Abstract
인플루엔자 감염은 약 36,000 명이 사망하고 미국에서 20 만 명 이상의 입원 매년와 연결되어 있습니다. 돌연변이 다시 구색 인한 새로운 인플루엔자 바이러스 균주의 연속 출현 바이러스의 제어를 복잡하게하고 신규 약물과 백신의 개발을 필요로 영구. 인플루엔자의 실험실 기반의 연구는 바이러스의 전파에 대한 안정적이고 비용 효율적인 방법이 필요합니다. 여기에, 포괄적 인 프로토콜은 지속적으로 높은 역가의 바이러스 주식을 산출 비옥 한 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파, 제공됩니다. 11 일 - 간단히 말해, 혈청 무균 (SPF) 수정 된 닭고기 달걀은 37 ° C와 10 55~60% 습도에서 배양된다. 이 기간 동안, 배아 발달 쉽게 알 캔 들러를 사용하여 모니터 할 수있다. 바이러스 접종은 바늘을 사용하여 공동 내로 뇨 바이러스 스톡의 주사에 의해 수행된다. 37 ° C에서 배양 2 일 후, 계란은4 ° C에서 적어도 4 시간 동안 냉장. 공기 주머니와 상기 멤브레인 융모 껍질을주의 깊게 개방하고, 바이러스를 함유 막액 수확된다. 유체를 원심 분리에 의해 먼지로부터 클리어 분주 장기 저장에 대해 -80 ° C에 전달된다. 다량 보통이 프로토콜에 의해 달성되고 높은 바이러스 역가 (바이러스 - 함유 달걀 당 유체를 5-10 ml)을 대량으로 요구하는 시험 관내 연구를 위해, 특히 바이러스 제제 우리 유리한 방법 계란의 사용량을 만들었다 바이러스의 것과 동일한 바이러스 주식의 높은 복용량이 필요하다.
Introduction
인플루엔자는 인간의 건강에 큰 위협이되고 있습니다. 그것은 큰 글로벌 부담이 매년 전세계에서 1 500000 사망까지 일으키는 잠재적으로 치명적인 호흡기 질환이다. 인플루엔자 바이러스는 가족 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)에있는 자신의 게놈 1,2 8 음의 감각 단일 가닥 RNA를 수행한다. 바이러스 게놈의 높은 가변성 (즉, 항원 "드리프트")는 장기 면역을 방지 할 수 있습니다. 또한, 인플루엔자 항 바이러스제 3 더욱 강하다.
2009 H1N1 인플루엔자 대유행 인플루엔자 질병 (유행성 변형, 항 바이러스 성, 지연 백신 생산)과 관련된 모든 어려운 문제를 강조했다. 백신 제제는 대부분 병원성 인플루엔자 균주 4 (H1N1, H3N2 인플루엔자 B 각각 하나씩)에 대한 세계 보건기구 (WHO)에 의해 매년 결정된다. 이 방법은 예측 인플루엔자 균주를 기반으로하기 때문에들, 병원성 균주는 때때로 잘못 파악하고 백신 유효성이 크게 저하된다. 더욱이, 신규 한 인플루엔자 균주의 출현은이 전염병을 일으키는 이러한 예방 프로그램을 회피 할 수있다.
범용 인플루엔자 백신의 생성은 5 애매하고있다. 따라서 연구는 폐 손상의 기전을 이해하기에 계속해야합니다. 시설 실험실 연구에, 여러 가지 방법이 바이러스 분리 및 전파 (6)을 위해 개발되었다. 인간 인플루엔자 바이러스는 포유 동물 세포의 다양한 기판들에서 증폭 될 수있다. 그러나, 대량으로 생성하는 높은 역가의 바이러스는 가장 유정란에 달성된다. 다음 프로토콜은 인플루엔자에 대한 기존의 바이러스 주식에서 바이러스 전파 및 저장 기술에 대해 설명합니다.
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Protocol
일반 발언 : 주 멸균 조건에서 계란의 조작과 관련된 모든 절차를 수행하고 멸균 기술 규격 제품을 사용한다. 70 % 에탄올로 모든 장비를 사용하기 전에 사전 깨끗한. 일반적으로, 인플루엔자 바이러스 접종 수확 BSL -2- 실험실에서 수행되어야한다. 그러나,이 프로토콜을 전파하는 데 사용되는 경우 훨씬 더 병원성 인플루엔자 바이러스 (예를 들어, 유행성 및 사전 유행성 균주, 가금류 및 가축, 고병원성 조류 인플루엔자 균주, 1918 년 H1N1 균주에 위험을 초래할 균주), 높은 바이오 안전성 수준 어떤 경우에는, 생물 안전주의 사항과 권한이 필요합니다. 지역 기관 바이오 안전성위원회는 인플루엔자 바이러스와 관련된 모든 연구를 승인해야합니다.
예방 접종에 대한 계란 1. 준비
- 적합한 공급 업체에서 혈청 무균 (SPF) 갓 수정 된 조류의 알을 얻습니다. 일반적으로 닭고기 달걀 사용된다. 계란은 우리를해야한다바로 도착 에디션.
- 자동 계란 터너와 가습 계란 인큐베이터에 도착 장소 계란은 계란을 정규적으로 회전시. 자동 계란 터너를 사용할 수없는 경우, 수동으로 적어도 2 ~ 3 회 하루 (장갑을 착용하고 가능한 한 무균 모든 항목을 유지하는 확인) 계란을 회전 할 수 있습니다.
- 37 ° C와 10-11일에 대한 55~60% 습도에서 알을 품어.
2. 계란 캔들링
- 배양 7, 8 일 후에 캔들링에 의해 불임 달걀을 확인하는 어두운 방에서 밝은 빛에 계란을 검사 할 수 달걀 캔 들러를 사용합니다.
- 70 % 에탄올로 계란 캔 들러를 닦습니다. 종종 장갑을 변경하고 병원체에 의한 오염의 위험을 최소화하기 위해 70 % 에탄올로 소독.
- 인큐베이터에서 계란을 제거하고 빈 달걀 종이팩에 배치합니다.
- 실내 조명을 끄고.
- 캔 들러에 대해 한 번에 각 계란 하나의 큰 끝을 잡고.
- determin하기 위해 달걀을 준수전자는 비옥 한 또는 불임 인 경우.
참고 : 콩 모양 배에 이르는 얇은 혈관이 명확하게 볼 수 있어야합니다. 미 수정 달걀은 볼 달걀 노른자와 작은 핏자국으로 표시됩니다.
- 미 수정있는 계란을 폐기하고, 인큐베이터 가능한 계란을 반환합니다. 30 분 동안 인큐베이터 밖에서 알을 두지 마십시오. 계란의 상태를 확인할 수없는 경우이를 표시하고 나중에 관찰.
바이러스 접종 3. 준비
- 10 mM의 HEPES (PH 7.4)를 포함 멸균 PBS에서 104 PFU / ㎖ - 10 3 인플루엔자 바이러스 주식을 희석. 중요한 단계 : 즉시 사용하기 전에 바이러스 주식을 희석하고 얼음에 모든 시간을 희석 바이러스를 유지합니다.
뇨 경로를 통해 4. 인플루엔자 바이러스 예방 접종
- 바이러스 접종 (10 일 또는 11)의 날에 다시 계란을 촛불과 죽은 배아를 제거 할 수 있습니다. 살아있는 배아를 구별계란 내부 이동을 찾고.
- 인큐베이터에서 세 알을 제거하고 공기 주머니 위로 별도의 홀더에 계란을 마련.
- 영구 마커와 계란의 공기 공간을 표시합니다.
- 70 % 에탄올로 공기 공간 위에 달걀 껍질을 씻으십시오.
- 계란 판지 및 바이오 안전성 후드 (BSL-2)에 공기 공간을 최대로 계란을 넣습니다.
- 각 계란의 공기 주머니를 통해 껍질에 작은 구멍을 주먹으로 멸균 18G 바늘을 사용합니다. 배아 또는 노른자를 찔러 방지하기 위해 너무 깊이 바늘을 삽입하지 않도록주의하십시오.
- 멸균 1 ML의 주사기에 희석 된 인플루엔자 바이러스를 그려 22G 바늘을 연결합니다.
- 조심스럽게 뇨 공동으로 45 ° 각도로 바늘과 주사기를 진행합니다.
- 희석 인플루엔자 바이러스 0.2ml를 주입한다.
- 다른 두 계란 주사를 반복 한 다음 주사기와 바늘을 폐기합니다.
- 글루건 (또는 녹은 파라핀 왁스)에서 접착제의 드롭 구멍을 밀봉합니다. B전자 접착제 계란 내부에 누출되지 않도록주의.
- 공기 공간이 위쪽으로 지적와 계란 인큐베이터에 계란을 다시 배치합니다.
- 반복 4.2 단계 - 4.12 모든 계란 접종 때까지.
5. 보육 시간
- 37 ° C와 ~ 60 %의 습도에서 끄지 않고 감염된 계란을 품어.
- 인플루엔자 바이러스 유형에 따라 최적의 배양 시간을 선택한다. 48 시간 동안 인플루엔자를 품어; 72 시간 동안 인플루엔자 B와 C를 품어.
6. 인플루엔자 바이러스 수확
- 인큐베이션 기간 후, 배아를 죽이고 피 감염된 막액 오염의 위험을 최소화하기 위해 혈관을 수축 4 시간 (또는 O / N) 이상 동안 39 ° C에서 계란을 냉각. 수율을 감소 바이러스, 흡수로부터 적혈구를 방지하기 위해 이렇게. 또한, 냉각 계란 30 분 -20 ° C에서; 그러나 혈액이 오염의 위험을 증가시킨다.
- 계란이 충분히 냉각 된 후에, 바이오 안전성 후드에 계란을 전송합니다. 공기 주머니가 위로 향하게 회사 홀더에 달걀을 놓습니다. 70 % 에탄올로 달걀 표면을 청소합니다.
- 공기 주머니 위에 달걀 껍질을 열 멸균 가위를 사용합니다. 융모 막을 파괴하지 않도록주의하면서 공기 주머니 주위에 껍질을 제거합니다.
- 멸균 무딘 집게로 융모 막을 엽니 다. 조심스럽게 배아와 작은 주걱이나 숟가락으로 난황을 옆으로 이동합니다. 노른자를 파열되지 않도록주의하십시오.
- 1 에펜 도르프 피펫을 사용하여 조심스럽게 막액를 수집합니다. 필요한 경우, 옆으로 약간 많은 유체 가능한 수집 계란을 기울입니다.
- 50 ㎖ 플라스틱 원뿔 관에 모든 계란에서 막액을 결합합니다. 바이러스 수확하는 동안 항상 얼음에 튜브를 유지합니다. 하나의 계란 생산량 5 - 약간 노란 유체 10 ㎖.
- 4에서 10 분 동안 1,000 XG에서 바이러스 - 함유 막액 스핀6; C 파편 펠렛합니다. 새로운 50 ㎖ 튜브에 맑은 액체를 이동시켜 얼음에 보관. BSL-2 폐기물 용기에 달걀을 폐기하십시오.
7. 저장
- 즉시 뇨 명확히 유체 (예를 들어, 50, 100 또는 500 UL 분량 씩) 나누어지는 스냅 동결을 액체 질소에. 냉동 바이러스 주식 장기 저장을 위해 -80 ° C 냉장고에 전송합니다.
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Representative Results
여러 방법은 인플루엔자 바이러스 역가를 위해 개발되었다. 적절한 방법을 선택하는 하나의 고려 사항은 일부 가능한 비리을 평가하는 관계없이 다른 사람이 감염을 기반으로하는 반면 생존 능력 (예를 들어, 헤 마글 루티 닌 분석)의 총 입자를 결정하는 것입니다 (예를 들면, 상패 분석) 6. 여기서, 마우스 구성된 인플루엔자 바이러스 (A는 / PR / 34분의 8) 접종 닭고기 계란에서 수집 막액의 바이러스 역가는 플라크 분석 (도 1)과 혈구 응집 분석 (도 2)에 의해 결정 하였다.
인플루엔자 바이러스는 감염 세포의 단층에 플라크 형성을 초래할 세포 변성 효과 (세포 용해의 원형 영역)를 야기한다. 플라크 크리스탈 바이올렛으로 세포를 염색하여 가시화하고, 65 플라크 바이러스 희석 10-12 (도 1)와 함께 웰에 계수 하였다. 희석 바이러스 주식의 500 L w 때문에셀 배치로, 최종 역가는 1.3 × 1014 PFU / ㎖이다.
혈구 응집 분석은 적혈구의 표면에 부착하는 바이러스의 능력에 인플루엔자 바이러스 염기 역가 방법이다. 바이러스 현탁액 따라서 현탁액에서 침전되지 못하게 적혈구 응집한다. 96- 웰 플레이트 (V- 있거나 환저)에서 바이러스의 일련의 희석 물을 사용하여 적혈구의 고정 된 양을 첨가함으로써, 바이러스 역가를 결정할 수있다. 50 μL (그림 2)에서 바이러스의 2 (10) 희석 : 명확하게 부정적인 결과는 1이 관찰되었다. 따라서, 최종 역가는 2.1 × 104 HAU / ㎖이다.
도 1 플라크 분석으로 정량 PR8 바이러스의 역가. MDCK 세포의 단층은 10 배 세리아 감염시켰다PR8 L의 희석 (10-1 - 10-12)에서 1 시간 동안, 세정 한 후, 0.6 % 아가로 오스 용액을 입혔다. 72 시간 동안 37 ℃에서 배양 후, 아가 조심스럽게 제거하고, 세포를 고정하고 0.25 % 크리스탈 바이올렛으로 염색 하였다. 플라크 형성이 감염되지 않은 제어 (CTR)을 비교 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
역가 계란 유래 PR8 인플루엔자 바이러스에도 2 적혈구 응집 (HA) 정량법. 바이러스 PR8 직렬 PBS로 2 배 희석하고, 0.5 % 칠면조 적혈구 50㎕를 함께 혼합 하였다. 희석은 quadruplicates에서 제조하고, 사진은 실온에서 1 시간 배양 후 촬영 하였다. 부정적인 결과는 긍정적 인 결과 반면 우물의 중심에 점으로 표시잘 걸쳐 균일 한 붉은 색을 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인플루엔자는 질병의 큰 부담을 글로벌 초래하고 작업 폐 손상 (7)의 병인을 이해로 계속된다. 이 치명적인 질병의 촉진 연구, 다양한 방법 인플루엔자 바이러스 (6)을 전파하기 위해 개발되었습니다. 여기서는 닭고기 계란 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 설명한다. 이 방법의 장점은 높은 재현성 있다는 종종 시험 관내 연구에 필요한 높은 역가 인플루엔자 바이러스 주식, 다량 초래한다.
대부분의 기관은 최소한의 초기 비용으로 신속하고 쉽게이 프로토콜을 개발할 수있을 것이다. 우리는 자동 터너와 계란 인큐베이터에 투자를하는 것이 좋지만,이 프로토콜은 장비없이 완료 될 수 있지만, 더 힘든 것입니다. 우리는 또한 계란의 일관성과 불임을 보장하기 위해 수정란의 구입 상업 시장 조사 업체를 사용하는 것이 좋습니다. LABORAT의 사무실동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 보건 서비스 (PHS) 정책의 모리 동물 복지 (OLAW) 해석은 PHS 정책이 부화 후 만 적용 살아있는 인간 백신 조류 계란의 연구에서 사용 상태. 따라서 대부분의 기관이 프로토콜에 대한 IACUC 승인이 필요하지 않습니다. 그러나 정책은 기관에 따라 다양하고, 기관 바이오 안전성위원회의 승인이 프로토콜을 시작하기 전에해야합니다.
바이러스로 작업 할 때, 그것은 감염된 발육 계란에서 막액을 수확 한 후 4 ℃에서 바이러스를 유지하기 위해 매우 중요합니다. 각각의 난은 막액 5-10 ml이다 생산할 것으로 예상하고, 역가 인플루엔자 바이러스 균주에 의존한다. 우리 연구소는 정기적으로 마우스 적응 H1N1 인플루엔자 균주 (A / PR / 8 / 34) 전파하기 위해이 방법을 사용하고있다. 이 프로토콜은 P로 인해 임상 샘플에 대해 또한 사용될 수 있지만, 이러한 상황에서, 공동 양수 접종은 바람직 할 수있다2,6- 링크 된 시알 산의 resence는 양수 안감 8,9 내에서 바인딩이 필요했습니다. 또 다른 고려 사항은이 방법에 의한 배아에 대한 병원성에 전파 조류 인플루엔자 바이러스 (예, H5N1 균주)에 적합하지 않을 수 있다는 것입니다.
인플루엔자 바이러스를 titering하는 다양한 방법은 장점과 단점을 가지고있는 모든 개발되었다. 실제로, 바이러스 정량화 될 수 단백질 - 기반 (예를 들면, 헤 마글 루티 닌 어 세이, ELISA), 핵산 계 (예를 들어, 정량적 PCR) 또는 기능 (예를 들면, 바이러스 플라크 분석) 6. 비 기능적 분석은 상관없이 생활 또는 죽은 바이러스 입자 경우 총 바이러스 역가를 결정합니다. 따라서, 인플루엔자 바이러스의 감염 활동을 테스트하는 것은 바이러스를 살고 측정 및 부지에서 많은 비교 동등한 기능을 허용합니다. 플라크 형성 분석 라이브 인플루엔자 비르의 역가를 평가할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 분석입니다우리하지만, 속도가 느리고 (10)를 수행 할 번거로울 수 있습니다. 이에 비해, 헤 마글 루티 닌 어 세이는 단순하고 간단하지만 생존력을 평가하지 않으며, 모든 인플루엔자 입자를 결정한다.
여기서, 우리는 높은 역가 인플루엔자 바이러스를 전파하는 비교적 쉬운 방법을 제공한다. 실험실에서이 프로토콜의 드 노보 개시는 간단하고, 출발 물질 및 장비는 비교적 저렴하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
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- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
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