Medicine

Rata Modelo de neuropatía óptica isquémica posterior inducida por Fotoquímicamente

Published: November 29, 2015 doi: 10.3791/52402

Yan Wang^1,3,4, Dale P. Brown¹, Brant D. Watson², Jeffrey L. Goldberg^1,3

¹Bascom Palmer Eye Institute, University of Miami Miller School of Medicine, ²Departments of Neurology and Biomedical Engineering, University of Miami Miller School of Medicine, ³Shiley Eye Center, University of California, ⁴Department of Ophthalmology and Vision Science, Fudan University

Summary

El objetivo de este protocolo es inducir fotoquímicamente lesión isquémica en el nervio óptico posterior, en la rata. Este modelo es fundamental para los estudios de la fisiopatología de la neuropatía óptica isquémica posterior, y los enfoques terapéuticos para esta y otras neuropatías ópticas, así como de otras enfermedades isquémicas del SNC.

Abstract

Neuropatía óptica isquémica posterior (PION) es una enfermedad devastadora vista en la práctica clínica. Sin embargo, su patogénesis y la historia natural han permanecido poco conocidos. Recientemente, hemos desarrollado un modelo animal fiable, reproducible de PION y probamos el efecto del tratamiento de algunos factores neurotróficos en este modelo ^1. El propósito de este video es demostrar nuestro modelo fotoquímica inducida de la neuropatía óptica isquémica posterior, y para evaluar sus efectos con el etiquetado retrógrada de las células ganglionares de la retina. Después de la exposición quirúrgica del nervio óptico posterior, un colorante fotosensibilizante, eritrosina B, se inyecta por vía intravenosa y un haz de láser se enfoca sobre la superficie del nervio óptico. Interacción fotoquímica de eritrosina B y el láser durante daños irradiación del endotelio vascular, lo que provocó la oclusión microvascular mediada por trombosis plaquetaria y la compresión edematosa. La lesión isquémica resultante produce una gradual pero pronounced muerte regresiva de células ganglionares de la retina, debido a una pérdida de entrada axonal - un mando a distancia, lesión inducida y el resultado clínicamente relevante. Por lo tanto, este modelo proporciona una nueva plataforma para estudiar el curso fisiopatológico de PION, y puede optimizarse aún más para probar enfoques terapéuticos para las neuropatías ópticas, así como otras enfermedades isquémicas del SNC.

Introduction

En pacientes mayores de 50 años, la neuropatía óptica isquémica (ION) es el tipo más frecuente de neuropatía óptica aguda ^2. La condición puede presentarse como uno de los dos subtipos de acuerdo con la fuente de suministro específica afectada sangre y la presentación clínica: anterior (AION) o posterior (PION) ^3. Aunque la patogénesis y el curso de AION se han estudiado ampliamente ^4-7, PION ha quedado mal entendido debido a su baja prevalencia, presentación variables, criterios diagnósticos mal definidos y la falta de un modelo animal. Por otra parte, no hay tratamientos se han demostrado para prevenir o revertir la pérdida de la visión de AION o PION eficacia. Por lo tanto, un modelo animal reproducible y fiable de PION es de gran valor para estudiar el proceso de la enfermedad in vivo y probar nuevos regímenes terapéuticos para la neuroprotección y la regeneración del axón.

Fotoquímicamente inducida lesión isquémica a la microvasculatura resultando en vasogedema enic y trombosis crea efectivamente isquemia tisular regional ^08.12. Después de la inyección en la circulación vascular, el tinte fotosensible eritrosina B produce reactiva de oxígeno molecular singlete tras la activación por irradiación con láser de los vasos diana. El oxígeno singlete peroxidizes directamente el endotelio vascular, estimular la adherencia de plaquetas / agregación y que conduce a la formación de trombos oclusivos. Daño isquémico se extendió a las zonas vecinas y aún más exacerbada por la compresión microvascular debido al edema vasogénico. El objetivo general de este protocolo es inducir fotoquímicamente isquemia en el nervio óptico retrobulbar para reflejar el daño causado por PION.

Para nuestro conocimiento, este es el primer modelo de lesión isquémica en el nervio óptico posterior ^1. Como este modelo produce isquemia evitando al mismo tiempo el trauma físico, los procesos fisiológicos de la neuropatía óptica isquémica posterior son mejores imitaban y estudiados. Además, este modelo ofrece una nueva plataforma para la detección de agentes terapéuticos candidatos para neuropatías ópticas y otra enfermedad isquémica del SNC. Aquí, un protocolo detallado para la cateterización de la vena femoral, la exposición del nervio óptico, la inyección intravenosa de la eritrosina B y la irradiación con láser en un modelo de rata PION se describen.

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Protocol

Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Universidad de California en San Diego y la Universidad de Miami cuidado de los animales institucional y comités uso (IACUC) y realizan de acuerdo con la Declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica e Investigación Visual. Todos los reactivos e instrumentos utilizados en procedimientos quirúrgicos son estériles.

1. Anestesiar y Preparar la Rata de Cirugía

Antes del procedimiento, las ratas se anestesiaron con una inyección intraperitoneal de ketamina (60 mg / kg) y xilazina (8 mg / kg) de acuerdo con el peso corporal. Profundidad adecuada de la anestesia debe ser determinada por una respuesta negativa a los estímulos pizca dedo del pie.
Una vez anestesiado, tire de la lengua hacia adelante para evitar la asfixia y aplicar lubricante pomada para ambos ojos para evitar el secado de las córneas durante la cirugía.
Afeitarse los sitios quirúrgicos utilizando una cortadora de cabello y limpie el área tres veces con solución de detergente-yodo providona 10% y 70% de etanol.
Drape tque los animales dentro de un campo estéril. Guantes estériles e instrumentos quirúrgicos se utilizan durante la cirugía supervivencia. Vuelva a esterilizar la punta de los instrumentos utilizando un esterilizador de cuentas en caliente entre los animales.

2. Enfoque Quirúrgico

PION inducción
1. Cateterismo vena femoral
  1. Preparar y limpiar el lugar de la cirugía. Afeitarse la cara interna del muslo derecho utilizando una cortadora de cabello y limpie el área tres veces cada uno con una solución de detergente providona yodo 10% y 70% de etanol.
  2. Preparar la tubería. Cortar una longitud de 40 cm de tubo de polietileno (PE 10) esterilizados en etanol al 70%. Enjuague el tubo con solución salina y conectarlo a una jeringa de 1 ml que contiene una solución previamente medida de colorante eritrosina B 2% (1 l / mg, produciendo una dosis de 20 mg / kg de peso corporal). El montaje de jeringa en una bomba de infusión pies interruptor controlado ajustado a una velocidad de 600 l / min.
  3. Usar una hoja No. 15, hacer una pequeña incisión horizontal enla base del muslo derecho. Cortar y separar la membrana interior y limpiar el área con hisopos de algodón estériles.
  4. Separar el músculo con pinzas hasta que la rama de la vena femoral es visible. Una vaina rodea la arteria, vena y el nervio. Apriete y tire de esta vaina hacia arriba con fórceps (pinzas de punta fina Dumont), y cortar una pequeña incisión (2.4 mm es generalmente adecuado) cerca de la base de la cuña de forma triangular con tijeras de primavera Vannas. Expandir el corte si es necesario.
  5. Separar la vena y la arteria con un micro-quirúrgica gancho romo paralelo a la dirección de la vena. Tenga cuidado de no dañar las membranas y las venas delicadas ramas. Luego, levante suavemente la vena y separarlo del tejido conectivo subyacente.
  6. Obtenga una sutura de nylon sin aguja y colocarla junto a la vena femoral. Usando el gancho micro-quirúrgica, eleve la vena y pasar las pinzas de punta fina debajo de la región distal. Coge un extremo de la sutura y tire de ella debajo de lavena. Ligar la vena distal con fuerza. Pasar una segunda sutura de una manera similar en virtud de la vena proximal y hacer un nudo flojo.
  7. Hacer un pequeño corte en la vena cerca de la ligadura distal con tijeras de primavera Vannas. Ampliar el agujero como sea necesario con las pinzas de punta fina. Algunos sangre puede filtrarse a través del corte. Limpie el área quirúrgica con, BSS estéril frío y bastoncillos de algodón estériles.
  8. Sosteniendo la pared de la vena en el borde del corte, cateterizar el recipiente con el tubo de solución salina enrojecida preparado usando un soporte de aguja. Apriete el nudo proximal alrededor de la vena y la tubería. Entonces, anclar la tubería al vincularlo a la sutura distal.
  9. Compruebe la calidad de la cateterización presionando el interruptor de pie para inyectar solución salina, <1 ml es adecuada. Asegúrese de que el tubo no está obstruido y no tiene fugas. Temporalmente cerrar la incisión con puntos de sutura para proteger el cateterismo y el tejido.
2. La exposición del nervio óptico
  1. Prepare la zona quirúrgica limpiando la zona de pre-afeitado encima del ojo izquierdo tres veces cada uno con una solución de detergente providona yodo 10% y 70% de etanol.
  2. Hacer una incisión a lo largo de la piel 2-3 mm detrás del ojo con una cuchilla No. 15. Apriete y levante el tejido conectivo con pinzas dentadas, y hacer una pequeña incisión con tijeras de primavera Vannas. Esta pequeña incisión es generalmente cerca de 5 mm de longitud, pero puede ser más largo para proporcionar una mayor exposición para un cirujano en formación. Continuar para diseccionar sin rodeos a través del tejido conectivo a lo largo del borde superior del hueso orbital, teniendo cuidado de evitar la interrupción de los vasos sanguíneos. Limpie el área quirúrgica con hisopos de algodón.
  3. Diseccionar hacia abajo a través de la conjuntiva hasta que el músculo recto superior es visible. Pinch y diseccionar a través del músculo; el músculo se liberará de las profundidades de la órbita. Ahora, los tejidos circundantes se pueden utilizar para ayudar en la retracción y la elevación del ojo para la facilidad de visualización.
  4. ReTracto el colgajo de piel y tejido conjuntivo lateralmente y hacia abajo, y mantenga en su lugar con una sutura y hemostasia. Esto hará girar el ojo hacia adelante y hacia el exterior a fin de revelar la vaina que contiene grasa que rodea el nervio óptico.
  5. Con cuidado, inserte un par de pinzas cortantes y ampliar paralelo al nervio óptico para separar el tejido conectivo que rodea la vaina. No toque el nervio óptico con las afiladas puntas de las pinzas.
  6. Una longitud de 5 mm del nervio óptico y la vaina que rodea ahora debe ser visible. Una red de microvasos en la superficie vaina rodea el nervio óptico. Estos se orientarán durante la irradiación láser.
3. La inyección intravenosa de Eritrosina B y la irradiación láser
  1. Use gafas de seguridad de color naranja-en todo momento durante el funcionamiento del aparato de irradiación láser para protegerte de la luz láser verde. Encienda el láser, abrir el obturador y ajustar el pico y powe promediors del láser según sea necesario. Cierre el obturador.
  2. Coloque la rata en el aparato de irradiación con láser. Para asegurar la colocación de haz adecuado, un haz de encuadre débil es producida por espacialmente filtrar el láser a través de un agujero de 100 m de diámetro perforados en la hoja del obturador cerrado. Re-exponer el nervio óptico con un par de pinzas de punta fina, y posicionar el haz de puntería sobre el nervio óptico intraorbitario entre 3 mm y 4 mm detrás de la cabeza del nervio óptico.
  3. Se inyecta la solución de 2% eritrosina B través de la activación de la bomba de infusión. Se puede circular durante unos segundos mientras el cirujano añade una pequeña gota de BSS para humedecer la superficie del nervio óptico.
  4. Verifique la posición del haz de encuadre y haga clic en el interruptor de pie para iniciar la irradiación. Un filtro de seguridad de color naranja, que se añade en la trayectoria óptica del microscopio, se desencadenó inmediatamente seguido por la apertura del obturador después de un retardo de 1 seg.
  5. Irradiar el nervio óptico para 90 seg con una potencia pico de 135MW y potencia media de 18MW producida por un haz de chopper que gira a 250 Hz con un ciclo de trabajo de 15% (esto minimiza los efectos térmicos). Fluorescencia amarilla, visualizado como naranja brillante a través del filtro de seguridad, será emitida desde la superficie superior del nervio óptico y es suficiente para asegurar que el haz irradia el nervio simétricamente.
  6. Después de la irradiación, el filtro de seguridad de color naranja se abrirá automáticamente. Microhemorragias se puede observar en algunos casos.
  7. Aliviar la tracción sobre los músculos extraoculares y volver el ojo a una posición neutral. Cierre la incisión con suturas interrumpidas. Luego retirar el catéter y ligar la vena femoral con fuerza para evitar fugas; cerrar con suturas interrumpidas. Aplique un ungüento antibiótico para ambas incisiones. Compruebe el fondo de ojo para verificar la integridad vascular de la vena central de la retina y la arteria.
Etiquetado retrógradade las células ganglionares de la retina (CGR). Nota: Con el fin de evaluar la supervivencia de RGC, etiquetado retrógrada con Fluorogold (FG) debe ser completado una semana antes PION. El método se describe en detalle en JoVe protocolo 819 ^13.
1. En pocas palabras: anestesiar al animal con ketamina (60 mg / kg) y xilazina (8 mg / kg) y afeitar la cabeza.
2. Quirúrgicamente frote el lugar de la incisión y hacer una incisión en la línea media en la cabeza para exponer el cráneo.
3. Perforar agujeros bilaterales a través del cráneo (ø 2x2 mm) 0,5 mm de ambas suturas sagital y las transversales.
4. Aspirar con cuidado el contenido cerebral que se encuentra sobre la superficie dorsal de la colículo superior (SC) utilizando una bomba de vacío. Luego, coloque un pequeño trozo de espuma de gel empapada con 4% FG sobre la superficie de la SC.
5. Cierre la incisión con suturas y el cuidado del animal usando los cuidados postoperatorios estándar.
El cuidado post-operatorio y la eutanasia
1. Después de la cirugía, coloque animal en una jaula limpia separada en la parte superior de una almohadilla de recirculación de agua calentada hasta que se recupere el animal.
2. Analgésicos post-quirúrgicas (HCl buprenorfina, 0,01 mg / kg) deben administrarse dos veces al día durante tres días consecutivos para minimizar las molestias.
3. Rata debe mantenerse separado y observó hasta que son capaces de mantener decúbito esternal y recuperar la conciencia suficiente.
4. Los signos de recuperación y buena salud son monitoreados diariamente por lo menos 5 días después de la cirugía, o hasta retirar la sutura y la curación adecuada de la zona quirúrgica, lo que ocurra último.
5. La eutanasia a los animales por perfusión con PFA al 4% en los puntos de tiempo científicamente apropiados después de la cirugía de acuerdo a los intereses de investigación.

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Representative Results

La lesión isquémica resultante inducida por esta técnica produce una muerte gradual pero pronunciada de las células ganglionares de la retina después de la lesión isquémica axón. Este es un resultado clínicamente relevante similar a la observada en la enfermedad humana. Etiquetado retrógrada FG se utiliza para cuantificar la supervivencia RGC después PION. El mismo método se emplea para validar una creación modelo de éxito, así como para evaluar los efectos de diferentes regímenes terapéuticos. La Figura 1 muestra imágenes confocales representativas de las células FG positivas en montajes planos de la retina de control (Figura 1A), sham tratadas (láser solamente / no eritrosina B, Figura 1B), y 2 semanas después de la PION tratados-(Figura 1C) animales. En comparación con los animales control, menos células FG-positivos están presentes en los animales de 2 semanas después de PION inducción. No se observa ninguna diferencia significativa entre el número de CGR en el control y tratados con tratamiento simulado (láser sólo / no eritrosina B) los animales. This indica que la pérdida de CGR inducida PION-se provoca por la combinación de la eritrosina B y la irradiación láser, en lugar de la energía térmica del láser solo.

Figura 1

Figura 1. células ganglionares de la retina (CGR) la supervivencia después de la neuropatía óptica isquémica posterior (Pion). Células ganglionares de la retina retrógradamente marcadas con Fluorogold fueron imágenes en soportes planos de la retina (AC). Dos semanas después de PION, se observa un número similar de CGR en el control (A) y la falsa tratados (B, láser sólo / no eritrosina B) ojos. Sin embargo, el número de CGR marcadas con FluoroGold se reduce notablemente en el contexto de PION (C). Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versio más granden de esta figura.

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Acknowledgments

Estamos en deuda con Eleut Hernández para la ganadería, Gabe Gaidosh de experiencia microscopía y Khue Tran y Zhenyang Zhao para edición de vídeo. Este estudio fue financiado por el Instituto Nacional del Ojo otorga R01-EY022129 de JLG y subvenciones P30 EY022589 a UCSD y EY014801 a UM; la Asociación Americana del Corazón, la Fundación James y Esther Rey, financia el programa de intercambio de estudiantes de doctorado de Fudan University Graduate School (Nº 2010033), y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBAR^TM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 rustless non-magnetic
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless