Summary
Bu protokolün amacı, fotokimyasal sıçan posterior optik sinir iskemik hasara yol etmektir. Bu model arka iskemik optik nöropati patofizyolojisi çalışmaları ve bunun için tedavi yaklaşımları ve diğer optik nöropatiler kritik yanı sıra diğer MSS iskemik hastalıklar.
Abstract
Posterior İskemik optik nöropati (PION) klinik pratikte görme-yıkıcı bir hastalıktır. Ancak, patogenezi ve doğal seyri tam olarak anlaşılamamıştır kalmıştır. Son zamanlarda, plON güvenilir, yeniden üretilebilir bir hayvan modelinin geliştirilmesi ve bu modelde 1 bazı nörotrofik faktörlerin tedavi etkisini test ettik. Bu videonun amacı posterior iskemik optik nöropati bizim fotokimyasal kaynaklı modeli göstermek için, ve retina ganglion hücrelerinin retrograd etiketleme ile etkilerini değerlendirmektir. Posterior optik sinir bir ışığa boya, eritrosin B cerrahi maruz bırakılmasının ardından, damar içine enjekte edilir ve bir lazer ışını optik sinir yüzeyi üzerine odaklanmıştır. Trombosit tromboz ve ödemli sıkıştırma aracılık mikrovasküler oklüzyon isteyen ışınlama zararlardan damar endotel sırasında eritrosin B ve lazer fotokimyasal etkileşim. Ortaya çıkan iskemik yaralanma kademeli ama pronounc verimleriBir uzaktan kumanda, hasar kaynaklı ve klinik olarak önemli bir sonuç - aksonal girdi bir kaybına bağlı retinal ganglion hücre tepe kurumalarına ed. Bu nedenle, bu model plON patofizyolojik ders çalışma için yeni bir platform sağlar ve ayrıca optik nöropati gibi diğer merkezi sinir sistemi işemik hastalıklar için terapötik yaklaşımları test etmek için optimize edilebilir.
Introduction
50 yaş üzeri hastalarda, iskemik optik nöropati (ION) Akut optik nöropati 2 en yaygın türüdür. Anterior (AION) ya da posterior (PION) 3: durum belirli etkilenen kan temini ve klinik sunum kaynağına göre olarak bir veya iki alt tiplerinin sunabilirim. AION patogenezi ve ders yoğun 4-7 olarak çalışılırken, PION kötü nedeniyle düşük yaygınlık, değişken sunum, kötü tanımlanmış tanı ölçütlerine ve hayvan modelinin eksikliği anlaşılmaktadır kalmıştır etti. Ayrıca, hiçbir tedavi etkili bir şekilde engellemek veya AION veya PION gelen görme kaybının tersine kanıtlanmıştır. Bu nedenle, pion bir tekrarlanabilir ve güvenilir bir hayvan modeli, in vivo olarak hastalık sürecini incelemek ve nöro ve akson rejenerasyonu için yeni tedavi rejimleri test etmek için büyük bir değer taşımaktadır.
Fotokimyasal vasog sonuçlanan mikrovasküler iskemik yaralanmaya neden olduğuENIC ödem ve tromboz etkili bir bölgesel doku iskemisini 8-12 oluşturur. Vasküler dolaşıma enjeksiyonundan sonra, ışığa boya eritrosin B hedef damarların lazer ışınlaması ile aktivasyon üzerine reaktif tekli moleküler oksijen üretir. Tekli oksijen doğrudan trombosit yapışması / toplanmasını uyarıcı ve trombüs oluşumunu tıkayıcı lider, vasküler endoteli peroxidizes. İskemik hasar komşu bölgelere yayıldı ve daha nedeniyle vazojenik ödem mikrovasküler kompresyon ile şiddetlenir. Bu protokolün genel amacı fotokimyasal PION yol açtığı hasarı ayna retrobulber optik sinir iskemi ikna etmek olduğunu.
Bildiğimiz kadarıyla, bu arka optik sinir 1 iskemik hasarın ilk modelidir. Fiziksel travma kaçınarak bu model iskemi üretir gibi, posterior iskemik optik nöropati fizyolojik süreçleri daha iyi taklit ve okudu vardır. Ayrıca, bu model optik nöropati ve diğer merkezi sinir sistemi hastalığı, iskemik aday terapötiklerinin tarama için yeni bir platform sunuyor. Burada, bir sıçan PION modelinde femoral ven kateterizasyonu, optik sinir pozlama, Eritrosin B intravenöz enjeksiyon ve lazer ışınlama için detaylı bir protokol tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün hayvan prosedürleri Kaliforniya San Diego ve Miami kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri (IACUC) Üniversitesi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Oftalmik ve Görsel Araştırma Hayvanların Kullanım ARVO Beyanı doğrultusunda yapıldı. Tüm reaktifler ve cerrahi işlemlerde kullanılan enstrümanlar sterildir.
1. anestezisi ve Cerrahisi Rat hazırlayın
- Prosedüre önce sıçanlara, vücut ağırlığına göre ketamin (60 mg / kg) ve ksilazin (8 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile anestezi uygulanır. Anestezi yeterli derinliği ayak parmağı sıkıştırma uyansına negatif tepki ile belirlenmelidir.
- Anestezi sonra, asfiksi önlemek ve ameliyat sırasında kornealar kurumasını önlemek için her iki göze merhem yağlama uygulamak ileri dilini çekin.
- Bir saç kesme makinesi kullanılarak cerrahi siteleri Tıraş ve parkı% 10 providon-iyot deterjan solüsyonu ve% 70 etanol ile üç kez silin.
- Örtü tsteril alan içinde o hayvan. Steril eldiven ve cerrahi aletler sağkalım ameliyat sırasında kullanılır. Hayvanlar arasında sıcak bir boncuk sterilizatör kullanan araçların ipuçları yeniden sterilize edin.
2. Cerrahi Yaklaşım
- PION indüksiyon
- Femoral ven kateterizasyonu
- Hazırlayın ve cerrahi siteyi temizleyin. Bir saç kesme makinesi kullanılarak sağ uyluk Tıraş ve% 10 providon-iyot deterjan çözeltisi ve% 70 etanol ile parkı üç kez her silin.
- Tüp hazırlayın. % 70 etanol içinde sterilleştirilmiştir polietilen boru 40cm uzunlukta (PE 10) kesin. (20 mg / kg vücut ağırlığı kadar bir doz, sonuçta 1 ul / mg) tuzlu su ile boru yıkayın ve% 2 eritrosin B bir boya önceden ölçülmüş çözelti ihtiva eden bir 1 ml şırınga bağlayın. 600 ul / dakikalık bir oranda ayarlanmış bir ayak anahtarı kontrol edilen bir enfüzyon pompası içine şırınga monte edin.
- Bir No. 15 bıçak kullanarak, küçük bir yatay bir kesi yapmaksağ uyluk tabanı. Kes ve iç zarı yaymak ve steril pamuklu bölgeyi temizleyin.
- Femoral ven dalı görünene kadar forseps ile kas ayırın. Bir kılıf arter, damar ve sinir çevreler. Vannas yaylı makas ile üçgen şekilli kama üssü yakınlarında (2-4 mm genellikle yeterli olmaktadır) sıkın ve forseps (ince uçlu Dumont forseps) ile yukarı bu kılıfı çekin ve küçük bir kesi kesti. Gerektiğinde kesim genişletin.
- Damar yönüne künt mikro cerrahi kanca paralel ven ve arter ayırın. Narin zarı ve damar dalları zarar vermemek için dikkatli olun. Sonra, yavaşça damara kaldırın ve altta yatan bağ dokusu ayırın.
- Bir iğnesiz naylon dikiş elde edilir ve femoral ven yanına koyun. Mikro cerrahi kanca kullanarak, damar yükseltmek ve distal bölgede altındaki ince uçlu forseps geçmektedir. Sütür bir ucunu tut ve altına çekindamar. Sıkıca distal ven Arter. Proksimal ven altında benzer bir şekilde ikinci bir sütür Pass ve gevşek bir düğüm yapın.
- Vannas yaylı makas ile uzak ligasyon yakın damarda küçük bir kesim olun. İnce uçlu forseps ile gerekli delik genişletin. Bazı kan kesim ile sızabilir. Soğuk, steril BSS ve steril pamuklu cerrahi bölgeyi temizleyin.
- Kesme kenarında damar duvarı tutarak, bir iğne tutucu kullanılarak hazırlanan tuzlu-boşaltılan boru ile gemi kateterize. Ven ve boru etrafında proksimal düğüm sıkın. Ardından, uzak sütür onu bağlayarak boru çapa.
- 1 ml yeterli <, tuzlu enjekte ayak anahtarına basarak kateterizasyon kalitesini kontrol edin. Boru engelsiz ve hiçbir sızıntıları sahip olduğundan emin olun. Geçici kateterizasyon ve doku korumak için dikişlerle kesi kapatın.
- Optik sinir Pozlama
- Prepare% 10 providon-iyot deterjan çözeltisi ve% 70 etanol ile sol göz yukarıdaki üç kez her öncesi traş bölgeyi silerek cerrahi alan.
- Bir No. 15 bıçak ile göz arkasında cilt 2-3 mm boyunca bir kesi yapmak. Pinch ve tırtıklı forseps ile bağ dokusu kaldırın ve Vannas yaylı makas ile küçük bir kesi yapmak. Bu küçük insizyon genel uzunluğu yaklaşık 5 mm, ancak eğitim bir cerrah için daha fazla maruz sağlamak için daha uzun olabilir. Kan damarları bozmamak için özen, açık açık yörünge kemik üstün kenarı boyunca bağ dokusu ile incelemek için devam edin. Pamuklu cerrahi bölgeyi temizleyin.
- Üst rektus kası görünene kadar konjonktiva aşağı doğru parçalara ayır. Pinch ve kas yoluyla teşrih; kas yörünge içinde derin kurtarılmış olacaktır. Şimdi, çevre dokular görselleştirme kolaylığı için göz geri çekilmesi ve yükseklik yardımcı olmak için kullanılabilir.
- Yenidenyanal ve aşağı deri ve bağ dokusu kapağını cezbet ve sütür ve hemostatla yerinde tutun. Bu optik sinir çevreleyen yağ içeren kılıf ortaya çıkarmak için ileri ve dışa doğru göz dönecektir.
- Dikkatle keskin forseps bir çift eklemek ve kılıf çevreleyen bağ dokusu ayırmak için optik sinir paralel genişletin. Forseps keskin uçları ile optik sinir dokunmayın.
- Optik sinir ve çevresindeki kılıfın A 5 mm uzunluk şimdi görünür olmalıdır. Kılıf yüzeyinde mikrodamarlar ağı optik sinir çevreler. Bu lazer ışınlama sırasında hedef olacaktır.
- Eritrosin Yatak ve lazer ışınlama intravenöz enjeksiyon
- Yeşil lazer ışığı kendinizi korumak için lazer ışınlama cihazı kullanırken her zaman turuncu renkli güvenlik gözlükleri takın. , Lazer açın deklanşör açın ve zirve ve ortalama powe ayarlamaklazer sc gerekli. Deklanşörü kapatın.
- Lazer ışını aparatı içinde sıçan yerleştirin. Doğru ışın yerleştirilmesini sağlamak için, zayıf hedefleme ışını mekansal kapalı panjur bıçak delinmiş 100 mikron çaplı delikten lazer filtreleme ile üretilir. Ince uçlu forseps bir çift ile optik sinir Re-maruz ve 3 mm ve optik sinir başının arkasında 4 mm arasında intraorbital optik sinir üzerine amaçlayan ışını yerleştirin.
- Infüzyon pompası aktivasyonu yoluyla% 2 eritrosin B çözümü enjekte edilir. Cerrah optik sinirin yüzeyini nemlendirmek için BSS küçük bir damla ekler iken birkaç saniye süreyle sirküle edebilir.
- Amaçlayan ışının pozisyonunu kontrol edin ve ardından radyoterapi başlatmak için ayak anahtarı tıklatın. Mikroskop optik yol eklenir bir turuncu renkli Emniyet filtre, hemen 1 sn gecikme ile kapağın açılması ve ardından tetiklenir.
- 9 için optik sinir saçmakBir 135mW pik güç ve% 15 görev döngüsü ile 250 Hz'de dönen bir ışın kıyıcı tarafından üretilen 18mW ortalama gücü 0 sn (bu termal etkilerini en aza indirir). Güvenlik filtre ile parlak turuncu olarak görünür sarı floresan, optik sinirin üst yüzeyinden çıkar ve kiriş simetrik sinir ışıma yapmaktadır sağlamak için yeterli olacaktır.
- Işınlama sonra, turuncu renkli emniyet filtresi otomatik olarak açılacaktır. Mikrokanamalar bazı durumlarda gözlenebilir.
- Ekstra oküler kaslarda çekiş tahliye ve nötr konuma göz dönün. Sütürler ile kesi kapatın. Ardından kateteri ve sızıntıyı önlemek için sıkıca femoral ven kapalı kravat; sütürler ile kapatın. Her iki kesiler antibiyotik merhem sürün. Santral retinal ven ve arter damar bütünlüğünü doğrulamak için fundus edin.
- Femoral ven kateterizasyonu
- Retrograd Etiketleme. Retina Ganglion Hücreleri (RGCs) NOT of: RGC hayatta kalma, Fluorogold (FG) ile retrograd etiketleme değerlendirmek amacıyla PION bir hafta önce tamamlanması gerekmektedir. Yöntem, jove protokolü 819 13 detaylı bir şekilde tarif edilmektedir.
- Kısacası: ketamin (60 mg / kg) ve xylazine (8 mg / kg) ile hayvan uyutmak ve tıraş.
- Cerrahi kesi sitesine fırçalayın ve baş genelinde bir orta hat kesi kafatası açığa çıkarmak için yapmak.
- Kafatası yoluyla ikili delikleri (ø 2x2 mm) hem sagital ve transvers dikişlerle 0.5 mm delin.
- Dikkatle bir vakum pompası kullanılarak üstün colliculus (SC) dorsal yüzeyi üzerinde yatıyor serebral içeriği aspire. Ardından, SC yüzeyine% 4 FG ile ıslatılmış gelfoam küçük bir parça koyun.
- Standart ameliyat sonrası bakım ile hayvan için dikişlerle kesi kapatın ve bakım.
- Post-operatif bakım ve Ötenazi
- Hayvan kurtarıldı kadar Ameliyattan sonra, bir devri daim ısıtılan su yastığı üstünde ayrı bir temiz kafeste hayvan yerleştirin.
- Cerrahi sonrası analjezikler (buprenorfin HCL, 0.01 mg / kg) rahatsızlığı en aza indirmek için birbirini izleyen üç gün boyunca günde iki defa tatbik edilmelidir.
- Sıçan ayrı tutulur ve sternum yatma korumak ve yeterli bilince yeniden edebiliyoruz kadar dikkat edilmelidir.
- Kurtarma ve sağlık belirtileri ameliyat sonrası ya da sütür çıkarılması ve son hangisi cerrahi sitenin, yeterli iyileşme kadar en az 5 gün boyunca günlük olarak takip edilmektedir.
- Araştırmacı ilgi alanlarına göre ameliyat sonrası bilimsel uygun zaman noktalarında% 4 PFA ile perfüzyon ile hayvanların Euthanize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu teknikle tarafından uyarılan ortaya çıkan iskemik hasar iskemik akson yaralanma sonrası retina ganglion hücrelerinin yavaş yavaş ama belirgin ölümü verir. Bu, insan hastalığında gözlenen benzer klinik olarak anlamlı bir sonuçtur. FG retrograd etiketleme PION sonra RGH hayatta kalma ölçmek için kullanılır. Aynı yöntem başarılı bir model oluşturma doğrulamak yanı sıra farklı tedavi rejimlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılır. 1 kontrolünde retina düz bağlar FG-pozitif hücrelerin temsilcisi konfokal görüntüleri (Şekil 1A) göstermektedir, sahte muamele (lazer Yalnızca / hayır eritrosin B, Şekil 1B), ve 2 hafta (Şekil 1C) hayvanlar post-PION-tedavi. Kontrol hayvanlarına kıyasla, daha az FG pozitif hücreler 2 hafta sonra, hayvanlara PION indüksiyon mevcuttur. Kontrolü ve plasebo tedavisi (lazer yalnızca / hayır eritrosin B) RGCs hayvan sayısı arasında anlamlı bir fark gözlenmektedir. This PION kaynaklı RGC kaybı sadece lazer yerine termal enerji, eritrosin B ve lazer ışınlama kombinasyonu ile ortaya olduğunu gösterir.
Şekil 1. Retina ganglion hücre (RGH) sağkalım retrograd Fluorogold etiketli posterior iskemik optik nöropati (PION). Retina ganglion hücrelerinin retina düz tamponla (AC) olarak görüntülenmiştir sonra. İki hafta pion sonra, RGCs benzer sayıda kontrolü (A) ve plasebo ile tedavi edilen (B, lazer yalnızca / hayır eritrosin B) gözler görülür. Bununla birlikte, Fluorogold etiketli RGCs sayısı belirgin plON (C) 'nin bir ortamda azalır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınızBu rakamın n.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz video düzenleme için hayvancılıkla ilgili Eleut Hernandez, mikroskopi uzmanlık için Gabe Gaidosh ve Khue Tran ve Zhenyang Zhao borçlu olan. Ulusal Göz Enstitüsü tarafından finanse edildi Bu çalışma UM için UCSD ve EY014801 için JLG ve P30 hibe EY022589 için R01-EY022129 verir; Amerikan Kalp Derneği, James ve Esther Kral Vakfı, Fudan Üniversitesi Graduate School (No 2010033) doktora öğrenci değişim programı fonu ve Research sınırsız hibe Körlük, Inc. Önleme
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532-nm Nd:YAG laser | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| Beam chopper | custom-made | custom-made | |
| Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25-cm focal length spherical lens | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating |
| Erythrosin B | MP Biomedicals | 190449 | |
| Fluorogold | Fluorochrome,LLC | ||
| Gelfoam | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| Polyethylene tubing (PE10) | BD Intramedic | 427400 | |
| No. 10 Blade | Miltex | 4-110 | |
| Fine Forceps | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 rustless non-magnetic |
| Forceps with Teeth | F.S.T. | 11153-10 | Germany stainless |
| Forceps | F.S.T. | 18025-10 | Germany stainless |
| Vannas spring scissors | F.S.T. | 2-220 | JJECK Stainless |
| Polyglactin suture | Ethicon | J488G | 7-0 suture |
| hemostat | F.S.T. | 12075-12 | Germany stainless |
References
- Wang, Y., Brown, D. P. Jr, Duan, Y., Kong, W., Watson, B. D., Goldberg, J. L. A novel rodent model of posterior ischemic optic neuropathy. JAMA Ophthalmology. 131, 194-204 (2013).
- Rucker, J. C., Biousse, V., Newman, N. J. Ischemic optic neuropathies. Curr Opin Neurol. 17, 27-35 (2004).
- Hayreh, S. S. Posterior ischaemic optic neuropathy: clinical features, pathogenesis, and management. Eye (Lond). 18, 1188-1206 (2004).
- Hayreh, S. S. Inter-Individual Variation in Blood-Supply of the Optic-Nerve Head. Doc Ophthalmol. 59, 217-246 (1985).
- Jacobson, D. M., Vierkant, R. A., Belongia, E. A. Nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy - A case-control study of potential risk factors. Arch Ophthalmol-Chic. 115, 1403-1407 (1997).
- Kosmorsky, G., Straga, J., Knight, C., Dagirmanjian, A., Davis, D. A. The role of transcranial Doppler in nonarteritic ischemic optic neuropathy. Am J Ophthalmol. 126, 288-290 (1998).
- Hayreh, S. S., Zimmerman, M. B. Non-arteritic anterior ischemic optic neuropathy: role of systemic corticosteroid therapy. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology. 246, 1029-1046 (2008).
- Prado, R., Dietrich, W. D., Watson, B. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically Induced Graded Spinal-Cord Infarction - Behavioral, Electrophysiological, and Morphological Correlates. J Neurosurg. 67, 745-753 (1987).
- Dietrich, W. D., Busto, R., Watson, B. D., Scheinberg, P., Ginsberg, M. D. Photochemically induced cerebral infarction. II. Edema and blood-brain barrier disruption. Acta Neuropathologica. 72, 326-334 (1987).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).
- Watson, B. D. Animal models of photochemically induced brain ischemia and stroke. Cerebrovascular Disease - Pathophysiology, Diagnosis and Treatment. , 52-73 (1998).
- Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Research. 367, 296-300 (1986).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
