Rat Model av fotokemiskt inducerad posterior ischemisk optikusneuropati

Summary

Målet med detta protokoll är att fotokemiskt förmå ischemisk skada på bakre synnerven hos råtta. Denna modell är avgörande för studier av patofysiologin för bakre ischemisk optikusneuropati, och terapeutiska metoder för och andra optiska neuropatier, liksom andra CNS ischemiska sjukdomar.

Abstract

Bakre ischemisk optisk neuropati (PION) är en syn-förödande sjukdom i klinisk praxis. Men dess patogenes och naturhistoria förblivit dåligt kända. Nyligen har vi utvecklat en tillförlitlig, reproducerbar djurmodell av PION och testade behandlingseffekten av vissa neurotrofiska faktorer i denna modell ^en. Syftet med den här videon är att visa vår fotokemiskt inducerad modell av bakre ischemisk optikusneuropati, samt att utvärdera dess effekter med retrograd märkning av näthinneganglieceller. Efter kirurgisk exponering av den bakre synnerven, ett fotosensibiliserande färgämne, erytrosin B, injiceras intravenöst och en laserstråle fokuseras på den optiska nerven ytan. Fotokemisk interaktion av erytrosin B och lasern under bestrålning skadar kärl endotel, vilket föranledde mikrovaskulär ocklusion förmedlas av blodplättstrombos och ödematös komprimering. Den erhållna ischemisk skada ger en gradvis men pronounced näthinneganglieceller skogsskador, på grund av en förlust av axonal ingång - en fjärrkontroll, skada-inducerad och kliniskt relevant resultat. Således tillhandahåller denna modell en ny plattform för att studera patofysiologiska förlopp PION, och kan optimeras ytterligare för att testa terapeutiska metoder för optiska neuropatier samt andra CNS ischemiska sjukdomar.

Introduction

Hos patienter över 50 år gammal, är den vanligaste typen av akut optisk neuropati ² ischemisk optikusneuropati (ION). Tillståndet kan förekomma som en av två undertyper beroende på källan till specifika påverkade blodtillförsel och klinisk presentation: främre (AION) eller bakre (PION) ^3. Medan patogenes och förlopp AION har studerats ingående ^4-7, har PION förblev dåligt kända på grund av dess låga förekomst, variabel presentation, dåligt definierade diagnoskriterier och avsaknad av en djurmodell. Vidare har inga behandlingar har visat sig effektivt förhindra eller vända synförlust från AION eller PION. Därför är av stort värde att studera sjukdomsförloppet in vivo och testa nya terapeutiska kurer för neuroprotektion och Axon förnyelse en reproducerbar och tillförlitlig djurmodell av PION.

Fotokemiskt inducerad ischemisk skada mikrovaskulaturen resulterar i vasogENIC ödem och trombos skapar effektivt regionala vävnadsischemi ^8-12. Efter injektion i det vaskulära cirkulationen, den ljuskänsliga färgämnet erytrosin B alstrar reaktivt molekylärt singlettsyre vid aktivering genom laserbestrålning av mål-fartyg. Den singletsyre peroxidizes direkt kärlendotelet, stimulera blodplättar vidhäftning / aggregering och leder till ocklusiv trombbildning. Ischemisk skada sprids till angränsande områden och förvärras ytterligare av mikrovaskulär kompression på grund av vasogent ödem. Det övergripande målet med detta protokoll är att fotokemiskt inducera ischemi i retrobulbar synnerven att spegla skador som orsakats av PION.

Såvitt vi vet är detta den första modellen av ischemisk skada i den bakre synnerven ^1. Eftersom denna modell producerar ischemi och samtidigt undvika fysiskt trauma, de fysiologiska processerna i bakre ischemisk optikusneuropati är bättre härmas och studerade. Dessutom har den här modellen en ny plattform för screening av kandidatläkemedel för optiska neuropatier och andra CNS-ischemisk sjukdom. Här är ett detaljerat protokoll för lårbensvenen kateterisering, synnerven exponering, intravenös injektion av Erythrosin B och laserstrålning i en rått PION modell som beskrivs.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av University of California San Diego och University of Miami institutions djurvård och använda kommittéer (IACUC) och utförs i enlighet med ARVO uttalande för användning av djur i Oftalmisk och Visual Research. Alla reagens och instrument som används vid kirurgiska ingrepp är sterila.

1. Bedöva och Förbered Rat för kirurgi

1. Före förfarandet råttorna bedövades med en intraperitoneal injektion av ketamin (60 mg / kg) och xylazin (8 mg / kg) i enlighet med kroppsvikt. Adekvat anestesidjup bör bestämmas av ett nekande svar på tå nypa stimulans.
2. När sövda, dra tungan framåt för att förhindra syrebrist och tillämpa smörj salva i båda ögonen för att förhindra uttorkning av hornhinnor under operation.
3. Raka kirurgiska webbplatser med en hårtrimmer och torka området tre gånger med 10% providon-jod rengöringsmedel och 70% etanol.
4. Drape tHan djur inom ett sterilt område. Sterila handskar och kirurgiska instrument används under överlevnad kirurgi. Åter sterilisera tips av instrument med hjälp av en varm pärla autoklav mellan djur.

2. Kirurgisk Approach

1. PION induktion
   1. Femoralvenen kateterisering
      1. Förbered och rengör operationsområdet. Raka högra inre lår med hjälp av en hårtrimmer och torka området tre gånger vardera med 10% providon-jod rengöringsmedel och 70% etanol.
      2. Förbered slangen. Skär en 40 cm längd av polyeten slang (PE 10) steriliserades i 70% etanol. Spola slangen med koksaltlösning och ansluta den till en 1 ml spruta innehållande en i förväg uppmätt lösning av 2% erytrosin B färgämne (1 pl / mg, vilket ger en dos på 20 mg / kg kroppsvikt). Montera sprutan i en mul-omkopplare styrd infusionspump inställd på en hastighet av 600 ul / min.
      3. Med användning av en nr 15 blad, gör ett litet horisontellt snitt vidbasen av höger lår. Klipp ut och sprida membranet inuti och rengör området med sterila bomullspinnar.
      4. Separera muskeln med pincett tills den gren av lårvenen är synlig. En mantel omger artären, venen och nerven. Nyp och dra detta mantel uppåt med pincett (fin spets Dumont tång), och skär ett litet snitt (2-4 mm är vanligen tillräcklig) nära basen av den triangulära kilen med Vannas våren sax. Expandera snittet som behövs.
      5. Separera venen och artären med en trubbig mikrokirurgisk krok parallellt med riktningen av venen. Var noga med att inte skada den känsliga membranet och ven grenar. Sedan försiktigt lyfta venen och separera den från den underliggande bindväv.
      6. Skaffa en nålfri nylonsutur och placera den bredvid lårbensvenen. Använda mikrokirurgiska krok, lyfta venen och passera fin spets pincett under det distala området. Ta en ände av suturen och dra den underven. Ligera distala ven tätt. Passera en andra sutur på ett liknande sätt inom ramen för den proximala venen och göra en lös knut.
      7. Gör ett litet snitt i venen nära den distala ligation med Vannas våren sax. Expandera hålet vid behov med fin spets pincett. Vissa blodet kan läcka genom snittet. Rengör operationsområdet med kall, steril BSS och sterila bomullspinnar.
      8. Holding venväggen vid kanten av snittet, ANVÄNDA KATETER kärlet med den framställda koksaltspolas slang med hjälp av en nålhållare. Dra åt proximala knuten runt venen och slangar. Sedan förankra slangen genom att knyta den till den distala sutur.
      9. Kontrollera kvaliteten på den kateterisering genom att trycka på fotomkopplaren för att injicera saltlösning, <1 ml är tillräcklig. Försäkra dig om att slangen är fri och har inga läckor. Tillfälligt stänga snittet med suturer att skydda kateterisering och vävnaden.
   2. Exponering av synnerven
      1. Prepare operationsstället genom att torka den i förväg rakade området ovanför det vänstra ögat tre gånger vardera med 10% providon-jod detergentlösning och 70% etanol.
      2. Gör ett snitt längs huden 2-3 mm bakom ögat med en nr 15 blad. Nyp och lyft bindväv med sågtandade pincett, och göra ett litet snitt med Vannas våren sax. Denna litet snitt är i allmänhet omkring 5 mm i längd, men kan vara längre för att åstadkomma större exponering för en kirurg i utbildning. Fortsätt att rakt på sak dissekera genom bindväven längs den överlägsna kanten av orbital ben, var noga med att inte störa blodkärl. Rengör operationsområdet med bomullspinnar.
      3. Dissekera nedåt genom bindhinnan tills överlägsna rektusmuskeln är synlig. Nyp och dissekera genom muskeln; muskeln kommer att befrias från djupt inne i omloppsbana. Nu, kan omgivande vävnader utnyttjas för att hjälpa till vid återdragning och förhöjning av ögat för att underlätta visualisering.
      4. Retarmkanalen flik av hud och bindväv i sidled och nedåt, och håll på plats med en sutur och hemostat. Detta kommer att rotera ögat framåt och utåt för att avslöja den fetthaltiga mantel som omger den optiska nerven.
      5. Försiktigt in ett par vassa pincett och expandera parallellt med synnerven för att separera bindväven som omger höljet. Rör inte synnerven med de skarpa spetsarna på pincetten.
      6. En 5 mm längd av synnerven och omgivande mantel ska nu vara synliga. Ett nätverk av mikrokärl på mantelytan omsluter synnerven. Dessa kommer att inriktas under laserstrålning.
   3. Intravenös injektion av Erythrosin B och laserstrålning
      1. Bär orangefärgad skyddsglasögon vid alla tidpunkter när du använder laser bestrålningsapparaten att skydda dig från den gröna laserljus. Slå på lasern, öppna slutaren och justera topp och genomsnittlig powers hos lasern vid behov. Stäng luckan.
      2. Placera råttan i laser bestrålningsapparaten. För att säkerställa korrekt balk placering, är en svag siktar stråle som produceras av spatialt filtrera lasern genom ett hål 100 um diameter borras i den slutna slutarbladet. Åter exponera synnerven med ett par fina spets pincett och placera sikt strålen mot intraorbital synnerven mellan 3 mm och 4 mm bakom synnervshuvudet.
      3. Injicera lösningen av 2% erytrosin B via aktivering av infusionspumpen. Det kan cirkulera under några sekunder medan kirurgen lägger till en liten droppe av BSS att fukta ytan av synnerven.
      4. Kontrollera positionen för siktbalken och klicka sedan på fotomkopplaren för att initiera bestrålning. En orange-färgad säkerhetsfiltret, som tillsätts i den optiska banan för mikroskopet, kommer omedelbart utlöses följt av öppnandet av slutaren efter en 1 sek fördröjning.
      5. Bestråla synnerven för 90 sek med en toppeffekt på 135mW och medeleffekten för 18mW produceras av en balk avbrytare roterande med 250 Hz med en pulskvot av 15% (detta minimerar termisk effekt). Gul fluorescens, visualiseras som ljust orange genom säkerhetsfiltret kommer att avges från den övre ytan av synnerven och är tillräcklig för att säkerställa att strålen bestrålar nerven symmetriskt.
      6. Efter bestrålningen, kommer den orangefärgade säkerhetsfiltret öppnas automatiskt. Microhemorrhage kan observeras i vissa fall.
      7. Avlasta dragkraften på de extra okulära musklerna och återgå ögat till ett neutralläge. Stäng snittet med avbrutna suturer. Sedan dra katetern och fästa lårbensvenen hårt för att förhindra läckage; avsluta med avbrutna suturer. Applicera antibiotisk salva till båda snitt. Kontrollera fundus för att kontrollera den vaskulära integriteten hos den central retinal ven och artär.
2. Retrograd Märkningav näthinneganglieceller (RGC). OBS: För att utvärdera RGC överlevnad, retrograd märkning med fluor (FG) skall fyllas i en vecka innan PION. Metoden beskrivs i detalj i JUPITER-protokollet 819 ^13.
   1. I korthet: söva djuret med ketamin (60 mg / kg) och xylazin (8 mg / kg) och raka huvudet.
   2. Kirurgiskt skrubba snittet platsen och göra en mittlinje snitt över huvudet för att exponera skallen.
   3. Borra bilaterala hål genom skallen (ø 2x2 mm) 0,5 mm från både sagittal och tvär suturer.
   4. Försiktigt aspirera cerebrala innehåll som ligger över den dorsala ytan av den överlägsna colliculi (SC) med användning av en vakuumpump. Sedan placera en liten bit av gelfoam indränkt med 4% FG på ytan av SC.
   5. Stäng snitt med suturer och ta hand om djuret med standard postoperativ vård.
3. Postoperativ vård och eutanasi
   1. Efter operation, placera djur i en separat ren bur på toppen av en recirkulerande uppvärmt vatten dyna till dess att djuret utvinnes.
   2. Postoperativa smärtstillande medel (buprenorfin HCI, 0,01 mg / kg) skall ges två gånger per dag under tre dagar i följd för att minimera obehaget.
   3. Råtta bör hållas separat och observerades tills de kan behålla sternala VILA och återfå tillräckligt medvetande.
   4. Tecken på återhämtning och god hälsa övervakas dagligen under minst 5 dagar efter operationen, eller tills suturtagning och adekvat läkning av operationsområdet, beroende på vilket som inträffar senast.
   5. Avliva djuren efter perfusion med 4% PFA vid vetenskapligt lämpliga tidpunkter efter operationen enligt utrednings intresse.

Representative Results

Den resulterande ischemisk skada inducerad av denna teknik ger en gradvis men uttalad död näthinneganglieceller efter ischemisk Axon skada. Detta är en kliniskt relevant resultat som liknar den som observerades i den mänskliga sjukdomen. FG retrograd märkning används för att kvantifiera RGC överlevnad efter PION. Samma metod används för att validera en framgångsrik modell skapande samt att bedöma effekterna av olika terapeutiska kurer. Figur 1 visar representativa konfokala bilder av FG-positiva celler i näthinnan platta fästen från kontroll (Figur 1A), skenbehandlade (laser endast / ingen erytrosin B, Figur 1B), och 2 veckor efter PION-behandlade (Figur 1C) djur. Jämfört med kontrolldjur, färre FG-positiva celler är närvarande i djur 2 veckor efter PION induktion. Ingen signifikant skillnad mellan antalet RGC i kontroll och skenbehandlade (laser endast / ingen erytrosin B) djur observeras. This anger att PION-inducerad RGC förlust framkallas genom kombinationen av erytrosin B och laserbestrålningen, i stället för värmeenergi från lasern ensam.

Figur 1. Retinal ganglion cell (RGC) överlevnad efter bakre ischemisk optikusneuropati (Pion). Näthinneganglieceller retrograd märkta med fluoravbildades i retinala platta fästen (AC). Två veckor efter PION är lika många RGC observeras i kontroll (A) och skenbehandlade (B, endast laser / ingen erytrosin B) ögon. Emellertid är antalet fluormärkta RGC reducerades markant i inställningen av PION (C). Skala bar = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
532-nm Nd:YAG laser	Laserglow	LRS-532-KM-200-3
Beam chopper	custom-made	custom-made
Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer	Vincent Associates	SD-10
25-cm focal length spherical lens	CVI/Melles-Griot	01 LPX 293	plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating
Erythrosin B	MP Biomedicals	190449
Fluorogold	Fluorochrome,LLC
Gelfoam	Cardinal Health	CAH1203421
Polyethylene tubing (PE10)	BD Intramedic	427400
No. 10 Blade	Miltex	4-110
Fine Forceps	F.S.T.	91150-20	Dumont #5 rustless non-magnetic
Forceps with Teeth	F.S.T.	11153-10	Germany stainless
Forceps	F.S.T.	18025-10	Germany stainless
Vannas spring scissors	F.S.T.	2-220	JJECK Stainless
Polyglactin suture	Ethicon	J488G	7-0 suture
hemostat	F.S.T.	12075-12	Germany stainless