Surgical disinfectant | Chloraprep/CareFusion | 260449 | |
| Surgical tools | Fine Science Tools | various | recommend German made |
| Face protection | Splash Shield | 4505 | |
| Rechargable high speed drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| Diamond cutting wheel | Strauss Diaiond | 361.514.080HP | |
| Absorbable sutures | Covidien | UM-213 | |
| Outer sutures | Ethicon | 668G | or equivalent |
| Vetbond | 3M | 1469SB | or equivalent |
| Hydration gel | Clear H2O | 70-01-1082 | |
| Diet gel | Clear H2O | 72-01-1062 | |
| Buprenorphine | Reckitt and Benckser | 12496-0757-01 | controlled substance |
| Mouse igloos | Bio Serv | K3328, 3570,3327 | |
| Euthanasia cocktail | Euthasol/Virbac | 710101 | controlled substance |
| Analysis | |||
| Live animal imager | Orthoscan | FD Pulse | or equivalent |
| Micro-CT unit and software | Bruker | Skyscan1174 | or equivalent |
| Sealing film/Parafilm M | VWR or Fisher | 100501-338, S37441 | |
| *Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment. | |||
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