Abstract
Grip enfeksiyonu yaklaşık 36.000 ölüm ve Amerika Birleşik Devletleri'nde 200.000 'den fazla hastaneye yatış her yıl ile ilişkilidir. Mutasyon ve yeniden çeşitler nedeniyle yeni influenza virüs türlerinin sürekli ortaya çıkması virüsün kontrol komplike ve yeni ilaçların ve aşıların kalıcı geliştirilmesini gerekli kılmaktadır. Grip laboratuar tabanlı çalışma virüsün yayılması için güvenilir ve maliyet-etkin bir yöntem gerektirir. Burada, bir kapsamlı protokol sürekli olarak yüksek titre virüs stokları elde edilir verimli tavuk yumurta influenza A virüs yayılması için sağlanır. 11 gün - Kısaca, serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° C ve 10% 55-60 nemde bekletilir. Bu süre içinde, embriyo gelişimi kolaylıkla bir yumurta Candler kullanılarak izlenebilir. Virüs aşı, bir iğne ile allantoik oyuğuna virüs stokunun püskürtülmesiyle gerçekleştirilir. 37 ° C'de inkübasyon 2 gün sonra yumurta4 ° C'de en az 4 saat süre ile donduruldu. Hava kesesi ve chorioallantoic membran üzerinde yumurta kabuğu sonra dikkatlice açılır, ve virüs içeren allantoik sıvı hasat edilir. sıvı, santrifüj ile etrafı temizlenmiş alikotlandı ve uzun süreli depolama için -80 ° C'ye kadar aktarılır. büyük miktarda, genellikle, bu protokol ile elde edilir ve yüksek virüs titresi (bir virüs içeren yumurta başına sıvının 5-10 mi) büyük miktarlarda ihtiyaç in vitro çalışmalar için, özellikle, virüs preparatı eden uygun bir yöntem için yumurta kullanımını yapmıştır virüs içinde, aynı virüs stokunun yüksek dozlar gereklidir.
Introduction
Grip A insan sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam ediyor. Büyük bir küresel yük dünya çapında yılda 1 500.000 ölüme kadar neden olan bir yıkıcı solunum hastalığıdır. Grip virüsleri ailesi Orthomyxoviridae olup genomları 1,2, 8 negatif sens, tek iplikçikli RNA taşır. Viral genomun yüksek değişebilirlik (yani, antijenik "sürüklenme") uzun vadeli bağışıklık engeller. Ayrıca, grip, anti-viral ilaçlar 3 giderek dayanıklıdır.
2009 H1N1 pandemik influenza hastalığının (pandemik suşu anti-viral direnç, gecikmiş aşı üretimi) ile ilgili tüm zorlu konuları vurgulanır. Aşı formülasyonu büyük olasılıkla patojenik influenza suşları 4 (H1N1, H3N2 ve İnfluenza B için birer adet) için Dünya Sağlık Örgütü tarafından her yıl belirlenir. Bu yöntem tahmin grip suşu dayandığındans, patojen suşları bazen yanlış tespit ve aşı etkinliği önemli ölçüde düşer vardır. Ayrıca, yeni grip suşları görünümü pandemik hastalık 2 neden bu koruyucu programları aşmak olabilir.
evrensel grip aşısının oluşturulması 5 zor olmuştur. Bu nedenle, araştırma akciğer hasarının patogenezinde anlamak içine devam etmelidir. Tesis laboratuar araştırmaları için, çeşitli yöntemler viral izolasyon ve yayılma 6 geliştirilmiştir. İnsan grip virüsleri, memeli hücre çeşitli substratlar olarak amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, büyük miktarlarda üretilmesi yüksek titre virüsleri iyi embriyo haline gelmiş yumurtalardan elde edilmektedir. Aşağıdaki protokol grip için mevcut virüs stoklarından bir virüs yayılımını ve depolama tekniğini açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Genel sözleri: NOT steril koşullar altında yumurta manipülasyonu ile ilgili tüm prosedürleri uygulayın ve steril tekniği buna göre kullanılmalıdır. % 70 etanol ile tüm ekipman kullanmadan önce ön-temiz. Genel olarak, influenza virüsü aşılama ve hasat BSL-2 laboratuvarda yapılmalıdır. Ancak, bu protokol yaymak için kullanıldığında çok daha patojenik grip virüsleri (örneğin, salgın ve pandemi öncesi suşları, kümes hayvanları ve hayvancılık, yüksek patojen kuş gribi suşları, 1918 H1N1 suşu için bir tehlike teşkil suşları), yüksek biyogüvenlik düzeyleri ve Bazı durumlarda, biyogüvenlik önlemleri ve izinler gereklidir. Yerel Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi grip virüsü ile ilgili tüm araştırmaları onaylaması gerekir.
Aşılama için Yumurta 1. Hazırlık
- Uygun bir satıcıdan serum patojen içermeyen (SPF) taze döllenmiş yumurta kuş edinin. Tipik haliyle, tavuk yumurtası kullanılır. Yumurta bizi olmalıhemen girişte ed.
- Otomatik yumurta turner ile nemlendirilmiş yumurta inkübatör varış yeri yumurta düzenli yumurta döndürmek için üzerine. Otomatik yumurta turner mevcut değilse, elle en az 2-3 kez bir gün (eldiven giymek ve mümkün olduğunca steril olarak her şeyi tutmak için emin olun) yumurta döndürün.
- 37 ° C ve 10-11 gün boyunca% 55-60 nemde kuluçkaya.
2. Yumurta Mum
- Inkübasyon yaklaşık 7 veya 8 gün sonra candling ile infertilite yumurta kontrol etmek için karanlık bir odada bir parlak ışığa karşı yumurta incelemek için bir yumurta Candler kullanın.
- % 70 etanol ile yumurta Candler silin. Genellikle eldiven değiştirme ve patojenlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için% 70 etanol ile dezenfekte edin.
- Inkübatör yumurta çıkarın ve boş yumurta kartonları koyun.
- Odada ışıkları kapatın.
- Candler karşı bir defada her yumurta bir büyük ucunu tutun.
- Determin için yumurta uyunE o bereketli ya infertil olup olmadığını.
NOT: Bir fasulye şeklinde embriyo giden İnce kan damarları açıkça görünür olmalıdır. Döllenmemiş yumurta görünür yumurta sarısı ile küçük bir kan nokta olarak görünecektir.
- Döllenmemiş yumurta olan atın ve inkübatör canlı yumurta dönün. Fazla 30 dakika inkübatör dışında yumurta bırakmayın. Bir yumurtanın durumu teyit edilememesi halinde, bunu işaretleyin ve daha sonra gözlemlemek.
Virüs İnokulum 3. hazırlanması
- 10 mM HEPES (pH 7.4) ihtiva eden steril PBS içinde 10 4 pfu / ml - yaklaşık 10 ila 3 grip virüsü stokunu. Kritik adım: kullanımdan hemen önce virüs stokunu ve buz üzerinde her zaman seyreltilmiş virüs tutmak.
Alantoik Rota aracılığıyla 4. Grip Virüsü Aşılama
- Virüs inokülasyonundan (gün 10 ve 11) gün, daha yumurta mum ve herhangi bir ölü embriyolar ortadan kaldırır. Canlı embriyoların ayırtyumurta içinde hareket arıyor.
- Inkübatör üç yumurta çıkarın ve hava kesesi kadar ayrı bir tutucu yumurta düzenlemek.
- Kalıcı bir kalem ile yumurta hava sahasını işaretleyin.
- % 70 etanol ile hava alanı üzerinde eggshell yıkayın.
- Bir yumurta karton ve bir biyogüvenlik kaput (BSL-2) içine hava boşluğu yukarı yumurta koyun.
- Her bir yumurta hava torbasının hemen üzerinde bir kabuk içinde küçük bir delik açmak için bir steril 18G iğne kullanın. Embriyo veya sarısı bıçaklama önlemek için çok derinden iğne eklemek için dikkatli olun.
- Steril 1 ml şırınganın içine seyreltilmiş grip virüsü çizin ve bir 22G iğne takın.
- Dikkatle allantoik boşluğuna 45 ° açıyla iğne ile şırınga ilerlemek.
- Seyreltilmiş grip virüsünün 0.2 ml enjekte edilir.
- Diğer iki yumurta enjeksiyon tekrarlayın ve sonra şırınga ve iğne atın.
- Bir tutkal tabancası (ya da erimiş parafin mumu) den tutkal bir damla ile delik mühür. Be tutkal yumurta içinde sızıntı olmadığını dikkatli.
- Hava alanı yukarı çekti yumurta kuvöz içine yumurta geri yerleştirin.
- Tekrarlayın 4.2 adımları - 4.12 tüm yumurtaları aşılanmış kadar.
5. İnkübasyon Süresi
- 37 ° C'de ve •% 60 nemde açmadan enfekte yumurta inkübe edin.
- Grip virüsü tipine bağlı olarak optimum inkübasyon süresi seçin. 48 saat boyunca influenza A inkübe; 72 saat grip B ve C kuluçkaya yatmaktadır.
6. Grip Virüsü Hasat
- İnkübasyon süresinden sonra, embriyo öldürmek ve kan ile enfekte alantoik akışkan kontrol etme riskini azaltmak için kan damarları, 4 saat (ya da O / N), en az 4 ° C 'de yumurta soğutun. Verimi azaltır virüs, emici kırmızı kan hücrelerini engellemek için bunu yapın. Seçenek olarak ise, soğuk yumurta, 30 dakika boyunca -20 ° C 'de; Bununla birlikte, bu, kan kirlenme riskini arttırır.
- Yumurta yeterince soğutulmuş olmuştur sonra, bir biyogüvenlik kaput yumurta transferi. Hava kesesi yukarı bakacak şekilde bir firma tutucu içine yumurta yerleştirin. % 70 etanol ile yumurta yüzeyini temizleyin.
- Hava kesesi üzerindeki kabuğu açmak için steril makas kullanın. Koryoalantoik zar yok etmek değil dikkat ederek hava kesesi etrafında kabuk çıkarın.
- Steril künt forseps ile koryoalantoik zar açın. Yavaşça embriyo ve küçük bir spatula ya da kaşık ile yumurta sarısı kesesi kenara taşıyın. Sarısını yırtılmasına dikkat edin.
- 1 ml'lik bir Eppendorf pipet yardımıyla, allantoik akışkanın toplanması. Gerekirse, yan biraz kadar sıvı mümkün olduğunca toplamak için yumurta eğin.
- 50 ml'lik plastik konik tüp içine bütün yumurta, allantoik akışkanın birleştirin. Virüs hasat sırasında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. Bir yumurta verimi 5 - hafif sarımsı bir sıvı 10 mi.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de virüs içeren alantoik akışkan Spin6, C yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni 50 ml tüp içine net sıvıyı aktarın buz tuttu. Bir BSL-2 atık kabına yumurta bertaraf edin.
7. Depolama
- Hemen allantoik açıklık sıvının (örneğin, 50, 100 veya 500 ul tümbölenler) bölmeyin ve ek-freeze sıvı azot içinde. Dondurulmuş virüs stokları, uzun süreli depolama için -80 ° C dondurucu transfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çeşitli yöntemlerle grip virüsü titre edilmesi için geliştirilmiştir. Uygun bir yöntem seçerek Bir göz bazı canlı viryonlarını değerlendirecek olan, ne olursa olsun başkalarının enfekte dayalı ise canlılığı (örneğin, hemaglutinin deneyi) toplam parçacıkları tespit olduğunu (örneğin, plak deneyi) 6. Burada, bir fare adapte influenza virüsü (A / PR / 8/34) ile aşılanır tavuk yumurtalarından elde alantoik akışkan viral titresi plak deneyi (Şekil 1) ve hemaglüsinasyon tahlilinde (Şekil 2) ile tespit edilmiştir.
Grip virüsü enfeksiyonu hücrelerin bir mono-tabakası üzerinde meydana getirmek üzere plaklar neden sitopatik etkiler (tabii tutulan parçalanmış hücrelerin dairesel bölgeleri) neden olur. Plaklar kristal mor ile boyanması ile görselleştirilmiştir ve 65 plaklar virüsün 10 -12 seyreltme (Şekil 1) ile birlikte oyuk içinde sayılmıştır. Seyreltilmiş viral stokunun 500 L w Çünkühücreleri üzerine yerleştirilmiş olarak, son titre 1.3 x 10 ila 14 PFU / ml 'dir.
hemaglütinasyon testi kırmızı kan hücrelerinin yüzeyine bağlamak için virüsün yeteneği ile ilgili influenza virüsü bazları titre edilmesi için bir yöntemdir. Bir viral süspansiyon böylece süspansiyon yerleşmesini engelleyen, kırmızı kan hücreleri aglütine olacaktır. 96 çukurlu bir plaka (V ya da yuvarlak tabanlı) virüsün seri seyreltileri kullanılarak ve kırmızı kan hücrelerinin belirli bir miktar eklenerek, viral titrasyon belirlenebilir. 50 ul (Şekil 2) virüsün 2 10 seyreltme: Bir açık bir şekilde negatif sonuç 1 ile gözlenmiştir. Bu nedenle, son titre 2,1 x 10 4 HAU / ml'dir.
Şekil 1. Niceleme plak tahlili ile PR8 Virüs titresi. MDCK hücreleri bir tek tabakalı 10-kat seria bulaşmış olanPR8 l seyreltmeleri (10 -1 - 10 -12), 1 saat boyunca karıştırılmış, yıkanmış ve daha sonra% 0.6 agaroz çözeltisi ile kaplanmıştır. 72 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edildikten sonra, ağar dikkatlice uzaklaştırılmış ve hücreler, sabit ve% 0.25 kristal mor ile boyandı. Plak oluşumu bulaşmamış kontrol (ctr) karşılaştırmak edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Titre Yumurta türevli PR8 grip virüs Şekil 2. Hemaglutinasyon (HA) Deneyi. PR8 virüsünün seri PBS içinde 2 kat seyreltildi ve% 0.5 hindi, kırmızı kan hücreleri 50 ul ile karıştırıldı. Seyreltmeler, dörtlü hazırlandı ve resimleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildikten sonra alınmıştır. Olumsuz sonuçlar olumlu sonuçlar ise kuyuların merkezi noktalar olarak görünürkuyu boyunca düzgün bir kırmızımsı bir renk oluşturur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Grip hastalığının büyük bir küresel yük olur, ve iş akciğer hasarı 7 patogenezi anlayış içine devam ediyor. Bu ölümcül hastalık kolaylaştırdı araştırma, çeşitli yöntemler grip virüsü 6 yaymak için geliştirilmiştir. Burada, biz tavuk yumurtası influenza virüsü üretmek için bir tekniği açıklar. Bu yöntemin avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve çoğu zaman, in vitro çalışmalar için gerekli olan yüksek titre grip virüsü hisse senetleri, büyük miktarlarda elde edilir.
Çoğu laboratuarlar az başlangıç maliyetleri ile hızlı ve kolayca bu protokolü geliştirmek mümkün olacak. Biz otomatik turner ile bir yumurta inkübatör yatırım tavsiye rağmen, bu protokol böyle bir ekipman olmadan tamamlanmış olabilir, ancak daha zahmetli olacaktır. Biz de yumurta tutarlılığını ve sterilite garanti döllenmiş yumurta alımı için ticari araştırma satıcıları kullanmanızı öneririz. Laborat Ofisiİnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Servisi (PHS) Politikanın ORY Hayvan Refahı (OLAW) yorumlanması PHS politikası Yumurtadan çıktıktan sonra geçerlidir canlı embriyone kuş yumurta araştırma kullanımı için devletler. Bu nedenle, çoğu kurum bu protokol için IACUC onayı gerektirmez. Ancak, politikalar kurumlar arasında değişir ve Kurumsal Biyogüvenlik Kurulu onayı bu protokolü başlamadan önce gerekli olacaktır.
Virüs ile çalışırken, enfekte embriyo yumurta allantoik sıvının hasat sonra 4 ° C'de virüs tutmak için her şeyden önemlidir. Her yumurta allantoik sıvı 5-10 ml arasında üretmesi beklenen ve titre influenza virüsünün suşu bağlıdır. Bizim laboratuvar rutin bir fare adapte H1N1 grip suşu (A / PR / 8/34) yaymak için bu yöntemi kullandı. Bu protokolünün p klinik örnekler için de kullanılabilir, ancak bu durumda, amniyotik boşluğun aşılama tercih edilebilir2,6-bağlantılı sialik asit resence amniyotik astar 8,9 olan bağlanma için gerekli. Başka bir göz bu yöntem nedeniyle embriyo patojenisiteye yayılma Avian influenza virüslerinin (örn, H5N1 suşları) için ideal olmayabilir olmasıdır.
Grip virüsü titering çeşitli yöntemler kendi avantaj ve dezavantajları var olan tüm geliştirilmiştir. Gerçekten de, viral miktar olabilir protein bazlı (örneğin, hemaglutinin testi, ELISA), bir nükleik asit bazlı (örneğin, kantitatif PCR) ya da işlevsel (örneğin, virütik plak deneyi) 6. Fonksiyonel olmayan tahliller olursa olsun yaşayan ya da ölü viral parçacıkların ise toplam viral titreleri belirleyecektir. Bu nedenle, grip virüsünün bulaşıcı aktivitesi için test Canlı virüs ölçülmesi ve bir partiden bir diğerine karşılaştırılabilir işlevsel denklik için izin verir. Plak oluşturan deneyi canlı grip vir titreleri değerlendirmek yaygın olarak kullanılan bir testtirBize, ama yavaş ve 10 gerçekleştirmek için hantal olabilir. Buna karşılık, hemagglutinin deneyi basit ve anlaşılır, ama canlılığını değerlendirmek değil ve tüm influenza partikülleri belirler.
Burada, yüksek titre grip virüsü yaymak için nispeten kolay bir yöntem sağlar. Bir laboratuvarda bu protokolün de novo başlatılması basittir, ve başlangıç maddeleri ve ekipmanları nispeten ucuzdur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | ||
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol>99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
