Summary
Цель этого протокола заключается в фотохимических вызвать ишемического повреждения в задней зрительного нерва у крыс. Эта модель имеет решающее значение для исследований патофизиологии задней ишемической оптической невропатии и терапевтических подходов для этого и других оптических невропатии, а также другие ЦНС ишемические заболевания.
Abstract
Задняя ишемическая оптическая нейропатия (ПИОН) это зрелище-разрушительной болезни в клинической практике. Тем не менее, его патогенез и естественной истории остались плохо изучены. В последнее время мы разработали надежный, воспроизводимый животную модель пион и проходят лечебный эффект некоторых нейротрофических факторов в этой модели 1. Цель этого видео, чтобы продемонстрировать нашу фотохимических индуцированной модели задней ишемической оптической невропатии, и оценить его последствия с ретроградной маркировки ганглиозных клеток сетчатки. После хирургического воздействия на заднем зрительного нерва, фотосенсибилизирующего красителя, эритрозин В, вводят внутривенно и лазерный луч фокусируют на поверхности глазного нерва. Фотохимические взаимодействия эритрозином В и лазера во время облучения повреждений эндотелия сосудов, вызывая закупорку капилляров, опосредованного тромбоцитами тромбоза и отечной сжатия. В результате ишемического повреждения дает постепенное, но pronouncред сетчатки отмирание клеток ганглия, вследствие потери аксонов вход - в пульте дистанционного управления, травмы, вызванной и клинически значимых исходов. Таким образом, эта модель обеспечивает новый платформу для изучения патофизиологического курс ПИОН, и может быть дополнительно оптимизирован для тестирования терапевтических подходов для оптических невропатии, а также других ЦНС ишемических заболеваний.
Introduction
У пациентов старше 50 лет, ишемическая оптическая нейропатия (ИОН) является наиболее распространенным типом острого оптической нейропатии 2. Состояние может представить, как один из подтипов двух в зависимости от источника питания конкретного пострадавшего крови и клинической картины: передней (AION) или задней (ПИОН) 3. В то время как патогенез и ход AION были изучены 4-7, пиона были плохо понимал, из-за его низкой распространенности, переменная презентации, плохо определенных диагностических критериев и отсутствием модели животных. Кроме того, нет процедуры не были доказаны, чтобы эффективно предотвратить или обратить вспять потерю зрения из AION или пиона. Таким образом, воспроизводимым и надежная модель животное ПИОН имеет большое значение для изучения процесса болезни в естественных условиях и испытания новых терапевтических схем для нейропротекции и регенерации аксонов.
Фотохимических индуцированных ишемического повреждения микрососудов в результате vasogЕНИК отек и тромбоз эффективно создает региональный ишемии тканей 8-12. После инъекции в сосудистую обращении, светочувствительный эритрозин краситель B производит реактивную синглетного молекулярного кислорода при активации лазерного облучения мишеней сосудов. Синглетное кислорода непосредственно peroxidizes эндотелия сосудов, стимулируя тромбоцитов сцепления / агрегации и приводит к окклюзионная образование тромбов. Ишемического повреждения распространяется в соседние районы и усугубляется сжатия микрососудов за счет отека вазогенного. Общая цель этого протокола является фотохимически вызвать ишемию в ретробульбарный зрительного нерва, чтобы отразить ущерб, причиненный пиона.
По нашим сведениям, это первая модель ишемического повреждения в задней зрительного нерва 1. Как эта модель производит ишемию, избегая физическую травму, физиологические процессы задней ишемической оптической невропатии лучше изобразил и учился, Кроме того, эта модель предлагает новый платформу для скрининга кандидатов терапевтических средств для оптических невропатии и других заболеваний ЦНС ишемического. Здесь Подробный протокол бедренной вены катетеризации, зрительного нерва, воздействия внутривенной инъекции эритрозин В и лазерного облучения в модели крысы ПИОН описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены Калифорнийского университета Сан-Диего и Университета Майами институциональной уходу и использованию животных комитетов (IACUC) и осуществляется в соответствии с Заявлением ARVO для использования животных в офтальмологических и визуального исследований. Все реагенты и инструменты, используемые в хирургических процедур являются стерильными.
1. обезболить и подготовка Крыса для хирургии
- Перед процедурой, Крыс анестезируют внутрибрюшинной инъекцией кетамина (60 мг / кг) и ксилазина (8 мг / кг) в зависимости от веса тела. Адекватная глубина анестезии должны определяться отрицательный ответ на носок щепотку стимула.
- После того, как под наркозом, потяните язык вперед, чтобы предотвратить удушье и применять смазочные мази в оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время операции.
- Бритье хирургические сайты, используя машинку для стрижки волос и протрите три раза 10% провидон-йод раствором моющего средства и 70% этанола.
- Пелерина тон животное в стерильной зоне. Стерильные перчатки и хирургические инструменты используются во время операции выживания. Re стерилизации кончики инструментов с использованием горячей шарик стерилизатор между животными.
2. Хирургическое подход
- Индукция ПИОН
- Катетеризация бедренной вены
- Подготовьте и очистите хирургическую сайт. Бритье правильную внутреннюю бедро, используя машинку для стрижки волос и протрите трижды, каждый раз 10% провидон-йод раствором моющего средства и 70% этанола.
- Подготовка трубки. Сокращение 40 см длины полиэтиленовой трубкой (ПЭ 10) стерилизуют в 70% -ном этаноле. Флеш трубки физиологическим раствором и подсоединить его к 1 мл шприц, содержащий предварительно измеренное раствор 2% красителя эритрозин В (1 мг / мкл, получая дозу 20 мг / кг массы тела). Установите шприц в ножного переключателя контролируется инфузионный насос установлен в размере 600 мкл / мин.
- Использование № 15 лезвием, сделать небольшой надрез на горизонтальнуюоснование правого бедра. Вырезать и распространять мембраны внутри и чистый район с стерильные ватные тампоны.
- Отделите мышцы щипцами, пока ветвь бедренной вены не видно. Оболочка окружает артерию, вену и нервы. Pinch и тянуть эту оболочку вверх щипцами (нормально-наконечник Дюмон щипцы) и вырезать небольшой разрез (2-4 мм обычно достаточно) вблизи основания треугольной формы клина с Vännäs весенних ножницами. Развернуть разрез по мере необходимости.
- Отдельные вену и артерию с тупым микрохирургические крюка, параллельном направлению вены. Будьте осторожны, чтобы не повредить нежные мембраны и вены ветви. Затем, осторожно поднимите вены и отделить его от основной соединительной ткани.
- Получить безыгольный нейлона шов и поместить его рядом с бедренной вены. Использование микро-хирургическая крюк, поднять вены и передать тонкой кончик пинцетом под дистальной области. Возьмите один конец нити и вытяните ее подвены. Перевязывать дистального вены плотно. Передать второй шов аналогичным образом в соответствии с проксимальной вены и сделать свободную узел.
- Сделайте небольшой надрез в вену возле дистального лигирования с Vännäs весенних ножницами. Разверните отверстие, как необходимую с тонкой наконечником пинцетом. Некоторые крови может протекать через разрез. Очистите хирургическую область с холодной, стерильной BSS и стерильным ватным тампоном.
- Проведение стенки вены на краю реза, катетер в сосуд с подготовленной физиологическим раствором промыть трубки с помощью иглодержатель. Затянуть ближний узел вокруг вены и трубки. Затем закрепить трубку, привязав его к дальнему шва.
- Проверьте качество катетеризации нажатием ножной переключатель, чтобы ввести физиологический раствор, <1 мл является адекватной. Убедитесь, что трубка свободна и не имеет утечек. Временно закрыть разрез со швами, чтобы защитить катетеризации и ткани.
- Воздействие зрительного нерва
- ДГОе место операции путем протирания предварительно выбритый участок над левым глазом трижды, каждый раз 10% провидон-иод раствором моющего средства и 70% этанола.
- Сделайте надрез по коже 2-3 мм позади глаз с № 15 лезвие. Pinch и поднимите соединительной ткани с зубчатыми щипцами, и сделать небольшой разрез с Vännäs весенних ножницами. Этот небольшой разрез, как правило, около 5 мм в длину, но может быть больше, чтобы обеспечить большую экспозицию для хирурга в обучении. Продолжайте прямо рассекать через ткани по соединительной верхней краю орбитальной кости, заботясь, чтобы избежать нарушения кровеносных сосудов. Очистите хирургическую область с ватными тампонами.
- Проанализируйте вниз через конъюнктиву, пока превосходит прямая мышца не видно. Pinch и анализировать через мышцу; мышцы будут освобождены от глубоко внутри орбиты. Теперь окружающие ткани могут быть использованы, чтобы помочь в отводе и высоты глаза для простоты визуализации.
- Ретракта лоскут кожи и соединительной ткани в поперечном направлении и вниз, и удерживать на месте с шва и кровоостанавливающего. Это будет вращать глаза вперед и наружу для того, чтобы выявить содержанием жира оболочку, которая окружает зрительный нерв.
- Осторожно вставить пару острых щипцов и расширения параллельно зрительного нерва, чтобы отделить соединительной ткани, окружающей оболочку. Не прикасайтесь зрительный нерв с острыми кончиками пинцета.
- Теперь Длина 5 мм зрительного нерва и окружающей оболочки должны быть видны. Сеть микрососудов на поверхности оболочки окружает зрительный нерв. Они будут направлены в процессе лазерного облучения.
- Внутривенное введение эритрозин В и лазерного облучения
- Носите оранжевых защитные очки на все времена во время работы лазерного излучения аппарата, чтобы оградить себя от зеленого лазерного света. Включите лазер, открыть затвор и отрегулируйте пик и средний НАЗRS лазера по мере необходимости. Закройте затвор.
- Расположите крысу в лазерного излучения аппарата. Для обеспечения правильного размещения света, слабый луч направленный производится пространственно фильтрации лазера через отверстие диаметром 100 мкм, пробуренной в закрытом лезвия затвора. Re-подвергайте зрительный нерв с парой тонких щипцов наконечник, и положение прицеливания луча на внутриорбитального зрительного нерва между 3 мм и 4 мм позади зрительного нерва.
- Вводят раствор 2% эритрозин В с помощью активации инфузионного насоса. Это может циркулировать в течение нескольких секунд, пока хирург добавляет небольшую каплю BSS, чтобы увлажнить поверхность зрительного нерва.
- Проверьте положение прицельной луча, а затем нажмите ножной выключатель, чтобы начать облучение. Обеспечением безопасности фильтр оранжевого цвета, который добавляется в оптическом пути микроскопом, будет немедленно срабатывает последовало открытие затвора с задержкой в 1 сек.
- Облучают зрительный нерв для 90 сек с максимальной мощностью 135mW и средней мощности 18mW создается пучком вертолет вращающейся на 250 Гц с рабочим циклом 15% (это сводит к минимуму тепловые эффекты). Желтый флуоресценции, визуализируется как ярко-оранжевого через фильтр безопасности, будут, излучаемый из верхней поверхности зрительного нерва и достаточно, чтобы гарантировать, что луч облучает нерв симметрично.
- После облучения, фильтр безопасности оранжевого цвета откроется автоматически. Microhemorrhage можно наблюдать в некоторых случаях.
- Сбросьте сцепление на дополнительных глазных мышц и вернуть глаза в нейтральное положение. Закрыть разрез с узловыми швами. Затем снять катетер и галстук бедренную вену плотно, чтобы предотвратить утечку; закрыть с узловыми швами. Применять мазь с антибиотиком для обеих разрезов. Проверьте глазного дна для проверки целостности сосудов центральной вены сетчатки и артерии.
- Катетеризация бедренной вены
- Ретроградная Маркировкаганглиозных клеток сетчатки (РГК). Примечание: Для того, чтобы оценить RGC выживание, ретроградной маркировки с fluorogold (FG) должен быть завершен за неделю до пиона. Метод подробно описан в протоколе JOVE 819 13.
- Вкратце: анестезию животного кетамином (60 мг / кг) и ксилазина (8 мг / кг) и брить голову.
- Хирургическим скраб разрез сайт и сделать срединный разрез по голове, чтобы выставить череп.
- Дрель двусторонние отверстия в черепе (O 2x2 мм) 0,5 мм с обеих сагиттальной и поперечной швов.
- Тщательно аспирата мозговой контент, который лежит на спинной поверхности двухолмия (СК) с помощью вакуумного насоса. Затем поместите небольшой кусочек Gelfoam смоченную 4% FG на поверхности КА.
- Закрыть разрез со швами и уход за животным с помощью стандартного послеоперационный уход.
- Послеоперационный уход и Эвтаназия
- После операции, поместите животное в отдельной клетке чистой на вершине рециркуляции нагретая вода площадку, пока животное не будет восстановлен.
- Послеоперационные анальгетики (бупренорфин HCl, 0,01 мг / кг) следует вводить два раза в день в течение трех последовательных дней, чтобы минимизировать дискомфорт.
- Крыса должна быть храниться отдельно и наблюдали, пока они не в состоянии поддерживать грудины лежачее положение и восстановить достаточно сознание.
- Признаки восстановления и здоровья не контролируется ежедневно в течение по крайней мере 5 дней после операции, или до тех пор, снятия швов и адекватного исцеления хирургической сайте, что наступит позднее.
- Усыпить животных от перфузии с 4% PFA на научно обоснованных временных точках после операции в соответствии с следственного интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В результате ишемического повреждения индуцируется этой техники дает постепенное, но выраженное смерть ганглиозных клеток сетчатки после ишемического повреждения аксонов. Это клинически значимых результат аналогичен тому, что наблюдается в человеческих болезней. Ф. ретроградной маркировки используется для количественной оценки ГКС выживаемость после пиона. Этот же метод используется для проверки успешного создания модели, а также для оценки влияния различных терапевтических схем. Рисунок 1 показывает репрезентативные конфокальной образы ФГ-позитивных клеток в сетчатке плоских опорах из управления (рис 1А), обман обращению (лазерная только / не эритрозин В, 1В), и через 2 недели после ПИОН-не лечить (рис 1в) животных. По сравнению с контрольными животными, меньше FG-позитивных клеток, присутствуют в животных через 2 недели после индукции пиона. Нет существенной разницы между числом РСК в управления и ложной обработке (лазерного только / нет эритрозин В) животных не наблюдается. Тхис означает, что пион-индуцированной потери RGC вызываетс комбинацией эритрозин В и лазерного облучения, а не тепловой энергии от лазера в покое.
Рисунок 1. сетчатки ганглиозных клеток (РГК) выживаемость после задней ишемической оптической нейропатии (пиона). Ганглиозных клеток сетчатки ретроградно меченные Fluorogold были обследованы сетчатки плоских опорах (переменного тока). Через две недели после ПИОН, такое же количество РГК наблюдается в контроле (А) и мнимой лечение (B, лазерная только / не эритрозин B) глаза. Тем не менее, количество fluorogold меченных РГК заметно снижается в условиях пион (C). Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенное Versioн этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы в долгу перед Eleut Эрнандес для животноводства, Гейб Gaidosh для микроскопии экспертизы, и Khue Tran и Zhenyang Чжао для редактирования видео. Это исследование было профинансировано Национальным институтом глаз предоставляет R01-EY022129 в JLG и P30 грантов EY022589 к UCSD и EY014801 к UM; Американская ассоциация сердца, Джеймс и Эстер Король, Фонд докторант программа обмена фонд университета Фудань Высшей школы (№ 2010033), а также неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532-nm Nd:YAG laser | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| Beam chopper | custom-made | custom-made | |
| Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25-cm focal length spherical lens | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating |
| Erythrosin B | MP Biomedicals | 190449 | |
| Fluorogold | Fluorochrome,LLC | ||
| Gelfoam | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| Polyethylene tubing (PE10) | BD Intramedic | 427400 | |
| No. 10 Blade | Miltex | 4-110 | |
| Fine Forceps | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 rustless non-magnetic |
| Forceps with Teeth | F.S.T. | 11153-10 | Germany stainless |
| Forceps | F.S.T. | 18025-10 | Germany stainless |
| Vannas spring scissors | F.S.T. | 2-220 | JJECK Stainless |
| Polyglactin suture | Ethicon | J488G | 7-0 suture |
| hemostat | F.S.T. | 12075-12 | Germany stainless |
References
- Wang, Y., Brown, D. P. Jr, Duan, Y., Kong, W., Watson, B. D., Goldberg, J. L. A novel rodent model of posterior ischemic optic neuropathy. JAMA Ophthalmology. 131, 194-204 (2013).
- Rucker, J. C., Biousse, V., Newman, N. J. Ischemic optic neuropathies. Curr Opin Neurol. 17, 27-35 (2004).
- Hayreh, S. S. Posterior ischaemic optic neuropathy: clinical features, pathogenesis, and management. Eye (Lond). 18, 1188-1206 (2004).
- Hayreh, S. S. Inter-Individual Variation in Blood-Supply of the Optic-Nerve Head. Doc Ophthalmol. 59, 217-246 (1985).
- Jacobson, D. M., Vierkant, R. A., Belongia, E. A. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy - A case-control study of potential risk factors. Arch Ophthalmol-Chic. 115, 1403-1407 (1997).
- Kosmorsky, G., Straga, J., Knight, C., Dagirmanjian, A., Davis, D. A. The role of transcranial Doppler in nonarteritic ischemic optic neuropathy. Am J Ophthalmol. 126, 288-290 (1998).
- Hayreh, S. S., Zimmerman, M. B. Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy: role of systemic corticosteroid therapy. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 246, 1029-1046 (2008).
- Prado, R., Dietrich, W. D., Watson, B. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically Induced Graded Spinal-Cord Infarction - Behavioral, Electrophysiological, and Morphological Correlates. J Neurosurg. 67, 745-753 (1987).
- Dietrich, W. D., Busto, R., Watson, B. D., Scheinberg, P., Ginsberg, M. D. Photochemically induced cerebral infarction. II. Edema and blood-brain barrier disruption. Acta Neuropathologica. 72, 326-334 (1987).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Watson, B. D. Animal models of photochemically induced brain ischemia and stroke. Cerebrovascular Disease - Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. , 52-73 (1998).
- Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Research. 367, 296-300 (1986).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
