Summary
L'obiettivo di questo protocollo è di indurre fotochimicamente danno ischemico al nervo ottico posteriore, nel ratto. Questo modello è fondamentale per gli studi di fisiopatologia della posteriore, neuropatia ottica ischemica, e approcci terapeutici per questa e altre neuropatie ottiche, così come di altre malattie ischemiche del sistema nervoso centrale.
Abstract
Posteriore neuropatia ottica ischemica (PION) è una vista devastante malattia nella pratica clinica. Tuttavia, la sua patogenesi e la storia naturale sono rimasti poco conosciuti. Recentemente, abbiamo sviluppato un affidabile modello riproducibile di PION animale e testato l'effetto del trattamento di alcuni fattori neurotrofici in questo modello 1. Lo scopo di questo video è quello di dimostrare il nostro modello di fotochimica indotta posteriore neuropatia ottica ischemica, e di valutare i suoi effetti con marcatura retrograda di cellule gangliari della retina. Dopo l'esposizione chirurgica del nervo ottico posteriore, un colorante fotosensibilizzante, Eritrosina B, viene iniettato per via endovenosa e un fascio laser viene focalizzato sulla superficie del nervo ottico. Interazione fotochimico di Eritrosina B e il laser durante danni irradiazione vascolare, spingendo microvascolare occlusione mediata da trombosi delle piastrine e compressione edematosa. La risultante danno ischemico produce una graduale ma pronounccato retina deperimento delle cellule gangliari, a causa di una perdita di ingresso assonale - un telecomando, lesioni indotte e l'esito clinicamente rilevante. Pertanto, questo modello fornisce una nuova piattaforma per studiare il corso fisiopatologico PION, e può essere ulteriormente ottimizzata per testare approcci terapeutici per neuropatie ottiche così come altre malattie ischemiche del SNC.
Introduction
Nei pazienti oltre 50 anni di età, la neuropatia ottica ischemica (ION) è il tipo più diffuso di ottica acuta Neuropatia 2. La condizione può presentarsi come una delle due sottotipi in base alla fonte di approvvigionamento specifico colpita di sangue e la presentazione clinica: anteriore (Aion) o posteriore (PION) 3. Mentre la patogenesi e corso di AION sono stati studiati approfonditamente 4-7, PION è rimasta poco conosciuta a causa della sua bassa prevalenza, presentazione variabili, criteri diagnostici mal definite e la mancanza di un modello animale. Inoltre, nessun trattamento hanno dimostrato di prevenire o invertire la perdita della vista da AION o PION efficace. Pertanto, un modello riproducibile e affidabile di PION animale è di grande valore per studiare il processo di malattia in vivo e sperimentare nuovi regimi terapeutici per la neuroprotezione e la rigenerazione degli assoni.
Fotochimica indotto danno ischemico al microcircolo con conseguente vasogENIC edema e trombosi crea effettivamente tessuto regionale ischemia 8-12. Dopo l'iniezione in circolo vascolare, il colorante fotosensibile Eritrosina B produce reattive dell'ossigeno molecolare singoletto in seguito ad attivazione mediante irradiazione laser dei vasi bersaglio. L'ossigeno singoletto peroxidizes direttamente l'endotelio vascolare, stimolando piastrinica aderenza / aggregazione e che porta alla formazione del trombo occlusivo. Danno ischemico è diffuso in aree limitrofe e ulteriormente aggravata dalla compressione microvascolare causa vasogenico. L'obiettivo generale di questo protocollo è di indurre fotochimica ischemia nel nervo ottico retrobulbare per rispecchiare i danni causati da PION.
A nostra conoscenza, questo è il primo modello di danno ischemico nel posteriore del nervo ottico 1. Dato che questo modello produce ischemia evitando traumi fisici, i processi fisiologici di neuropatia ottica ischemica posteriore sono migliori imitato e studiato. Inoltre, questo modello offre una nuova piattaforma per lo screening di terapie candidati neuropatie ottiche e altre malattie ischemiche del SNC. Qui, un protocollo dettagliato per cateterizzazione femorale della vena, l'esposizione del nervo ottico, l'iniezione endovenosa di Eritrosina B e radiazione laser in un modello di ratto PION sono descritti.
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Protocol
Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla University of California di San Diego e dell'Università di Miami la cura degli animali istituzionale e comitati uso (IACUC) ed eseguiti in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva. Tutti i reagenti e strumenti utilizzati nelle procedure chirurgiche sono sterili.
1. Anestetizzare e Preparare il ratto di Chirurgia
- Prima procedura, i ratti vengono anestetizzati con una iniezione intraperitoneale di ketamina (60 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg) secondo il peso corporeo. Un'adeguata profondità dell'anestesia deve essere determinata da una risposta negativa a pizzico piedi stimolo.
- Una volta anestetizzato, tirare la lingua in avanti per evitare l'asfissia e applicare lubrificante pomata per entrambi gli occhi per evitare l'essiccazione delle cornee durante l'intervento chirurgico.
- Shave i siti chirurgici con un tagliatore di capelli e pulire la zona tre volte con il 10% soluzione detergente Providone-iodio e il 70% di etanolo.
- Drape tegli animali all'interno di un campo sterile. Guanti sterili e strumenti chirurgici vengono utilizzati durante l'intervento chirurgico la sopravvivenza. Re-sterilizzare le punte di strumenti utilizzando uno sterilizzatore tallone caldo tra gli animali.
2. approccio chirurgico
- Induzione PION
- Cateterizzazione vena femorale
- Preparare e pulire il sito chirurgico. Radere l'interno coscia destra con un tagliatore di capelli e pulire la zona tre volte ciascuno con il 10% soluzione detergente Providone-iodio e il 70% di etanolo.
- Preparate il tubo. Tagliare una lunghezza 40 centimetri di tubo in polietilene (PE 10) sterilizzati in etanolo al 70%. Lavare il tubo con soluzione salina e collegarlo ad una siringa da 1 ml contenente una soluzione pre-misurata del 2% Eritrosina B tintura (1 ml / mg, ottenendo una dose di 20 mg / kg di peso corporeo). Montare la siringa in una pompa per infusione pedale controllato impostato su una portata di 600 ml / min.
- Utilizzando una lama No. 15, una piccola incisione orizzontalela base della coscia destra. Tagliare e diffondere la membrana interna e pulire l'area con tamponi di cotone sterili.
- Separare il muscolo con una pinza fino a quando il ramo della vena femorale è visibile. Una guaina circonda l'arteria, vena e nervo. Pinch e tirare questa guaina verso l'alto con una pinza (pinza sottile punta Dumont), e tagliare una piccola incisione (2-4 mm è di solito adeguata) vicino alla base del cuneo triangolare con le forbici a molla Vännäs. Espandere il taglio, se necessario.
- Separare la vena e arteria con un ottuso micro-chirurgica gancio parallelamente alla direzione della vena. Fare attenzione a non danneggiare i delicati di membrana e vena rami. Poi, sollevare delicatamente la vena e separarlo dal tessuto connettivo sottostante.
- Ottenere una sutura in nylon senza ago e posizionarlo vicino alla vena femorale. Utilizzando il gancio micro-chirurgica, elevare la vena e passare il forcipe fine-tip di sotto della regione distale. Afferrare una estremità della sutura e tirarla sotto ilvena. Legare la vena distale ermeticamente. Passare una seconda sutura in modo simile sotto la vena prossimale e fare un nodo allentato.
- Fare un piccolo taglio nella vena vicino alla legatura distale con le forbici a molla Vännäs. Espandere il foro ove necessario con le pinze fine-tip. Alcuni sangue può fuoriuscire attraverso il taglio. Pulire l'area chirurgica con il freddo, BSS sterile e tamponi di cotone sterili.
- Tenendo la parete venosa sul bordo del taglio, cateterizzarla il vaso con il tubo salina-lavato preparata utilizzando un supporto dell'ago. Stringere il nodo prossimale intorno alla vena e il tubo. Poi, ancorare il tubo legandola alla sutura distale.
- Controllare la qualità della cateterizzazione premendo il pedale per iniettare salina, <1 ml è sufficiente. Assicurarsi che il tubo è libera e non ha perdite. Temporaneamente chiudere l'incisione con punti di sutura per proteggere la cateterizzazione e tessuti.
- L'esposizione del nervo ottico
- Prepare il sito chirurgico pulendo la zona di pre-rasato sopra l'occhio sinistro tre volte ciascuno con il 10% soluzione detergente Providone-iodio e il 70% di etanolo.
- Fare un'incisione lungo la pelle 2-3 mm dietro l'occhio con una lama n ° 15. Pinch e sollevare il tessuto connettivo con una pinza dentata, e fare una piccola incisione con le forbici a molla Vännäs. Questa piccola incisione è generalmente di circa 5 mm di lunghezza, ma può essere più lungo per garantire una maggiore esposizione per un chirurgo in formazione. Continuare a sezionare senza mezzi termini attraverso il tessuto connettivo lungo il bordo superiore dell'osso orbitale, avendo cura di evitare di interrompere i vasi sanguigni. Pulire l'area chirurgica con tamponi di cotone.
- Sezionare verso il basso attraverso la congiuntiva fino al muscolo retto superiore è visibile. Pinch e sezionare attraverso il muscolo; il muscolo verrà liberato dal profondo all'interno dell'orbita. Ora, tessuti circostanti possono essere utilizzati per facilitare la retrazione e l'elevazione dell'occhio per facilità di visualizzazione.
- RiTratto il lembo di pelle e del tessuto connettivo lateralmente e verso il basso, e tenere in posizione con una sutura e emostatico. Questo ruoterà l'occhio in avanti e verso l'esterno al fine di rivelare la guaina contenente grassi che circonda il nervo ottico.
- Inserire con precauzione un paio di pinze taglienti ed espandere parallelamente al nervo ottico per separare il tessuto connettivo circostante la guaina. Non toccare il nervo ottico con i forti punte della pinza.
- Una lunghezza di 5 mm dal nervo ottico e guaina circostante dovrebbe essere visibile. Una rete di microvasi sulla superficie della guaina circonda il nervo ottico. Queste borse saranno durante l'irraggiamento laser.
- L'iniezione endovenosa di Eritrosina B e irraggiamento laser
- Indossare color arancio occhiali di sicurezza in ogni momento durante il funzionamento dell'apparato irraggiamento laser per proteggere se stessi dalla luce laser verde. Accendere il laser, aprire l'otturatore e regolare il picco e powe mediars del laser come necessario. Chiudere l'otturatore.
- Posizionare il ratto nell'apparato irradiazione laser. Per garantire il corretto posizionamento del fascio, un fascio di puntamento debole è prodotto dalla spazialmente filtrando il laser attraverso un foro 100 micron di diametro praticato nella lama otturatore chiuso. Ri-esporre il nervo ottico, con un paio di pinze punta fine, e posizionare il fascio di puntamento sul nervo ottico intraorbitario compreso tra 3 mm e 4 mm dietro la testa del nervo ottico.
- Iniettare la soluzione di 2% Eritrosina B attraverso l'attivazione della pompa di infusione. Si può circolare per alcuni secondi mentre il chirurgo aggiunge una piccola goccia di BSS per inumidire la superficie del nervo ottico.
- Verificare la posizione del fascio di puntamento e quindi fare clic sul pedale per avviare irradiazione. Un filtro di sicurezza di colore arancio, che viene aggiunto nel percorso ottico del microscopio, sarà immediatamente innescato seguita l'apertura dell'otturatore dopo un ritardo 1 sec.
- Irradiare il nervo ottico per 90 sec con una potenza di picco di 135 MW e potenza media di 18mW prodotta da un chopper raggio rotante a 250 Hz con un duty cycle del 15% (questo minimizza gli effetti termici). Fluorescenza gialla, visualizzata come arancione attraverso il filtro di sicurezza, viene emesso dalla superficie superiore del nervo ottico ed è sufficiente a garantire che il raggio irradia il nervo simmetricamente.
- Dopo l'irradiazione, il filtro di sicurezza di colore arancione si aprirà automaticamente. Microhemorrhage può essere osservata in alcuni casi.
- Scaricare la trazione sui muscoli oculari extra e ritorno l'occhio ad una posizione neutra. Chiudere l'incisione con punti staccati. Poi ritirare il catetere e legare la vena femorale strettamente per evitare perdite; chiudere con punti staccati. Applicare pomata antibiotica a entrambe incisioni. Controllare il fondo per verificare l'integrità vascolare della vena retinica centrale e arteria.
- Cateterizzazione vena femorale
- Etichettatura retrogradadi cellule gangliari della retina (RGCs.) Nota: Al fine di valutare la sopravvivenza RGC, marcatura retrograda con fluorogold (FG) dovrebbe essere completata una settimana prima PION. Il metodo è descritto in dettaglio nel protocollo JOVE 819 13.
- In breve: anestetizzare l'animale con ketamina (60 mg / kg) e xilazina (8 mg / kg) e radere la testa.
- Chirurgicamente fregare il sito di incisione e fare una incisione mediana attraverso la testa per esporre il cranio.
- Praticare fori bilaterali attraverso il cranio (ø 2x2 mm) 0,5 millimetri da entrambi i punti di sutura sagittale e trasverso.
- Con attenzione aspirare il contenuto cerebrale che si trova sulla superficie dorsale del collicolo superiore (SC) utilizzando una pompa a vuoto. Poi, mettere un piccolo pezzo di Gelfoam imbevuto di 4% FG sulla superficie del SC.
- Chiudere l'incisione con punti di sutura e la cura per l'animale con cura postoperatoria standard.
- Cure post-operatorie e l'eutanasia
- Dopo l'intervento chirurgico, collocare animale in una gabbia pulita separata in cima ad un ricircolo riscaldato pad acqua finché l'animale viene recuperato.
- Analgesici post-chirurgiche (buprenorfina cloridrato, 0,01 mg / kg) deve essere somministrato due volte al giorno per tre giorni consecutivi per ridurre al minimo il disagio.
- Rat deve essere tenuto separato e osservato fino a quando sono in grado di mantenere decubito sternale e riprendere conoscenza sufficiente.
- Segnali di ripresa e di buona salute sono monitorati ogni giorno per almeno 5 giorni dopo l'intervento chirurgico, o fino a quando la rimozione di sutura e la guarigione adeguata del sito chirurgico, a seconda di quale si verifica più recente.
- Eutanasia gli animali di perfusione con il 4% PFA ai scientificamente appropriati punti di tempo dopo l'intervento chirurgico in base agli interessi investigativo.
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Representative Results
Il danno ischemico conseguente indotto da questa tecnica produce una morte graduale ma pronunciato di cellule gangliari della retina dopo una lesione ischemica assone. Questo è un risultato clinicamente rilevante simile a quella osservata nella malattia umana. FG marcatura retrograda viene utilizzato per quantificare la sopravvivenza RGC dopo PION. Lo stesso metodo è utilizzato per convalidare un creazione del modello di successo, nonché per valutare gli effetti di differenti regimi terapeutici. La Figura 1 mostra immagini rappresentative confocale di cellule FG-positivi in supporti piatti della retina da controllo (Figura 1A), sham-trattati (laser solo / no Eritrosina B, Figura 1B), e 2 settimane dopo la PION-trattati (Figura 1C) animali. Rispetto a animali di controllo, meno cellule FG-positive sono presenti in animali 2 settimane dopo l'induzione PION. Nessuna differenza significativa tra il numero di RGCs nel controllo e sham-trattati (laser solo / no Eritrosina B) gli animali si osserva. This indica che la perdita RGC PION indotta è suscitato dalla combinazione di Eritrosina B e irraggiamento laser, invece di energia termica dal laser solo.
Figura 1. cellule gangliari della retina (RGC) la sopravvivenza dopo posteriore neuropatia ottica ischemica (pione). Cellule gangliari della retina retrogrado etichettati con Fluorogold sono state visualizzate con supporti piatti della retina (AC). Due settimane dopo PION, un numero simile di RGCs si osserva nel controllo (A) e sham trattati (B, laser solo / no Eritrosina B) occhi. Tuttavia, il numero di RGCs fluorogold marcato è marcatamente ridotta nel contesto di PION (C). Barra di scala = 100 micron. Cliccate qui per visualizzare un versio più granden di questa figura.
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Acknowledgments
Siamo in debito con Eleut Hernandez per la zootecnia, Gabe Gaidosh per competenza microscopia, e Khue Tran e Zhenyang Zhao per l'editing video. Questo studio è stato finanziato dal National Eye Institute concede R01-EY022129 a JLG e sovvenzioni P30 EY022589 a UCSD e EY014801 a UM; l'American Heart Association, la Fondazione James e Ester Re, il fondo del programma di scambio di studenti di dottorato di Fudan University Graduate School (n ° 2.010.033), e una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532-nm Nd:YAG laser | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| Beam chopper | custom-made | custom-made | |
| Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25-cm focal length spherical lens | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating |
| Erythrosin B | MP Biomedicals | 190449 | |
| Fluorogold | Fluorochrome,LLC | ||
| Gelfoam | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| Polyethylene tubing (PE10) | BD Intramedic | 427400 | |
| No. 10 Blade | Miltex | 4-110 | |
| Fine Forceps | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 rustless non-magnetic |
| Forceps with Teeth | F.S.T. | 11153-10 | Germany stainless |
| Forceps | F.S.T. | 18025-10 | Germany stainless |
| Vannas spring scissors | F.S.T. | 2-220 | JJECK Stainless |
| Polyglactin suture | Ethicon | J488G | 7-0 suture |
| hemostat | F.S.T. | 12075-12 | Germany stainless |
References
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