Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, photochemisch induzieren ischämischen Schädigung des hinteren Sehnervs bei Ratten. Dieses Modell ist für Studien der Pathophysiologie der hinteren ischämischer optischer Neuropathie und therapeutischen Ansätzen für diese und andere Optikusneuropathien sowie anderer ZNS-ischämischen Erkrankungen.
Abstract
Posterior ischämische Optikusneuropathie (PION) ist ein Anblick-verheerenden Krankheit in der klinischen Praxis. Doch der Pathogenese und Naturgeschichte blieben weitgehend unverstanden. Vor kurzem hat eine zuverlässige, reproduzierbare Tiermodell der PION entwickelten wir und getestet die Wirkung der Behandlung einiger neurotrophen Faktoren in das Modell ein. Der Zweck dieses Video ist in unseren photochemisch induzierten Modell der hinteren ischämischer optischer Neuropathie zu demonstrieren und ihre Auswirkungen mit retrograde Markierung retinaler Ganglionzellen bewerten. Nach der chirurgischen Freilegung des hinteren Sehnerv, einem photosensibilisierenden Farbstoff Erythrosin B, intravenös injiziert, und ein Laserstrahl wird auf den Sehnerv Oberfläche fokussiert. Photochemische Wechselwirkung von Erythrosin B und dem Laser während der Bestrahlung schädigt das vaskuläre Endothel, woraufhin mikrovaskuläre Okklusion durch Blutplättchenthrombose und ödematösen Kompressions vermittelt. Die sich ergebende ischämische Verletzung ergibt sich eine allmähliche, aber pronounced retinalen Ganglienzellen Sterben wegen zu einem Verlust der axonalen Eingangs - einem entfernten, Verletzung induzierten und klinisch relevante Ergebnisse. Somit stellt dieses Modell eine neue Plattform, um die pathophysiologischen Verlauf PION zu studieren, und weiter zum Testen therapeutischer Ansätze für Optikusneuropathien sowie andere CNS ischämischen Erkrankungen optimiert werden.
Introduction
Bei Patienten über 50 Jahre alt, ist ischämische Optikusneuropathie (ION) die häufigste Form der akuten Optikusneuropathie 2. Vordere (AION) oder posterior (PION) 3: Die Bedingung kann entsprechend der Quelle der spezifischen betroffenen Blutversorgung und klinische Präsentation zu präsentieren als eine von zwei Subtypen. Während die Pathogenese und Verlauf von AION wurden ausgiebig studiert 4-7, PION geblieben ist schlecht aufgrund ihrer geringen Prävalenz, variable Präsentation, schlecht definierten diagnostischen Kriterien und der Mangel an einem Tiermodell zu verstehen. Darüber hinaus keine Behandlungen haben sich als wirkungsvoll verhindern oder rückgängig zu Sehverlust von AION oder PION. Daher ist von großem Wert für den Krankheitsprozess in vivo zu studieren und Erprobung neuer Therapieschemata zur Neuroprotektion und Axonregeneration eine reproduzierbare und zuverlässige Tiermodell der PION.
Photochemisch induzierten ischämischen Schädigung der Mikrogefäß was vasogENIC Ödeme und Thrombose erzeugt effektiv regionalen Gewebeischämie 8-12. Nach der Injektion in das Gefäßdurchblutung, die lichtempfindliche Farbstoff Erythrosin B produziert reaktiven molekularen Singulett-Sauerstoff bei Aktivierung durch Laserbestrahlung von Zielgefäße. Der Singulett-Sauerstoff direkt peroxidizes das vaskuläre Endothel, Thrombozyten zu stimulieren Einhaltung / Aggregation und die zu Thrombusbildung okklusiv. Ischämischer Schäden an den benachbarten Gebieten zu verbreiten und weiter durch mikrovaskuläre Kompression durch vasogenen Ödem verschlimmert. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, photochemisch induzieren Ischämie in der retrobulbären Sehnerv zu spiegeln den Schaden PION verursacht.
Unseres Wissens ist dies das erste Modell der ischämischen Verletzung im hinteren Sehnervs 1. Da dieses Modell produziert Ischämie unter Vermeidung von physischem Trauma, besser nachgeahmt und studierte sind die physiologischen Prozesse der hinteren ischämische Optikusneuropathie. Außerdem bietet dieses Modell eine neue Plattform für das Screening von Kandidaten Therapeutika für Optikusneuropathien und anderen ZNS-ischämische Erkrankung. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Oberschenkelvene Katheterisierung, Sehnerv Belichtung, intravenöse Injektion von Erythrosin B und Laserbestrahlung in einem Rattenmodell PION beschrieben.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren wurden von der University of California in San Diego und University of Miami Institutional Animal Care und die Verwendung Ausschüsse (IACUC) genehmigt und in Übereinstimmung mit der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in der Ophthalmologie und visuelle Forschung durchgeführt. Alle Reagenzien und Instrumente bei chirurgischen Verfahren verwendet werden, sind steril.
1. Anesthetize und bereiten den Rat für Chirurgie
- Vor dem Verfahren werden die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (60 mg / kg) und Xylazin (8 mg / kg) je nach Körpergewicht anästhesiert. Angemessene Narkosetiefe sollte durch eine negative Antwort auf toe Prise Stimulus bestimmt werden.
- Einmal betäubt, ziehen Sie die Zunge nach vorne, um Erstickung zu verhindern und gelten Schmiersalbe für beide Augen, um Austrocknen der Hornhaut während der Operation zu verhindern.
- Rasieren Sie die Operationsstellen mit einer Haarschneidemaschine und wischen Sie die Fläche, die dreimal mit 10% Providon-Jod-Reinigungslösung und 70% Ethanol.
- Drape tEr Tier in einem sterilen Bereich. Sterile Handschuhe und chirurgische Instrumente werden bei der Überlebensrate der Operation eingesetzt. Erneute Sterilisation der Spitzen der Instrumente unter Verwendung eines heißen Perle Sterilisator zwischen Tieren.
2. Surgical Annäherung
- PION Induktions
- Oberschenkelvene Katheterisierung
- Bereiten Sie und reinigen Sie die Operationsstelle. Rasieren Sie den rechten inneren Oberschenkel mit einer Haarschneidemaschine und wischen Sie die Fläche dreimal mit je 10% Providon-Jod-Reinigungslösung und 70% Ethanol.
- Bereiten Sie den Schlauch. Schneiden eine 40cm Länge der Polyethylenschlauch (PE 10) in 70% Ethanol sterilisiert. Spülen Sie die Schläuche mit Kochsalzlösung und verbinden Sie es mit einer 1 ml Spritze, die eine abgemessene Lösung von 2% Erythrosin B-Farbstoff (1 & mgr; l / mg, was eine Dosis von 20 mg / kg Körpergewicht). Montieren Sie die Spritze in einen Fußschalter gesteuert Infusionspumpe mit einer Geschwindigkeit von 600 & mgr; l / min eingestellt.
- Unter Verwendung eines Nr 15 Klinge, einen kleinen horizontalen Schnitt andie Basis des rechten Oberschenkels. Schneiden Sie und verbreiten Sie die Membran im Inneren und reinigen Sie den Bereich mit einem sterilen Wattestäbchen.
- Trennen Sie die Muskeln mit einer Pinzette, bis der Ast der Vena femoralis sichtbar ist. Eine Hülle umgibt die Arterie, Vene und die Nerven. Klemmen Sie und ziehen Sie diese Hülle nach oben mit einer Pinzette (Feinspitze Dumont Pinzetten), und schneiden Sie einen kleinen Schnitt (2-4 mm ist in der Regel ausreichend) in der Nähe der Basis des dreieckigen Keil mit Vannas Frühjahr Schere. Erweitern Sie den Ausschnitt nach Bedarf.
- Trenne die Vene und Arterie mit einem stumpfen mikrochirurgische Haken parallel zur Richtung der Vene. Achten Sie darauf, die empfindlichen Membran und Venenzweige beschädigen. Dann heben Sie die Vene und trennen es von der darunter liegenden Bindegewebe.
- Besorgen Sie sich eine nadellose Nylonnaht und legen Sie sie neben der Vena femoralis. Verwendung des mikrochirurgischen Haken, heben die Vene und übergeben Sie die Feinspitze Zange unterhalb des distalen Bereich. Schnappen Sie sich ein Ende der Naht und ziehen Sie sie unter dieVene. Ligieren das distale Vene fest. Übergeben Sie eine zweite Naht auf ähnliche Weise unter dem proximalen Vene und machen einen lockeren Knoten.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Vene in der Nähe des distalen Ligation mit Vannas Frühjahr Schere. Erweitern Sie das Loch bei Bedarf mit den feinen Spitze Pinzette. Einige Blut kann durch die Aussparung austreten. Reinigen Sie den OP-Bereich mit kaltem, sterilem BSS und sterile Wattestäbchen.
- Halten der Venenwand an der Kante des Schnitts Katheterisierung des Behälters mit dem vorbereiteten Kochsalzlösung gespült Schlauch mit einem Nadelhalter. Ziehen Sie die proximalen Knoten um die Vene und Schläuche. Dann verankern Sie den Schlauch durch die Kopplung an die distalen Naht.
- Prüfen Sie die Qualität der Katheterisierung durch Drücken der Fußschalter, um Kochsalzlösung injiziert, <1 ml ausreichend ist. Sicherstellen, dass der Schlauch nicht blockiert ist und keine Lecks. Vorübergehend schließen Sie den Schnitt mit Nähten, die Katheterisierung und Gewebe zu schützen.
- Exposure des Sehnervs
- VORBEREITUNGe der Operationsstelle durch Abwischen der vorge rasierte Fläche über dem linken Auge je dreimal mit 10% Providon-Jod-Reinigungslösung, und 70% Ethanol.
- Einen Einschnitt entlang der Haut 2-3 mm hinter dem Auge mit einem No. 15 Klinge. Pinch und heben das Bindegewebe mit gezahnten Pinzette, und machen einen kleinen Schnitt mit Vannas Frühjahr Schere. Diese kleinen Einschnitt im allgemeinen etwa 5 mm in der Länge, kann aber länger sein, um größere Belastung für einen Chirurgen in Ausbildung. Weiterhin unverblümt durch das Bindegewebe entlang der überlegenen Rand der Augenhöhlenknochen zu zerlegen, wobei darauf zu vermeiden, unterbrechen die Blutgefäße. Reinigen Sie den OP-Bereich mit Wattestäbchen.
- Sezieren nach unten durch die Bindehaut, bis der M. rectus superior sichtbar ist. Kneifen und zu sezieren durch den Muskel; der Muskel tief aus der Umlaufbahn freigesetzt werden. Nun kann das umgebende Gewebe verwendet werden, um in der Rückzugs und Elevation des Auges zur leichteren Visualisierung zu unterstützen.
- ReTrakt des Hautlappen und des Bindegewebes seitlich und nach unten, und halten Sie ihn mit einer Naht und Gefäßklemme. Dadurch wird das Auge nach vorne und nach außen, um die fetthaltigen Hülle, die den Sehnerv umgibt offenbaren drehen.
- Ein Paar scharfe Pinzette vorsichtig und parallel zu den Sehnerv zu erweitern, um die Umgebung der Hülle Bindegewebe zu trennen. Den Sehnerv Berühren Sie nicht mit den scharfen Spitzen der Pinzette.
- Ein 5 mm Länge des Sehnervs und der umgebenden Hülle sollte jetzt sichtbar sein. Ein Netzwerk von Mikrogefäßen auf der Mantelfläche umgibt den Sehnerv. Diese werden während der Laserbestrahlung ausgerichtet sein.
- Intravenöse Injektion von Erythrosin B und Laserbestrahlung
- Tragen orangefarbene Schutzbrille zu jeder Zeit während des Betriebs der Laserbestrahlungsvorrichtung, um sich von dem grünen Laserlicht abzuschirmen. Schalten Sie den Laser, öffnen Sie die Verschlusszeit und stellen Sie die Spitzen- und Durchschnitts powers des Lasers notwendig. Schließen Sie den Auslöser.
- Positionieren Sie die Ratte in der Laserbestrahlungsvorrichtung. Um die richtige Strahl Plazierung zu gewährleisten, wird eine schwache Zielstrahl durch räumliches Filtern des Lasers durch ein 100 & mgr; m Durchmesser-Loch in der geschlossenen Verschlussblatt gebohrt produziert. Re-stellen den Sehnerv mit einem Paar feine Spitze Pinzette und positionieren Sie den Zielstrahl auf die intra Sehnerv zwischen 3 mm und 4 mm hinter dem Sehnervenkopf.
- Injizieren Sie die Lösung von 2% Erythrosin B über die Aktivierung der Infusionspumpe. Es kann für einige Sekunden zu zirkulieren, während der Chirurg fügt einen kleinen Tropfen BSS, um die Oberfläche des Sehnervs zu befeuchten.
- Überprüfen Sie die Position des Zielstrahl und klicken Sie dann auf den Fuß-Schalter, um die Bestrahlung zu initiieren. Eine orangefarbene Schutzfilter, die in den optischen Weg des Mikroskops aufgenommen ist, wird sofort ausgelöst durch das Öffnen des Verschlusses nach 1 s Verzögerung folgt.
- Bestrahlen den Sehnerv für 90 s mit einer Spitzenleistung von 135 MW und Durchschnittsleistung von 18 mW mit einem Strahl Zerhacker bei 250 Hz mit einem Arbeitszyklus von 15% erzeugt rotierenden (dies minimiert die thermische Effekte). Gelbe Fluoreszenz, als leuchtend orange durch die Sicherheitsfilter sichtbar gemacht wird von der überlegenen Oberflächen des Sehnervs emittiert werden und ist ausreichend, um sicherzustellen, dass der Strahl bestrahlt die Nerven symmetrisch.
- Nach der Bestrahlung wird die orangefarbene Schutzfilter automatisch. Microhemorrhage können in einigen Fällen beobachtet werden.
- Entlasten Sie die Traktion auf die zusätzlichen Augenmuskeln und gibt den Blick auf eine neutrale Position. Schließen Sie den Schnitt mit Knopfnähten. Dann ziehen Sie den Katheter und binden Sie die Oberschenkelvene fest, um ein Auslaufen zu verhindern; schließen mit Einzelknopfnähten. Bewerben antibiotische Salbe auf beide Einschnitte. Überprüfen Sie den Augenhintergrund, um die vaskuläre Integrität des Zentralvenen und Arterie zu überprüfen.
- Oberschenkelvene Katheterisierung
- Retrograde Markierungder retinalen Ganglienzellen (RGCs). HINWEIS: Um RGC Überleben, retrograde Markierung mit Fluorogold (FG) zu bewerten sollte eine Woche vor PION abgeschlossen sein. Das Verfahren ist im Detail in JoVE Protokoll 819 13 beschrieben.
- In Kürze: betäuben das Tier mit Ketamin (60 mg / kg) und Xylazin (8 mg / kg) und Rasieren des Kopfes.
- Chirurgisch Gestrüpp der Einschnittstelle und stellen Sie ein Mittellinienschnitt über den Kopf, um den Schädel freizulegen.
- Drill bilateralen Löchern durch den Schädel (ø 2x2 mm) 0,5 mm sowohl von den sagittalen und transversalen Nähte.
- Die zerebrale Inhalte, die mit einer Vakuumpumpe über den dorsalen Oberfläche des Colliculus superior (SC) liegt sorgfältig absaugen. Legen Sie dann ein kleines Stück Gelschaum mit 4% FG getränkt, auf der Oberfläche des SC.
- Schließen Sie den Schnitt mit Nähten und Pflege für das Tier mit Standard-Nachsorge.
- Post-operative Betreuung und Euthanasie
- Nach der Operation platzieren Tier in einem separaten sauberen Käfig auf einer Umlauf erhitzt Wasser Pad, bis das Tier wird gewonnen.
- Postoperative Analgetika (Buprenorphin HCl, 0,01 mg / kg) ist zweimal pro Tag für drei aufeinanderfolgende Tage verabreicht werden, um Beschwerden zu minimieren.
- Rat sollten getrennt gehalten und beobachtet, bis sie in der Lage, Brustlage zu erhalten und wieder ausreichend Bewusstsein werden.
- Anzeichen für eine Erholung und eine gute Gesundheit täglich für mindestens 5 Tage nach der Operation oder bis Nahtentfernung und angemessene Heilung der Operationsstelle, je nachdem, was spätestens tritt überwacht.
- Euthanize die Tiere durch Perfusion mit 4% PFA in wissenschaftlich geeigneten Zeitpunkten nach der Operation nach investigative Interesse.
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Representative Results
Die sich ergebende ischämische Verletzung durch diese Technik induzierte ergibt sich eine allmähliche, aber ausgesprochen Tod von retinalen Ganglienzellen nach ischämischem Axon Verletzungen. Dies ist eine klinisch relevante Ergebnis ähnlich wie bei der menschlichen Krankheit beobachtet. FG retrograde Markierung dient zur RGC Überleben nach PION quantifizieren. Das gleiche Verfahren wird angewendet, um ein erfolgreiches Modell Erstellung validieren sowie um die Auswirkungen der verschiedenen Therapieschemata zu bewerten. Abbildung 1 zeigt repräsentative konfokale Bilder von FG-positiven Zellen in der Netzhaut Flachlager von Steuer (Abbildung 1A), scheinbehandelten (Laser nur / nein Erythrosin B, Abbildung 1B), und 2 Wochen nach der PION behandelt (1C) Tiere. Im Vergleich zu den Kontrolltieren, weniger FG-positive Zellen in Tieren von 2 Wochen nach PION Induktions vorhanden. Kein signifikanter Unterschied zwischen der Anzahl von RGCs bei der Kontrolle und scheinbehandelten (Laser nur / keine Erythrosin B) Tiere beobachtet. This gibt an, dass das Pion induzierten RGC Verlust wird durch die Kombination von Erythrosin B und Laserstrahlung von dem Laser allein ausgelöst anstelle von thermischer Energie.
Abbildung 1. retinalen Ganglienzellen (RGC) Überleben nach posterior ischämische Optikusneuropathie (PION). Retinalen Ganglienzellen mit retrograd Fluorogold etikettiert wurden in retinalen Flachhalterungen (AC) abgebildet. Zwei Wochen nach PION wird eine ähnliche Anzahl von RGCs in Steuerung (A) und scheinbehandelten (B, Laser nur / nein Erythrosin B) Augen beobachtet. Jedoch ist die Zahl der markierten RGCs Fluorogold-merklich in der Einstellung der PION (C) reduziert. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere versio ansehenn dieser Figur.
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Acknowledgments
Wir sind auf Eleut Hernandez für die Tierhaltung, Gabe Gaidosh für die Mikroskopie Fachwissen und Khue Tran und Zhenyang Zhao für die Videobearbeitung verschuldet. Diese Studie wurde vom National Eye Institute finanziert gewährt R01-EY022129 zu JLG und P30 Zuschüsse EY022589 zu UCSD und EY014801 UM; der American Heart Association, die James und Esther König-Stiftung, die Doktoranden-Austauschprogramm Fonds der Fudan University Graduate School (No. 2010033) und eine zweckgebundene Zuwendung der Forschung zur Verhütung Blindheit, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 532-nm Nd:YAG laser | Laserglow | LRS-532-KM-200-3 | |
| Beam chopper | custom-made | custom-made | |
| Mechanical shutter and corresponding shutter drive timer | Vincent Associates | SD-10 | |
| 25-cm focal length spherical lens | CVI/Melles-Griot | 01 LPX 293 | plano-convexBK7 glass lens with HEBBARTM antireflection coating |
| Erythrosin B | MP Biomedicals | 190449 | |
| Fluorogold | Fluorochrome,LLC | ||
| Gelfoam | Cardinal Health | CAH1203421 | |
| Polyethylene tubing (PE10) | BD Intramedic | 427400 | |
| No. 10 Blade | Miltex | 4-110 | |
| Fine Forceps | F.S.T. | 91150-20 | Dumont #5 rustless non-magnetic |
| Forceps with Teeth | F.S.T. | 11153-10 | Germany stainless |
| Forceps | F.S.T. | 18025-10 | Germany stainless |
| Vannas spring scissors | F.S.T. | 2-220 | JJECK Stainless |
| Polyglactin suture | Ethicon | J488G | 7-0 suture |
| hemostat | F.S.T. | 12075-12 | Germany stainless |
References
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