Abstract
Influensainfeksjon er assosiert med ca 36.000 dødsfall og mer enn 200.000 sykehusinnleggelser hvert år i USA. Den kontinuerlige fremvekst av nye influensavirusstammer på grunn av mutasjon og re-sortiment kompliserer styringen av viruset, og nødvendiggjør permanent utvikling av nye medikamenter og vaksiner. Laboratoriet basert undersøkelse av influensa krever en pålitelig og kostnadseffektiv metode for formering av viruset. Her er en omfattende protokoll gitt for influensa A virus forplantning i frukt kylling egg, som konsekvent gir høy titer virus aksjer. I korte trekk, blir serum patogenfrie (SPF) befruktede kyllingegg inkubert ved 37 ° C og 55-60% fuktighet i 10 - 11 dager. Over denne perioden, kan embryo utvikling enkelt overvåkes ved hjelp av et egg Candler. Virus inokulering utføres ved injeksjon av viruslager inn i det allantoiske hulrom ved hjelp av en nål. Etter 2 dagers inkubasjon ved 37 ° C, egg erkjølt i minst 4 timer ved 4 ° C. Eggeskallet over luftsekken og chorioallantoic membranen blir deretter forsiktig åpnet, og den allantoiske væske som inneholder virus blir høstet. Væsken blir fjernet fra rester ved sentrifugering, delt i porsjoner, og overført til -80 ° C for lagring over lang tid. Den store mengder (5-10 ml av virusholdige væske per egg) og høyt virustiter som vanligvis oppnås med denne protokoll har gjort bruk av egg for virus-preparat vår gunstig metode, særlig for in vitro studier som krever store mengder av virus hvori høye doser av det samme viruset lager er nødvendig.
Introduction
Influensa A fortsetter å være en stor trussel mot menneskers helse. Det er en potensielt ødeleggende luftveissykdom med en stor global byrde forårsaker opp til 500.000 dødsfall på verdensbasis årlig en. Influensavirus er i familien Orthomyxoviridae og bære 8 negativ-sense enkelt-trådet RNA i deres genom 1,2. Den høye mutability (dvs. antigent "drift") av det virale genom forhindrer langvarig immunitet. Videre er influensa stadig motstandsdyktig mot antivirale legemidler tre.
2009 H1N1 influensa pandemi markert alle utfordrende problemstillinger knyttet til influensasykdom (pandemiske stammen, anti-virusresistens, forsinket vaksineproduksjon). Vaksinen formulering fastsettes årlig av Verdens helseorganisasjon for de mest sannsynlig patogene influensastammer (en hver for H1N1, H3N2 og influensa B) 4. Fordi denne metoden er basert på spådd influensaviruss, er patogene stammer tidvis feilaktig identifisert og vaksineeffekt synker dramatisk. Dessuten kan opptreden av nye influensastammer omgå disse forebyggende programmer som forårsaker sykdom epidemien 2.
Opprettelsen av en universell influensavaksine har vært unnvikende 5. Derfor må forskning fortsetter inn forstå patogenesen av lungeskade. Til anlegget laboratorieforskning, har flere metoder er utviklet for viral isolasjon og forplantning 6. Influ- ensavirus kan forsterkes i en rekke forskjellige pattedyrcelle substrater. Imidlertid genererer høy titer virus i store mengder best oppnås i embryonerte egg. Følgende protokoll beskriver en teknikk for influensa A-virus forplantning og lagring fra eksisterende virus aksjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Grunnregler: Utfør alle prosedyrer som involverer manipulasjon av egget under sterile forhold, og steril teknikk bør brukes deretter. Pre-clean alt utstyr med 70% etanol før bruk. Generelt bør influensavirus inokulering og innhøsting utføres i et BSL-2 laboratorium. Men hvis dette protokollen brukes til å forplante mye mer patogene influensavirus (f.eks pandemi og pre-pandemi stammer, stammer som utgjør en fare for fjærfe og buskap, høypatogen aviær influensa stammer, 1918 H1N1 stamme), høyere biologisk nivåer og i noen tilfeller er biosikkerhetsregler og fullmakter som kreves. Den lokale Institutional biosikkerhet komiteen bør godkjenne all forskning som involverer influensavirus.
1. Utarbeidelse av egg for Inoculation
- Skaff serum patogenfrie (SPF) fersk befruktet avian egg fra en passende leverandør. Vanligvis blir kylling egg anvendes. Egg bør være ossed umiddelbart etter ankomst.
- Ved ankomst sted egg i en fuktet egg inkubator med en automatisk egg turner å rotere egg regelmessig. Hvis en automatisk egg turner ikke er tilgjengelig, manuelt rotere egg minst 2-3 ganger om dagen (sørg for å bruke hansker og holde alt så sterilt som mulig).
- Inkuber egg ved 37 ° C og 55-60% fuktighet i 10 til 11 dager.
2. Egg Candling
- Bruke et egg Candler å undersøke egg mot et sterkt lys i et mørkt rom for å sjekke egg til infertilitet ved candling etter ca 7 eller 8 dagers inkubasjon.
- Tørk av egg Candler med 70% etanol. Bytt hansker ofte og desinfiser med 70% etanol for å minimere risikoen for forurensning av patogener.
- Fjerne eggene fra inkubatoren og plassere dem i tomme eggekartonger.
- Slå av lyset i rommet.
- Hold den store ende av hvert egg en av gangen mot Candler.
- Observere egg til determine hvis det er fruktbar eller ufruktbar.
MERK: Tynne blodårene som fører til en bønneformet embryo skal være godt synlig. Ubefruktede egg vil vises som en liten blod flekk med en synlig eggeplomme.
- Kast egg som er ubefruktet, og returnere de levedyktige egg til inkubatoren. Ikke la egg utenfor inkubatoren i mer enn 30 min. Hvis statusen for et egg ikke kan bekreftes, merk det, og observere det senere.
3. Utarbeidelse av virusinokulum
- Fortynn influensavirus lager til ca. mars 10 til april 10 pfu / ml i steril PBS inneholdende 10 mM HEPES (pH 7,4). Kritisk trinn: Fortynn viruset lager umiddelbart før bruk og holde den fortynnede virus på is hele tiden.
4. Influensa Virus Inoculation via allantoiske Route
- På dagen for virus vaksinasjon (dag 10 eller 11), stearinlys eggene igjen og eliminere eventuelle døde embryoer. Skille levende embryoer avleter etter bevegelse inne i egget.
- Fjern tre egg fra inkubatoren, og ordne eggene i en egen holder med luftsekken opp.
- Markere luftrommet av eggene med en permanent markør.
- Vask eggeskallet over luftrommet med 70% etanol.
- Sett eggene med luftrommet opp i et egg kartong og inn i en biosikkerhet hette (BSL-2).
- Bruke en steril 18G nål for å lage hull i et lite hull i skallet over luftsekken fra hvert egg. Vær forsiktig med å sette nålen for dypt for å unngå knivstikking embryo eller eggeplomme.
- Tegn opp den fortynnede influensavirus i en steril en ml sprøyte og sett på en 22G nål.
- Avansere nøye sprøyten med nålen i 45 ° vinkel inn allantoinrommet.
- Injisere 0,2 ml av den fortynnede influensavirus.
- Gjenta injeksjon med de to andre eggene, og deretter kast sprøyten og nålen.
- Forsegle hullet med en dråpe lim fra limpistol (eller smeltet parafinvoks). Be forsiktig at limet ikke lekker inne i egget.
- Plassere eggene tilbake i egg inkubator med luftrommet pekte oppover.
- Gjenta trinn 04.02 til 04.12 før alle eggene er blitt vaksinert.
5. inkubasjonstid
- Inkuber infiserte egg uten å slå ved 37 ° C og ~ 60% fuktighet.
- Velge optimal inkubasjonstid avhengig av influensavirus type. Inkuber influensa A i 48 timer; inkuber influensa B og C i 72 timer.
6. Influensa Virus Harvest-
- Etter inkubasjonsperioden, chill eggene ved 4 ° C i minst 4 timer (eller O / N) for å drepe embryoet og innsnevre blodkar for å redusere risikoen for kontaminering av allantoinvæske infisert med blod. Gjøre dette for å hindre at de røde blodcellene fra absorbere viruset, noe som reduserer utbyttet. Alternativt kjøle- egg i 30 minutter ved -20 ° C; men dette øker risikoen for blodsmitte.
- Etter at eggene har blitt tilstrekkelig avkjølt, overføre eggene til en biosikkerhet hette. Plasser egg inn i en fast holder med luftsekken vendt opp. Rengjør egg overflaten med 70% etanol.
- Bruk steril saks for å åpne eggeskallet over luftsekken. Fjern skallet rundt luftsekken samtidig være forsiktig for ikke å ødelegge den chorioallantoic membran.
- Åpne chorioallantoic membran med sterile sløv tang. Forsiktig flytte til side embryoet og plommesekken med en liten slikkepott eller en skje. Pass på å ikke sprekke plommen.
- Ved hjelp av en 1 ml Eppendorf pipette, samle allantoinvæsken nøye. Hvis det er nødvendig, vipp egg litt til siden for å samle så mye væske som mulig.
- Kombiner allantoinvæsken fra alle eggene inn i et 50 ml konisk rør av plast. Hold rør på isen hele tiden under virus innhøsting. Ett egg gir 5 - 10 ml av en svakt gulaktig væske.
- Spinn-virus-holdige allantoinvæske ved 1000 xg i 10 min ved 46; C til pellet rusk. Overfør den klare fluid inn i et nytt 50 ml rør holdt på is. Kast eggene i en BSL-2 avfallsbeholder.
7. Lagring
- Umiddelbart delmengde det avklart allantoinvæsken (f.eks, 50, 100 eller 500 ul prøver) og hurtigfrys i flytende nitrogen. Overføre frosne virus aksjer til -80 ° C fryser for langtidslagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flere metoder har blitt utviklet for å titrere influensavirus. En betraktning når du velger en passende metode er at noen bestemme de totale partikler uavhengig av levedyktighet (f.eks, hemagglutinin-analyse), mens andre er basert på smittsomhet, som vil vurdere levedyktige viruspartikler (f.eks plakkassay) 6. Her ble den virale titer av allantoinvæske oppsamlet fra kylling egg inokulert med et musetilpasset influensavirus (A / PR / 8/34) bestemt ved plakk-analyse (figur 1) og hemagglutinasjon analysen (figur 2).
Influensavirusinfeksjon forårsaker en cytopatisk effekt som resulterer i plaque (sirkulære soner av lyserte celler) for dannelse av et monolag av celler. Plaques ble visualisert ved farging av cellene med krystallfiolett, og 65 plaques ble telt i brønnen med 10 -12 fortynning av virus (figur 1). Fordi 500 liter fortynnet viral lager wsom er lagt på cellene, er det endelige titeret 1,3 x 10 14 PFU / ml.
Den hemagglutinasjon-analysen er en fremgangsmåte for å titrere influensavirus baser på evnen av viruset til å feste seg til overflaten av røde blodceller. En viral suspensjon vil agglutinere røde blodceller, og dermed hindre dem fra å felles ut av suspensjonen. Ved å bruke serielle fortynninger av virus i en 96-brønns plate (enten V- eller rund bunn) og tilsetning av en fast mengde av røde blodceller, kan det virustiter bestemmes. En tydelig negativt resultat ble observert med 1: 2 10 fortynning av virus i 50 ul (figur 2). Derfor er det endelige titeret 2,1 x 10 4 HAU / ml.
Figur 1. Kvantifisering av pr8 Virus Titer av plakk analysen. En monolayer av MDCK celler ble infisert med 10-fold serial fortynninger av PR8 (10 -1 til 10 -12) i en time, vasket og deretter belagt med en 0,6% agarose-løsning. Etter inkubering ved 37 ° C i 72 timer, ble agar forsiktig fjernet, og cellene ble fiksert og farget med 0,25% krystallfiolett. Plakkdannelse ble sammenlignet med en frisk kontroll (CTR). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Hemagglutineringen (HA) Assay for Titer Egg-avledet PR8 influensavirus. PR8 virus ble seriefortynnet to ganger i PBS og blandet med 50 ul av 0,5% kalkun røde blodceller. Fortynninger ble utarbeidet i quadruplicates, og bildene ble tatt etter en time inkubasjon ved RT. Negative resultater vises som prikker i sentrum av brønnene, mens positive resultaterdanne en enhetlig rødlig farge over brønnen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Influensa forårsaker en stor global sykdomsbyrde, og arbeidet fortsetter inn forstå patogenesen av lungeskade 7. Til rette for forskning i denne dødelige sykdommen har ulike metoder blitt utviklet for å forplante influensavirus 6. Her beskriver vi en teknikk for å frem influensavirus i kylling egg. Fordelen med denne metoden er at den er meget reproduserbar og resulterer i store mengder av høy titer influensavirus aksjer, som ofte er nødvendig for in vitro studier.
De fleste laboratorier vil være i stand til å utvikle denne protokollen raskt og enkelt med minimale oppstartskostnader. Selv om vi anbefaler å investere i et egg inkubator med automatisk turner, kan denne protokollen kan gjennomføres uten slikt utstyr, men vil være mer arbeidskrevende. Vi anbefaler også å bruke kommersielle forskningsmiljøer leverandører for kjøp av befruktede egg for å garantere konsistens og sterilitet av eggene. Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) tolkning av Public Health Service (PHS) Policy på Humane Stell og bruk av forsøksdyr sier til forskningsbruk av levende embryonene avian egg at PHS politikk er kun aktuelt etter klekking. Derfor vil de fleste institusjonene ikke kreve IACUC godkjenning for denne protokollen. Men praksisen varierer mellom institusjoner, og Institutional biosikkerhet Committee godkjenning vil være nødvendig før oppstart av denne protokollen.
Når du arbeider med viruset, er det viktig å holde viruset ved 4 C etter høsting allantoinvæsken fra infisert embryon egg. Hver egg er forventet å produsere mellom 5-10 ml allantoinvæske, og titer er avhengig av type influensavirus. Vår lab har rutinemessig brukt denne metoden til å forplante en mus-tilpasset H1N1-viruset (A / PR / 8/34). Denne protokollen kan også brukes for kliniske prøver, men i denne situasjon, kan inokulering av amnionhulen være å foretrekke på grunn av presence av 2,6-koblede sialinsyrer nødvendig for binding innen foster fôr 8,9. En annen vurdering er at denne metoden ikke kan være ideell for forplantning fugleinfluensavirus (f.eks H5N1 stammer) på grunn av patogenitet til embryoet.
Forskjellige fremgangsmåter for Titering influensavirus har blitt utviklet som alle har sine fordeler og ulemper. Faktisk kan viral kvantifisering være proteinbasert (f.eks hemagglutinin assay, ELISA), nukleinsyre-basert (f.eks kvantitativ PCR), eller funksjonelt (f.eks viral plakk-analyse) 6. Ikke-funksjonelle analyser vil avgjøre totale virustiter uavhengig av om de er levende eller døde viruspartikler. Derfor vil teste for smittsomme aktivitet av influensavirus måle levende virus og gir mulighet for sammenlign funksjonell ekvivalens fra parti til parti. Plakett dannende analysen er en vanlig brukt metode som kan vurdere titre av levende influensa viross, men kan være treg og tungvint å utføre 10. Til sammenligning er den hemagglutinin analysen enkel og grei, men vurderer ikke levedyktighet og avgjør alle influensa partikler.
Heri gir vi en relativt enkel metode for å forplante høytiter influensavirus. De novo initiering av denne protokollen i et laboratorium er grei, og utgangsmaterialer og utstyr er relativt billig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
