Abstract
Инфекция гриппа связана с примерно 36 000 смертей и более 200 000 случаев госпитализации каждый год в Соединенных Штатах. Непрерывное появление новых штаммов вируса гриппа из-за мутации и повторного ассортимента усложняет контроль над вирусом и требует постоянного развития новых лекарственных препаратов и вакцин. Лабораторная исследование гриппа требуется надежный и экономически эффективный способ распространения вируса. Здесь полный протокол, предусмотрена гриппа A распространения вируса в плодородных куриных яиц, которые последовательно дает высокий титр вирусных акций. Вкратце, свободных от патогенов (SPF) оплодотворенные куриные яйца сыворотки инкубировали при 37 ° С и влажности 55-60% в течение 10 - 11 дней. За этот период, развитие эмбриона можно легко контролировать с помощью яиц Candler. Вирус прививки проводят путем инъекции вируса в наличии аллантоидной с помощью иглы. После 2 дней инкубации при 37 ° С, яйцаохлажденные в течение по меньшей мере 4 ч при 4 ° С. Теплый выше мешка воздуха и хориоаллантоисной мембране затем осторожно открывали и аллантоисной жидкости, содержащей вирус собирают. Жидкость очищается от мусора с помощью центрифугирования, аликвоты и переносят в -80 ° С в течение длительного хранения. Большое количество (5-10 мл вируса, содержащих жидкости в яйце) и высокий титр вируса, который, как правило, достигнутые с этим протоколом составил использование яиц для приготовления вируса наш способ выгодно, в частности, для исследований в пробирке, которые требуют больших количествах вируса, в которых необходимы высокие дозы одного и того же вируса складе.
Introduction
Грипп продолжает оставаться серьезной угрозой для здоровья человека. Это потенциально разрушительными респираторное заболевание с большой глобальное бремя в результате чего до 500000 смертей в мире ежегодно 1. Вирусы гриппа в семье Orthomyxoviridae и нести 8 отрицательной смысле одноцепочечной РНК в их геноме 1,2. Высокая изменчивость (то есть, антигенная "дрейф") вирусного генома предотвращает длительный иммунитет. Кроме того, грипп является более устойчивым к антивирусным препаратам 3.
2009 пандемии гриппа H1N1 подчеркнул все сложные вопросы, связанные с болезнью гриппа (пандемического штамма, против вирусного сопротивления, отложенный вакцина). Вакцинный препарат определяется ежегодно Всемирной организацией здравоохранения для наиболее вероятно патогенных штаммов вируса гриппа (одной для H1N1, H3N2 и гриппа В) 4. Поскольку этот способ основан на предсказанной штамма вируса гриппас, патогенные штаммы иногда неправильно определены и эффективность вакцины резко падает. Кроме того, появление новых штаммов гриппа может обойти эти профилактические программы, вызывающие пандемию болезни 2.
Создание универсальной вакцины гриппа был неуловим 5. Таким образом, исследования должны продолжаться и в понимании патогенеза поражения легких. Для объекта лабораторных исследований, несколько методов были разработаны для выделения вируса и распространения 6. Вирусы гриппа человека могут быть усилены в различных млекопитающих клеточных субстратов. Тем не менее, генерирующие высокий титр вирусов в больших количествах лучше всего достигается в яйцах с эмбрионами. Следующий протокол описывает метод для гриппа A распространения вирусов и хранения из существующих запасов вируса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Общие замечания: Выполните все процедуры, связанные с манипуляциями с яйцом в стерильных условиях и стерильно метод следует использовать соответствующим образом. Предварительная очистка всего оборудования с 70% этанола перед использованием. В общем, вирус гриппа прививки и урожай должен быть проведен в BSL-2 лаборатории. Однако, если этот протокол используется для распространения гораздо более патогенных вирусов гриппа (например, пандемии и предпандемические штаммы, штаммы, которые представляют собой опасность для скота и птицы, высоко патогенные штаммы птичьего гриппа, штамм 1918 Н1N1), более высокий уровень биобезопасности и в некоторых случаях, биозащиты меры предосторожности и разрешения не требуется. Комитет местные институциональные биобезопасности должен утвердить все исследования с участием вируса гриппа.
1. Подготовка яйца для прививки
- Получить сыворотке свободных от патогенов (SPF) недавно оплодотворенная птичьего яйца из подходящего поставщика. Как правило, используются куриные яйца. Яйца должны быть намиред сразу по прибытии.
- После прибытия помещают яйца в увлажненной яйца инкубатора с автоматическим яйца токарем, чтобы повернуть яйца, регулярно. Если автоматическая яйцо токаря нет, вручную поворачивать яйца, по крайней мере 2-3 раза в день (не забудьте надеть перчатки и держать все максимальную стерильность).
- Инкубируйте яиц при 37 ° С и 55-60% влажности в течение 10-11 дней.
2. Яйцо Просвечивание
- Используйте яичный Candler изучить яйцо против яркого света в темной комнате, чтобы проверить яйца на бесплодия просвечивании примерно через 7 или 8 дней инкубации.
- Протрите яйца Candler с 70% этанола. Изменить перчатки часто и дезинфицировать 70% -ным этанолом, чтобы минимизировать риск загрязнения патогенными микроорганизмами.
- Удалите яйца из инкубатора и поместить их в пустых упаковок для яиц.
- Выключите свет в комнате.
- Держа большой конца каждого яйца по одному в отношении Candler.
- Соблюдайте яйца всего определитсяе, если он является плодородной или бесплодной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкие кровеносные сосуды, ведущие к бобовидным эмбриона должны быть четко видны. Неоплодотворенных яиц будет выглядеть как небольшое пятно крови с видимой яичным желтком.
- Отменить яйца, которые неоплодотворенных, и вернуть жизнеспособных яиц в инкубатор. Не оставить снаружи яйца в инкубаторе в течение более чем 30 мин. Если статус яйцо не может быть подтверждена, выделите ее и соблюдать его позже.
3. Подготовка Касперского инокулята
- Развести вируса гриппа запас до приблизительно 10 3 - 10 4 БОЕ / мл в стерильном PBS, содержащем 10 мМ HEPES (рН 7,4). Критический шаг: Развести вирус Stock непосредственно перед использованием и держите разбавленный вирус на льду все время.
4. гриппа Вирус Прививка с помощью аллантоисной пути
- В день введения вируса (день 10 или 11), свечи яйца снова и устранить мертвые эмбрионы. Различают живые эмбрионы отИщу движения внутри яйца.
- Удалите три яйца из инкубатора, а также организовать яйца в отдельном держателе с воздушный мешок вверх.
- Отметить воздушное пространство из яиц с перманентным маркером.
- Вымойте яичной скорлупы над воздушным пространством с 70% этанола.
- Положите яйца с воздушным пространством вверх в яйце коробке и в области биобезопасности капот (BSL-2).
- Используйте стерильную 18G иглу, чтобы пробить небольшое отверстие в оболочке над воздушной мешка каждого яйца. Будьте осторожны, чтобы не вставить иглу слишком глубоко, чтобы избежать колоть эмбрион или желток.
- Составьте разбавленный вирус гриппа в стерильный шприц 1 мл и приложить 22G иглу.
- Тщательно продвижения шприц с иглой под углом 45 ° в аллантоидной.
- Внедрить 0,2 мл разбавленного вируса гриппа.
- Повтор инъекции с двумя другими яиц, а затем выбросить в шприц и иглу.
- Печать отверстие каплю клея из клеевого пистолета (или растопленного парафина). Ве осторожны, чтобы клей не просачивается внутрь яйца.
- Место яйца обратно в яйца инкубатора воздушное пространство указал вверх.
- Повторите шаги 4.2 - 4.12, пока все яйца не были привиты.
5. Время инкубации
- Инкубируйте инфицированных яиц без поворота на 37 ° С и ~ 60% влажности.
- Выбор оптимального времени инкубации в зависимости от типа вируса гриппа. Выдержите гриппа A в течение 48 ч; инкубировать гриппа В и С в течение 72 ч.
6. гриппа Вирус урожая
- После инкубационного периода, охладить яйца при 4 ° С в течение минимум 4 ч (или O / N), чтобы убить зародыш и сужают кровеносные сосуды, чтобы уменьшить риск загрязнения зараженный аллантоисной жидкость с кровью. Для этого, чтобы предотвратить эритроциты поглощать вирус, который снижает выход. Кроме того, охлажденные яйца в течение 30 мин при -20 ° С; Однако это увеличивает риск загрязнения крови.
- После того, как яйца были достаточно охлажденные, передавать яйца капюшоном биобезопасности. Положите яйцо в твердой держатель воздушный мешок вверх. Очистите поверхности яйца с 70% этанола.
- Используйте стерильные ножницы, чтобы открыть выше воздушного мешка скорлупы. Снимите оболочку вокруг воздушного мешка, стараясь при этом не разрушить хориоаллантойной мембрану.
- Откройте хориоаллантойной мембрану с стерильных тупыми щипцами. Аккуратно отодвиньте эмбриона и желточного мешка с небольшим шпателем или ложкой. Будьте осторожны, не разорвать желток.
- Использование 1 мл Eppendorf пипетки, тщательно собрать аллантоисной жидкости. При необходимости, наклоните яйцо немного в сторону, чтобы собрать как можно больше жидкости, как это возможно.
- Зерноуборочный аллантоисной жидкости из всех яиц в 50 мл коническую трубку из пластика. Держите труб на льду в течение всего времени сбора урожая вируса. Одно яйцо дает 5 - 10 мл слегка желтоватым жидкости.
- Спин-вирус, содержащий аллантоисной жидкости в 1000 х г в течение 10 мин при 46; С для осаждения мусора. Передача прозрачную жидкость в новую пробирку на 50 мл хранили на льду. Утилизация яйца в BSL-2 контейнер для отходов.
7. Хранение
- Сразу аликвоту очищенного аллантоисной жидкости (например, 50, 100 или 500 мкл аликвоты) и оснастки заморозить в жидком азоте. Трансфер замороженных запасов вируса до -80 ° C морозильник для длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Различные способы были разработаны для титр вируса гриппа. Одно соображение при выборе подходящего метода является то, что некоторые определения всех частиц, независимо от жизнеспособности (например, гемагглютинина анализа), тогда как другие на основе инфекционной, которые будут оценивать жизнеспособных вирионов (например, бляшек) 6. Здесь титр вируса аллантоисной жидкости собраны из куриных яиц, зараженных вирусом гриппа мыши адаптированы (/ PR / 8/34) была определена методом бляшек (рис 1) и гемагглютинации (рис 2).
Вирус гриппа инфекция вызывает цитопатический эффект, который приведет в бляшках (круговые зоны лизированных клеток) с образованием на монослой клеток. Бляшки были визуализированы с помощью окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым, и 65 бл шки подсчитывали в скважине с разбавлением вируса (рисунок 1) 10 -12. Поскольку 500 л разбавленной вирусной складе маспомещенными на клетках, конечный титр 1,3 х 10 14 БОЕ / мл.
Гемагглютинации является метод титр вируса гриппа базы на способности вируса, чтобы подключиться к поверхности красных кровяных клеток. Вирусную суспензию будет склеивать эритроциты, тем самым предотвращая их оседание из суспензии. С помощью серийных разведений вируса в 96-луночный планшет с (либо V- или круглым дном) и добавления фиксированного количества эритроцитов, титр вируса может быть определено. Четко отрицательный результат наблюдался с 1 по: 2 10 титр вируса в 50 мкл (рис 2). Таким образом, окончательное титр 2,1 х 10 4 HAU / мл.
Рисунок 1. Количественная оценка PR8 титр вируса по бляшек. Монослой MDCK клеток, инфицированных 10-кратным сериал разведени PR8 (10 -1 - 10 -12) в течение 1 ч, промывают, а затем обложен 0,6% -ного раствора агарозы. После инкубации при 37 ° С в течение 72 ч, агар осторожно удаляли и клетки фиксировали и окрашивали 0,25% кристаллическим фиолетовым. Образование зубного налета был сравнивать неинфицированному управления (CTR). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. гемагглютинации (ГА) Анализ на Титр полученного Яйцо-PR8 вирус гриппа. Вируса PR8 серийно разводили в 2 раза в PBS и смешивают с 50 л 0,5% индейки эритроцитов. Растворы готовили в quadruplicates, и фотографии были сделаны после 1 ч инкубации при комнатной температуре. Отрицательные результаты отображаются в виде точек в центре скважин, а положительные результатыобразуют единую красноватый цвет по всей скважине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Грипп вызывает большое глобальное бремя болезней, и работа продолжается в понимании патогенеза поражения легких 7. Для облегченного исследований в этой смертельной болезни, различные методы были разработаны для распространения вируса гриппа 6. Здесь мы опишем технику для производства вируса гриппа в куриных яйцах. Преимущество этого метода состоит в том, что он является высокой воспроизводимостью и приводит к большим количеством высоким титром вируса гриппа запасов, которые часто необходимо для исследований ин витро.
Большинство лабораторий будет возможность развивать этот протокол быстро и легко с минимальными стартовыми расходами. Хотя мы рекомендуем инвестировать в яйце инкубатора с автоматическим токарь, этот протокол может быть завершена без такого оборудования, но будет более трудоемким. Мы также рекомендуем использовать коммерческими фирмами исследований на покупку оплодотворенных яиц, чтобы гарантировать согласованность и стерильность яиц. Управление Laboratрии благосостояния животных (OLAW) интерпретация Служба общественного здравоохранения (PHS) Политика на гуманное лечение и использования лабораторных животных состояний для исследований использования живых эмбрионом птичьего яйца, которые политики PHS применима лишь после вылупления. Таким образом, большинство учреждений, не требуют утверждения IACUC этого протокола. Тем не менее, могут варьироваться в зависимости среди учреждений и утверждение Комитет по институциональной биобезопасности будет необходимо до начала этого протокола.
При работе с вирусом, он имеет первостепенное значение для держать вирус на 4 С, после сбора урожая аллантоисной жидкости из инфицированной эмбрионом яйца. Каждое яйцо будет производить между 5-10 мл аллантоисной жидкости, и титр зависит от штамма вируса гриппа. Наша лаборатория регулярно использовали этот метод для распространения мыши приспособлены штамм H1N1 гриппа (A / PR / 8/34). Этот протокол также может быть использован для проведения клинических образцах, но в этой ситуации, прививка амниотической полости может быть предпочтительно из-за рresence 2,6-связанных сиаловых кислот, необходимых для связывания в амниотической облицовки 8,9. Еще одно соображение, что этот метод не может быть идеальным для распространения вирусов птичьего гриппа (например, штаммы H5N1) в связи с патогенностью для эмбриона.
Различные методы титрованием вируса гриппа, были разработаны все из которых имеют свои преимущества и недостатки. В самом деле, вирусный количественное может быть на основе белков (например, гемагглютинина анализа, ELISA), нуклеиновой кислоты на основе (например, количественной ПЦР), или функциональный (например, вирусный бляшек) 6. Номера функциональные тесты будут определять общие вирусные титры независимо от того, если они живут или мертвые вирусные частицы. Таким образом, проверка на инфекционной активности вируса гриппа будет измерять живых вирусов, и позволяют сопоставимые функциональной эквивалентности от партии к партии. Образующих бляшки анализ является широко используется анализ, который может оценить титры живой вир гриппанам, но может быть медленным и затруднительным выполнить 10. Для сравнения, гемагглютинин анализ прост и понятен, но не позволяет оценить жизнеспособность и определяет все частицы гриппа.
При этом мы предоставляем относительно простой способ для распространения вируса гриппа с высоким титром. De Novo начало этого протокола в лаборатории является простым, и исходные материалы и оборудование являются относительно недорогими.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A.
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
