Protocol
任意の動物手順、制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）の前には、プロトコルを承認する必要があります。このプロトコルは、ミシガン州立大学IACUCによって承認されました。
FITC-イヌリン溶液の1前のラボの準備
- 全てのイヌリンが溶解するまでゆっくりと加温20〜70℃の生理食塩水のミリリットルとは、FITC-イヌリン（5 mg / mlのFITC-イヌリン）を100mgを加えて混ぜます。
- 室温に冷却液と（基本的に、アガロースゲル電気泳動によりフリー、低エンドトキシン、≥98％純度グロブリン、40 mg / mlのBSA、凍結乾燥粉末）、ウシ血清アルブミン800mgのを追加します。
- 濾紙（グレード1）とイヌリンBSA溶液をフィルタリングします。シリンジチップフィルター（0.2μm）で、20 mlシリンジで濾過した溶液を置き、光から保護するためにホイルでカバーしています。
2.麻酔と手術
- 麻酔を誘導するために、5％のイソフルランで満たされた導入室にラットを置きます。レコードBODY重量（250〜350グラム）と、実験を通して37℃の体温を維持するように設計された加熱された外科用プラットフォーム上にラットを置きます。ゆっくり足の上に実験用テープでプラットフォームにラットを固定します。 0.8〜1.0リットル/分の空気流量で医療グレード100％のO 2を1〜2％イソフルランで麻酔を維持します。
- 血圧および心拍数のモニタリング、及び血液サンプリングのために大腿動脈にカテーテルテーパー（血管内先端OD、2.7F）を挿入します。
- イヌリン注入のための大腿静脈にカテーテル（PE-50）を挿入します。 5-O編み絹縫合糸6と周囲の組織にカテーテルを固定します。
- ひずみゲージ圧力変換器に動脈カテーテルを取り付けます。リアルタイムでコンピュータ画面上のデータ取得ソフトウェア、ディスプレイを使用して記録する血圧と心拍数。この技術は、映像6に詳細に示されています。
- 恥骨上切開により膀胱を公開します。小さなをカット膀胱の先端に穴や熱でカニューレ（PE-190）を挿入するには、尿採取のために、膀胱の内側に先端をフレア。巾着縫合で膀胱にカニューレを固定します。
3.尿や血液コレクション
- 1ミリリットル/体重（300グラムの重さのラットについて3ミリリットル/時）の100グラムあたりの時間の流速が設定されたシリンジポンプにFITC-イヌリンの注射器を置きます。大腿静脈カテーテルに注射器を取り付けます。イヌリンの注入を開始し、1〜2時間の平衡期間を可能にします。光から保護するために箔で覆われた注射器を保管してください。
- 尿流量が安定しており、10分の期間、予め秤量した回収バイアル中の尿サンプルを採取することにより、試料分析（20μL/分）のために適切であるかどうかを確認します。デジタルスケールで重量測定により尿量を決定します。 10分の回収期間のための適切な尿量は、0.2 mlです。二つの連続コレクションが20μL/ Mの尿流量を示すまでの尿サンプルを収集し続けますで以上。
- プレドラッグサンプル
- 20分の期間中に尿サンプルを採取します。尿収集期間の中間点において動脈カテーテルから血液サンプル（0.5ml）に収集します。 1 Uのヘパリンを含むコレクションバイアルに血液サンプルを収集する前に生理食塩水を完全に透明に動脈カテーテルに注意してください。動脈血の0.5ミリリットルの収集を容易にするために、ボリュームマーキングコレクションバイアルを使用します。
- 血液（約0.1ミリリットル）のカテーテルをクリアするためにヘパリン生理食塩水（20 U / ml）で動脈カテーテルをフラッシュします。動脈カテーテルの長さは、洗い流すために必要なヘパリン - 生理食塩水の量を制限することが可能な限り短くすべきです。
注：希釈された血液サンプルはGFRおよびNaとKの分数排泄の不正確な計算を生成します - 10分待ってから、第2のプリ薬物の尿と血液サンプルの収集を繰り返します。
- 2つの事前薬物サンプルの収集に続いて、利尿DRUの管理G、フロセミド（10mg / kgの）、動脈カテーテルを介し。薬物のカテーテルをクリアするためにヘパリン化生理食塩水で動脈カテーテルをフラッシュします。動脈カテーテルを介して空気を注入しないように注意してください。フロセミド注射の時間を記録します。
- 尿収集期間の中間点で下3時間点の各々で、10分間の収集期間中に尿サンプルを採取し、血液試料（0.5mL）を：ポスト薬剤サンプル。
- 後薬物サンプル1について - フロセミド後5分を収集します。
- 後薬物のサンプル2について - フロセミド後10分を集めます。
- 後薬物サンプル3について - フロセミド後に15分を集めます。
- 全てのサンプルが収集された後、開胸し、心臓を除去することによって機関の手順に従ってラット安楽死させます。両方の腎臓を削除します。逆カプセル化（周囲の膜を除去）し、過剰の血液を除去するために腎臓をブロット。腎臓を計量。
- デジタルスケールで重量測定により、すべての尿サンプル量を測定し、記録の重み。
- テーブルトップ遠心機（1,800 XG）で遠心分離し、全血サンプルは、血漿を分離しました。小さなラベル付きバイアルに血漿サンプルを転送します。
- ナトリウム/カリウムアナライザーで尿および血漿試料中のNa、Kの濃度を分析します。
- 血漿および尿中のFITC-イヌリンの測定
- HEPES緩衝液（500mMの、pH7.4）で、ポスト薬物尿（1:10）（400：1：200〜1）から予め薬物尿を希釈します。
- 96ウェルプレート（ウェルごとに1つのサンプル）にHEPES緩衝液の標準またはサンプルを60μlの40μlを添加して、アルミホイルで覆いながら10分間混合することができます。
- の濃度についてのFITC-イヌリンの標準曲線を生成6.25、12.5、25、50、100、200、400 / mlの（ 図1）。元にマイクロプレートリーダーを使用してサンプルと標準でFITC-イヌリン蛍光を決定それぞれ485および538 nmでの引用及び発光波長。
- 4-PARAMTERロジスティック関数の回帰分析に標準の蛍光値を取り付けます。回帰関数のパラメータは、血漿および尿サンプル（ 表1）にFITC-イヌリン濃度を計算するために使用されます。
結果5.ポストラボ分析：計算
- 【尿量収集（ミリリットル）]÷[収集の時間（分）]：;尿流量（ml /分UV）を計算します
- 糸球体濾過率を計算（GFR、ml /分）：尿イヌリン濃度（/ mlの）UV（ml /分）をX]÷[血漿イヌリン濃濃度（μg/ ml）を]
- 計算フィルタリングさナトリウム負荷（μモル/分）：血漿ナトリウム濃度（モル/ ml）をGFR（ml /分）をxは
- 尿中ナトリウム濃度（モル/ ml）をUV（ml /分）をX：;ナトリウム排泄率（μモル/分U のNa V）を計算します
- ナトリウム排泄分画（;％FE NA）を計算します：[U のNa V（マイクロモル/分）]÷[濾過ナトリウム負荷（マイクロモル/分）]×100
- 計算フィルタリングさカリウム負荷（μモル/分）：血漿カリウム濃度（モル/ ml）をGFR（ml /分）をxは
- 尿中カリウム濃度（モル/ ml）をUV（ml /分）をX：;カリウム排泄率（μモル/分U K V）を計算します
- 計算カリウムの分別排泄（FE K;％）：[U K V（マイクロモル/分）]÷[濾過カリウムロード（マイクロモル/分）]×100
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Representative Results
ラボのデモに使用される利尿剤は非常に迅速に薬物投与の数分以内に増加したのNa、K、その結果、腎臓、および水の排泄によってフィルタリングNaおよびKの再吸収を阻害するフロセミドました。その主要なメカニズムによって、フロセミドは、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷の最小の効果を持っている必要がありますが、尿の流れを増加し、NaおよびKの分数排泄
麻酔したラットにおいて、GFRのための薬物前値の平均は3.2ミリリットル/分であったことを表3に示す代表結果、ナトリウム排泄/分0.58マイクロモル（ろ過負荷の0.1％）であり、Kの排泄は4.4でしたマイクロモル/分（ろ過負荷の27％）。フロセミド（薬物後1）、GFRおよびNa、Kのフィルタ処理負荷5分後には、影響を受けませんでした。しかし、ナトリウム排泄分画は11.5％に増加し、K排泄分画は、それぞれのフィルタ処理の負荷の63％に増加しました。 MAの測定PとHRは、フロセミドは、MAPとHR（ 表2）に最小限の影響を及ぼしたことを示しています。
実験室でのデモで評価腎機能の指標は、プラズマが、腎臓によってフィルタリングされる割合として定義GFR、ありました。ろ過NaおよびK、NaおよびKは腎臓によってフィルタリングされる割合として定義され; NaおよびKは腎臓から排泄される割合として定義NaおよびK排泄率;および腎臓から排泄されるろ過NaおよびKの割合として定義NaおよびK排泄分画、
図1：イヌリン標準曲線 FITC蛍光値は6.25、12.5、25、50、100、200および400 / mlのイヌリンを含有する標準のために示されています。 4-PARAMTERロジスティック関数の回帰分析では、ベストフィットカーブを生成します。この曲線からの回帰関数のパラメータは、FIを算出するために使用されました血漿および尿サンプル中のTC-イヌリン濃度。
| FITC-イヌリン蛍光 | 濃度 | 結果 | ||||
| スタンダード | 1を複製します | 2を複製 | 平均 | / mlの | 希釈 | / mlの |
| ブランク | 63.9 | 64.8 | 64.4 | 0.4 | 1 | 0.4 |
| 6.25 | 253.2 | 264.1 | 258.7 | 5.9 | 1 | 5.9 |
| 12.5 | 474.0 </ TD> | 491.3 | 482.7 | 12.5 | 1 | 12.5 |
| 25 | 854.8 | 881.3 | 868.1 | 24.4 | 1 | 24.4 |
| 50 | 1617.1 | 1618.0 | 1617.6 | 50.3 | 1 | 50.3 |
| 100 | 2813.1 | 2846.1 | 2829.6 | 101.3 | 1 | 101.3 |
| 200 | 4367.3 | 4588.7 | 4478.0 | 198.2 | 1 | 198.2 |
| 400 | 6258.0 | 6650.0 | 6454.0 | 401.6 | 1 | 401.6 |
| 尿サンプル | ||||||
| プレドラッグ1 | 2443.9 | 2062.3 | 2253.1 | 88.5 | 200 | 17700 |
| プレドラッグ2 | 2266.5 | 1707.0 | 1986.8 | 76.3 | 200 | 15250 |
| ポスト薬1 | HT "> 1208.91391.2 | 1300.1 | 44.7 | 10 | 447 | |
| ポスト薬2 | 2753.4 | 2120.5 | 2437.0 | 97.0 | 10 | 970 |
| ポスト薬3 | 2888.3 | 3178.0 | 3033.2 | 124.4 | 10 | 1244 |
表1：イヌリンアッセイ FITC-イヌリンの蛍光値のサンプル結果は試薬ブランク、7標準、5尿サンプルのために示されています。標準およびサンプルを、二連でアッセイし、必要に応じて希釈しました。各試料の平均蛍光は、イヌリンの濃度を計算しました。これらの尿試料中のイヌリン濃度は、測定値の表 （ 表2）に含まれています。
表2：腎機能ラボデモンストレーション中に記録された測定値 、腎機能ラボのデモンストレーションの5の期間（2プリ薬物と3ポスト薬）中に記録された変数が正しいと左腎臓重量、平均動脈圧（MAP）、心拍数（HR）、サンプル時間、尿量、血漿及び尿中ナトリウム（Na）、カリウム（K）、及びイヌリン濃度。尿イヌリン濃度を表1に示すイヌリンアッセイから決定しました。
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表3：プロトコルセクション5に示す式を使用して記録さ測定値から計算腎機能のパラメータ 、記録された変数（ 表2）尿流量、糸球体濾過率（GFR）、GFR / gの腎臓重量、排泄速度を計算するために使用されます2つの事前薬三ポスト薬期間、ろ過負荷、及びナトリウムの分別排出し（Na）、カリウム（K）。
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Discussion
血漿タンパク質に結合していないこと、自由に糸球体で濾過され、吸収されたことも、ネフロンに分泌されることもない：GFR測定のための適切なマーカーは、4つの基準を満たす必要があります。イヌリンはこれらの基準を満たすフルクトースポリマーです。その結果、イヌリンの腎クリアランスはGFR 7を測定するためのゴールドスタンダードと考えられています。実証技術はイヌリン8,9の一定の注入時に時限尿コレクションを使用して、イヌリンの腎クリアランスを決定する従来のアプローチを表しています。従来のイヌリンの測定は、分光光度計10,11によって測定されたイヌリンの定量比色決意を生成するためにアントロン法を用いて作製されています。しかし、尿および血漿の小さい体積でイヌリンの測定を容易にするための試みにおいて、イヌリンは15-17 12-14放射性、蛍光標識でタグ付けされています。このビデオUに提示ラボデモSED FITCが原因人間の放射線被曝の危険性の欠如とFITC蛍光15の測定の容易さの腎機能を測定するためのイヌリンを標識しました。
このラボでのデモは、最小限の実験室でのスキルを持つ学生に腎機能を測定する方法の概念理解を提供することを意図しています。したがって、FITC-イヌリン溶液、及び動物の外科的準備の前ラボ製剤は、デモンストレーションの開始前に経験のある技術者によって行われます。学生は1〜2時間のイヌリンの平衡期間の終了時にデモに到着します。この時点で、学生は事前ラボ概要が提示され、動物に行われている手順を知らさ。二人の学生は、1動物実験に割り当てられ、前と利尿薬の投与後、血液および尿サンプルを採取する方法で指示されています。血液および尿サンプルの分析はエクスペリエンス3によって行われますNCED技術者との結果が腎機能の計算のための学生に配信されます。結果は、デモンストレーションの後にスケジュールすることができるポスト·ラボの議論の際に提示されています。
有効回答を保証するプロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。まず、FITCイヌリンが完全に溶解し、動物の投与前にフィルタリングされなければなりません。理想的には、FITCのイヌリンは、残留未結合のFITCを除去するために、室温で48時間水中で透析されるべきです。第二に、血漿試料は、生理食塩水の自由でなければなりません。学生は、動脈カテーテル内の生理食塩水のすべてが追放された後にのみ、血液サンプルを採取するように指示されており、唯一の血液がカテーテルの外に流れています。生理食塩水で希釈された血液試料は、血漿イヌリン、ナトリウムおよびカリウムのために不正確な値を提供します。第三に、尿の流れは、分析のために十分なサンプルを生成するために安定した適切なものでなければなりません。それの指標であるので、ベースラインでの定常尿流量が重要です安定した実験準備。尿流が低すぎると、イヌリンの注入速度は、前のサンプルのコレクションにすることができます。しかし、イヌリンの注入は、実験の過程で一定でなければならない、 すなわち 、イヌリン注入速度は、実験中に調整されるべきではありません。最後に、マイクロプレートリーダーによる血漿および尿サンプル中のイヌリン蛍光の測定は、成功した実験に重要です。マイクロプレートリーダーの仕様は、試料が希釈を必要とする場合、それはイヌリンアッセイのテストの実行がマイクロプレートリーダーの仕様を最適化し、サンプルの蛍光値であることを確実にするための努力の前にラボのデモに実施することが推奨されるかを決定しますので、標準曲線のミッドレンジ内。
考えられているゴールドスタンダードをイヌリンの腎クリアランスに基づいて、腎機能を評価するが、この技術は、動物を麻酔する必要があるため、制限があり、かつ血管と膀胱カテーテルをインストルメント。 Anesthethetic剤は、腎血行動態およびGFR 18,19に影響を与えることが示されています。しかし、イソフルランとinactinは、典型的には、腎臓19,20に対するその最小の影響による腎機能の実験に使用されています。イヌリンクリアランス技術もマウスなどの小動物に禁止することができイヌリン、複数の血液および血漿サンプルの一定の注入を必要とします。この手法の変形例は、意識のある動物におけるイヌリン21の単回注射の血漿クリアランスの測定を可能にするために開発されてきました。これらの修飾はまた、分析のための血液サンプルの小さい容積を必要とし、マウスにおいて腎機能を評価するための代替方法を提供します。
腎機能の測定は、生理学、病理学、毒物学、薬理学および疾患状態の研究にも適用可能です。腎機能のデモに参加する学生は、Tを学習しますイヌリンの腎クリアランスの彼ゴールドスタンダード技術は、腎機能を評価しました。この技術をマスターすることで、学生は腎機能の原理を理解し、それらを自分の研究に技術を適用し、手法の変更は、それらの研究のために適切であるかどうかを判断することができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。ここに含まれる意見やアサーションは、作者の個人ビューであり、公式として、または陸軍省や国防総省の見解を反映するものとして解釈されるべきではありません。
Acknowledgments
GM077119：ラボのデモンストレーションのための資金源は、NIGMS助成金でした。我々は、統合および臓器システム薬理学におけるショートクーゼの彼らのサポートのために博士ジョセフ·R·ヘイウッドとピーター·コベットに感謝します。また、実験室でのデモの彼女の技術支援のためにさんハンナGarverに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Braided Silk Surgical Suture | Surgical Specialties Corp | SP1033 | |
| Assay Plate, 96-Well | Costar | 3922 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Chemical Co | A2934-25G | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | MicroFuge 18, 357160 | |
| Conical Sample Tubes | Dot Scientific Inc. | #711-FTG | |
| Cotton Tipped Applicators | Solon Manufacturing Co | 56200 | |
| Data Acquisition Software | ADInstruments | LabChart Pro 7.0 | |
| Digital Scale | Denver Instrument | APX-4001 | |
| FITC-Inulin | Sigma Chemical Co | F3272-1G | |
| Gauze Sponges | Covidien | 2146 | |
| Heated Surgical Bed | EZ-Anesthesia | EZ-212 | |
| Heparin | Sagnet | NDC 25021-402-10 | |
| HEPES | Sigma Chemical Co | H3375 | |
| Isoflurane | Abbott Animal Health | IsoFlo, 5260-04-05 | |
| Isoflurane Vaporizer | EZ-Anesthesia | EZ-190F | |
| Micro Dissecting Forceps | Biomedical Research Instruments Inc. | 70-1020 | |
| Microplate Reader - Fluoroskan | ThermoScientific | Ascent FL, 5210460 | |
| NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer | NOVA BioMedical | 14156 | |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PE-190 (for bladder catheter) | BD Medical | 427435 | |
| Pressure Transducer | ADInstruments | MLT1199 | |
| Pyrex Culture Tubes | Corning Inc. | 99445-12 | |
| Rat Femoral Tapered Artery Catheter | Strategic Applications Inc. | RFA-01 | |
| Salix Furosemide 5% | Intervet | #34-478 | |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14075-11 | |
| Student Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Surgical Gloves | Kimberly-Clark | Sterling Nitrile Gloves | |
| Syringe pump | Razel Scientific | R99-E | |
| Tissue Forceps | Fine Science Tools | 91121-12 | |
| Tissue Scissors | George Tiemann Co | 105-420 | |
5-0 Braided Silk Surgical Suture Surgical Specialties Corp SP1033 Assay Plate, 96-Well Costar 3922 Bovine Serum Albumin Sigma Chemical Co A2934-25G Centrifuge Beckman Coulter MicroFuge 18, 357160 Conical Sample Tubes Dot Scientific Inc. #711-FTG Cotton Tipped Applicators Solon Manufacturing Co 56200 Data Acquisition Software ADInstruments LabChart Pro 7.0 Digital Scale Denver Instrument APX-4001 FITC-Inulin Sigma Chemical Co F3272-1G Gauze Sponges Covidien 2146 Heated Surgical Bed EZ-Anesthesia EZ-212 Heparin Sagnet NDC 25021-402-10 HEPES Sigma Chemical Co H3375 Isoflurane Abbott Animal Health IsoFlo, 5260-04-05 Isoflurane Vaporizer EZ-Anesthesia EZ-190F Micro Dissecting Forceps Biomedical Research Instruments Inc. 70-1020 Microplate Reader - Fluoroskan ThermoScientific Ascent FL, 5210460 NOVA 5+ Sodium/Potassium Analyzer NOVA BioMedical 14156 Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors Fine Science Tools 12002-12 PE-190 (for bladder catheter) BD Medical 427435 Pressure Transducer ADInstruments MLT1199 Pyrex Culture Tubes Corning Inc. 99445-12 Rat Femoral Tapered Artery Catheter Strategic Applications Inc. RFA-01 Salix Furosemide 5% Intervet #34-478 Strabismus Scissors Fine Science Tools 14075-11 Student Surgical Scissors Fine Science Tools 91402-12 Surgical Gloves Kimberly-Clark Sterling Nitrile Gloves Syringe pump Razel Scientific R99-E Tissue Forceps Fine Science Tools 91121-12 Tissue Scissors George Tiemann Co 105-420 |
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