Introduction
إدخال تكنولوجيات overexpression عزز إما الدراسات البيوكيميائية لل-نسخة منخفضة الانزيمات عدد والإنتاج الصناعي من البروتينات الصيدلانية الفعالة (مثل الأنسولين). منذ ظهور هذه التقنيات، وقد تم تحقيق تقدم كبير لزيادة الغلة ونوعية البروتينات المؤتلف. وبالإضافة إلى ذلك، تم تطوير بدائية النواة 1،2 و حقيقية النواة 3 أنظمة overexpression على مر السنين، وتقديم بدائل مفيدة ل"حصان العمل" للتكنولوجيا الحيوية من البروتين، أي كولاي. على وجه الخصوص، وتوافر منصات بديلة لE. أدى القولونية إلى إنتاج الببتيدات المؤتلف أو البروتينات التي تحمل التعديلات بعد متعدية. ومع ذلك، فإنه يجب ذكره أن E. القولونية لا يزال يمثل كائن الاختيار لإنتاج البروتين المؤتلف. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، من بينها الأكثر صلة يمكن أن تكونتعتبر: أ) توافر عدد كبير من أنظمة overexpression (ناقلات التعبير وسلالات) لE. القولونية 1،2. ب) مرات الجيل القصير، وغلة الكتلة الحيوية العالية، من E. القولونية في مجموعة متنوعة من الوسائط الغنية والاصطناعية. ج) للتلاعب سطحي إما في الكيمياء الحيوية وعلى المستوى الجيني لهذه الكائنات الحية الدقيقة. د) عزل سلالات قادرة على إنتاج البروتينات السامة 4؛ ت) بناء سلالات تتميز تحريض متجانسة على مستوى السكان 5،6. وبالإضافة إلى ذلك، تبين في الآونة الأخيرة أن الأنظمة التعبير مناسبة للإنتاج في E. القولونية من البروتينات بعد translationally تعديل يمكن وضعها والتي شيدت 2.
في الوقت الحاضر، ويستخدم البروتين overexpression أساسا للحصول على البروتينات أحادى أو وطي بلازميدة قليلة القسيمات، الذي لا يمكن أن يؤديها مع جين واحد مستنسخ إلى البلازميد المناسب hypersynthesis. ومع ذلك، كان الاهتمام في الآونة الأخيرةالمدفوعة لبناء E. أنظمة البروتين شاركت في التعبير القولونية، مما يشكل تحديا للإنتاج، في الجسم الحي، من مجمعات للمغاير بلازميدة قليلة القسيمات 2. ومن المثير للاهتمام، والتجارب في وقت مبكر من البروتين شاركت في التعبير كلمة أمام الجمعية بين الأنواع من مفارز كبيرة وصغيرة من كربوكسيلاز السيانوبكتيريا ريبولوز-1،5-bisphosphate / أوكسيجيناز 7،8، ورابطة أشكال اقتطاع وطول كامل من HIV-1 الناسخ 9 عكس. وأظهرت هذه الدراسات الرائدة التي البروتين شاركت في التعبير يمثل بديلا قويا لالتقليدية في إعادة المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، والبروتين شارك في التعبير في E. وقد استخدم القولونية لإنتاج البروتينات المختلفة التي تحمل التعديلات بعد متعدية 2، للحصول على البروتينات التي تحتوي على الأحماض الأمينية غير طبيعية 2، وزيادة العائد من بروتينات الغشاء overexpressed 2. وعلاوة على ذلك، فإن احتمال من البروتين شاركت في التعبير كأداة لتمنح لE. القولونية المنافسةالامتحانات التنافسية الوطنية في إفراز البروتين هو قيد التحقيق النشط 2.
اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية للبروتين شارك في التعبير في E. القولونية يمكن اتباعها: ط) استخدام البلازميد واحد لاستضافة جينات مختلفة إلى أن overexpressed. ب) استخدام البلازميدات متعددة في الخلايا واحد للمشاركة في التعبير عن البروتينات المستهدفة. في الحالة الأولى، ومعايير لاختيار البلازميد لا تختلف عن تلك التي واحدة من التجارب البروتين overexpression التقليدية، على الرغم من البلازميدات معينة تحتوي على العناصر جنبا إلى جنب المروج / المشغل شيدت للمشاركة في التعبير 10. ولذا فإن هذا النهج الأول هو بسيط جدا. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أن استخدام البلازميد واحد للمشاركة في التعبير عن مختلف البروتينات يواجه صعوبات كبيرة اثنين: أ) الكتلة الجزيئية للزيادات ناقلات مع عدد من الجينات استضافت، مما يحد من عدد من البروتينات وأعرب المشترك؛ ب) عندما يتم استنساخ جينات متعددة تحت سيطرة أحد المروجين واحد، يمكن قطبية decreasالبريد التعبير عن الجينات البعيدة من المروج. استخدام البلازميدات مزدوجة أو متعددة في واحد E. خلايا القولونية ديها لتحقيق التوافق بين ناقلات الاختيار، وبالتالي فرض القيود على تركيبات المؤهلة من البلازميدات. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية شاركت في التعبير الثانية يتميز بميزة التي تحتوي على الكتلة الجزيئية للناقلات، ويحد قطبية. نحن شيدت مؤخرا نظام المشاركة في التعبير البروتين مصممة لتسهيل مكوكية من الجينات بين البلازميدات شاركت في التعبير 11. على وجه الخصوص، ونحن شيدت سلسلة نواقل pGOOD، الميزات ذات الصلة والتي هي: أ) أصل p15A النسخ المتماثل، لتوفير التوافق من البلازميدات pGOOD مع ناقلات التجارية التي تحتوي على أصل ColE1 (على سبيل المثال، سلسلة pBAD 12)؛ ب) الكاسيت التتراسيكلين المقاومة. ج) وجود لاك -derived العناصر التنظيمية، أي المروج-المشغل (O 1) الزوجين واسي س الجين. باستخدام زوجين pBAD-pGOOD المناسب، كنا قادرين على بإفراط عن جوهر الحفاز E. القولونية DNA بوليميريز الثالث، تتكون من ثلاثة مفارز مختلفة، أي α (في 'البلمرة، ε (و3'-5 5'-3) "نوكلياز خارجية) وθ (استقرار ε) 13. على وجه الخصوص، أثبتنا أن شارك في التعبير عن مجمع αεθ كان يعتمد بشكل صارم على بالإضافة إلى E. القولونية مستنبت كل من IPTG وأرابينوز، مما اثار overexpression من pGOOD وpBAD، على التوالي (الشكل 1A).
في هذا التقرير، فإننا توضيح كيفية البروتين شاركت في التعبير يمكن أن تحل بكفاءة صعوبات مرتبطة الذوبان الفقراء من حدة فرعية البروتين المعقدة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيف في بروتين الجسم الحي الاختبارات تكامل لا يمكن أن يؤديها، ونحن تقريرا أخيرا على استخدام البروتين شاركت في التعبير للتردد طفرة في تناغم E. مضيق بين قمتينأنا. لتحقيق هذا الهدف، وكنا الأزواج pGOOD-pBAD مناسبة لتوضيح الأمثلة ذات الصلة في كل دراسة حالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل E. القولونية المشارك transformants
- إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في E. المناسب سلالة القولونية إلى أن تتحول. نقل إلى 1 مل من LB المتوسطة (تريبتون، مستخلصات الخميرة، كلوريد الصوديوم بنسبة 10، 5، و 10 غرام / لتر على التوالي) مستعمرة واحدة من سلالة من الاختيار، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت ظروف تهتز من 180 دورة في الدقيقة. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في 25 مل من الطازجة المتوسطة LB واحتضان الثقافة في 37 ° C.
- في المرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة)، و resuspend بيليه في 10٪، والخامس / الخامس للمياه معقمة الجلسرين الجليد الباردة في نصف حجم ثقافة الأصلي. كرر هذه الخطوة 4 مرات، في كل مرة خفض حجم إعادة تعليق. وأخيرا، resuspend الكرية في الجلسرين / المياه وتقسيم تعليق الخلايا في 50 مكل. تخزين aliquots في -80 ° C تصل إلى 6 أشهر.
- حل البلازميد المطلوب في الماء المعقم تستكمل مع 0.5 ملي EDTA. ذوبان الجليد على جيمالبريد قسامة من الخلايا الكهربائية المختصة وتخلط مع كمية مناسبة (2.5-5 نانوغرام) من النواقل. الاستغناء الخليط في 0.1 سم كفيت مناسبة ل electroporation، وتطبيق 1.8 كيلو فولت.
- على الفور نقل الخلايا electroporated في 1 مل من SOC المتوسطة (LB المتوسطة تستكمل مع 0.2٪ ث / ت الجلوكوز، 10 ملي MgCl 2، 2.5 ملي بوكل)، واحتضان لمدة 1 ساعة تحت الهز، وأخيرا نقل 100 مكل إلى أطباق بتري تحتوي على LB أجار مع المضادات الحيوية المناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- تنقية transformants بواسطة تسليط الضوء على المستعمرات واحد على أطباق بتري.
- إعداد الخلايا الكهربائية المختصة في transformants الابتدائية وكرر الخطوات من 1،1-1،5 لتحويل مع مزيد من البلازميدات.
- إعداد مخزون الجلسرين من شارك في transformants. نقل مستعمرة واحدة في LB تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة، واحتضان عند 37 درجة مئوية تحت الهز، والمعرضة للمرحلة السجل (0.6 OD) أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلايا في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة. Resuspend بيليه في LB-المضادات الحيوية التي تحتوي على المتوسطة 15٪ ت / ت الجلسرين. الاستغناء في مأخوذة وتخزينها في - 80 ° C.
2. المشارك التعبير عن α ε والوحدات الصغرى من E. القولونية البلمرة DNA III
- نقل مع حلقة عقيمة كمية صغيرة من الأسهم الجلسرين سلالة المناسب (على سبيل المثال، TOP10 / pGOOD-ε243 وTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160، انظر الشكل 1) في طبق بتري تحتوي على LB المتوسطة والمضادات الحيوية. السماح للخلايا جافة تعليق على طبق بيتري، ومسحة الخلايا الحبرية. احتضان عند 37 درجة CO / N.
- نقل، وذلك باستخدام مسواك العقيمة، مستعمرة واحدة في 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان 8 ساعة عند 37 ° C. تمييع ما قبل الثقافة 1: 500 في متوسطة جديدة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.
- إضافة IPTG، أرابينوز، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة. جمع الخلايا، وتخزين الكريات في -20 ° C.
- الكريات ذوبان الجليد على الجليد و resuspend في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 2.5 ملي dithiothreitol، 1 ملم phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF)، ودرجة الحموضة 8). التجانس بلطف تعليق الخلايا مع بوتر الزجاج البارد.
- يصوتن في 15 W لمدة 15 ثانية، تليها 15 ثانية فاصل التبريد (4 دورات).
- أجهزة الطرد المركزي إجمالي مقتطفات البروتين في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة، في 4 درجات مئوية لاسترداد جزء القابلة للذوبان.
- تحليل بواسطة SDS-PAGE (12.5٪ الأكريلاميد) aliquots من كل استخراج البروتين القابلة للذوبان. لتحقيق هذا الهدف، ونقل 20 ميكرولتر من كل مستخلص بروتين قابل للذوبان لأنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H 2 O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ (ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة.
3. المشارك التعبير عن α الوحدة الفرعية من Deinococradiodurans سلطات الجمارك البلمرة DNA الثالث وε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA III
- إعداد ما قبل ثقافة E. القولونية سلالة TOP10 / pBAD-α الدكتور / pGOOD-ε243 في 1 مل من المتوسط LB-الأمبيسلين-التتراسيكلين واحتضان 8 ساعة عند 37 درجة مئوية. تمييع 1: 1،000 في متوسطة جديدة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- تمييع 1: 100 إلى 200 مل من المتوسط الطازجة، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ثم حمل لمدة 3 ساعة مع أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما. حصاد الخلايا، وتخزين بيليه في -20 ° C.
- Resuspend وبيليه في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم PMSF. التجانس وتعطيل الخلايا كما هو موضح في 2.4 و 2.5.
- أجهزة الطرد المركزي فورا الخلايا المحللة في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة. تجاهل بيليه. تصفية طاف مع قمع بوشنر مجهزة 3 طبقات من ورق الترشيح. تطبيق فراغ لطيف. لتجنب رغوة المفرطة، والحفاظ على فراغ قارورة مخروطي على الجليد أثناء الترشيح.
- تحديد تركيز البروتين وفقا لبرادفورد 14.
4. جل الترشيح اللوني
- تتوازن ل16x70-تغلف المياه (200) عمود الترشيح هلام مع 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8. تحميل على العمود استخراج البروتين القابلة للذوبان. لحل الأمثل، واستخدام 1 مل عينة حلقة. أداء اللوني عند 0.6 مل / دقيقة. الحفاظ على درجة الحرارة عمود في 4 درجات مئوية طوال الوقت.
- جمع 0.9 مل الكسور وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. نقل 20 ميكرولتر من كل جزء صلة أنابيب إيبندورف تحتوي على 60 ميكرولتر من H 2 O و 20 ميكرولتر من العازلة تحميل (250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10 ملي β المركابتويثانول، و 10٪ (ث / ت) SDS، 50٪ ( ت / ت) الجلسرين، 0.25٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول) ويغلي لمدة 5 دقائق. تحميل 18 ميكرولتر من كل عينة وتنفيذ أعمال الكهربائي في 140 V لحوالي 1.5 ساعة.
- تحديد "نوكلياز خارجية 3'-5 والنشاط البلمرة DNA من كل جزء في 96-نحنليرة لبنانية microplates. فحص النشاط نوكلياز خارجية باستخدام ثيميدين 5'-أحادي البارانتروفنيل استر (ص NP-TMP) كما الركيزة 15. تقدير النشاط البلمرة DNA باستخدام PPX (بيروفسفاتاز، البيورين فوسفوريلاز، الزنثين أوكسيديز)، إلى جانب انزيم فحص 16 و 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) كلوريد -5-فينيل-2H-نتروبلو (INT) كما متقبل الإلكترون 16.
5. تحليل الطفرة من السكان المشارك معربا عن البرية من نوع ε الوحدة الفرعية من E. القولونية البلمرة DNA الثالث والطفري εD12A البديل
- نقل مستعمرة واحدة من E. القولونية TOP10 تحتوي على pBAD-ε وpGOOD1-εD12A 11 ناقلات إلى 1 مل من LB-المضادات الحيوية المتوسطة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- تمييع ما قبل الثقافة 1: 250 في 3 قوارير تحتوي على المتوسط الطازجة (10 مل)، إضافة محرضات مناسبة (أرابينوز، IPTG، أو أرابينوز وIPTG، 1 ملم لكل منهما) واحتضان عند 37 ° Cلمدة 8 ساعة. إعداد موازية في الثقافات غير المتعمد.
- جمع aliquots من 1 مل، ثم تمييع 1: 500 في قوارير جديدة تحتوي متوسطة جديدة (10 مل) تستكمل أم لا مع محرضات مناسبة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
- كرر الخطوات من 5.2 و 5.3 وجمع aliquots من 1 مل.
- تحديد وقوع عدد من الأجيال في كل ثقافة. نقل على لوحات LB، 100 ميكرولتر من التخفيفات المسلسل المناسبة من اللقاح والثقافة. احتضان O / N عند 37 درجة مئوية. عد المستعمرات على لوحات LB، وحساب سجل من عدد الخلايا الموجودة في اللقاح (سجل I) وفي الثقافة في نهاية النمو (تسجيل C). لتحديد عدد من الأجيال، استخدم الصيغة: (تسجيل C - تسجيل I) /0.301.
- الطرد المركزي في 5،000 x ج لمدة 20 دقيقة و resuspend الخلايا في 1 مل من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 50 مم كلوريد الصوديوم. لpermeabilize الخلايا، إضافة 2-3 قطرات من الكلوروفورم ودوامة لمدة 20 ثانية.
- تحديد β-النشاط جلوكوزيد كل قسامة في صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا، وذلك باستخدام ص -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc)، والركيزة. إضافة إلى كل بئر 100 ميكرولتر من الخلايا permeabilized و 100 ميكرولتر من الركيزة (16 ملغ / مل حل الأوراق المالية في H 2 O). الحرص على تجنب فقاعات الهواء في الآبار. قراءة الامتصاصية في 420 نانومتر، وذلك باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية والمرشح المناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الوحيدات ε من E. يتكون القولونية DNA بوليميريز الثالث من 243 الأحماض الأمينية ويحتوي الفقراء الذوبان 17،18، ما لم يتم حذف مخلفات 187-243 17. ومع ذلك، لقد أظهرنا سابقا 11 أن شارك في التعبير عن α كامل طول، ε، ومفارز θ غلة البلمرة DNA للذوبان III الأساسية الحفاز (الشكل 1). على وجه الخصوص، وذلك باستخدام نظام pBAD-pGOOD شاركت في التعبير، أثبتنا أن: ط) على overexpression من α ومفارز ε يمكن التحكم بشكل مستقل من قبل أرابينوز وIPTG، على التوالي (الشكل 1A)؛ ب) يمكن أن يتم الكشف عن كامل طول ε فرعية في مقتطفات البروتين القابلة للذوبان معزولة عن E. خلايا القولونية overexpressing α، ε، وθ وتخضع لهلام الترشيح (الشكل 1B). في هذه الحالة، تم توزيع النشاط نوكلياز خارجية في 3 قمم الكبرى (1B الشكل، والدوائر شغل)، وذروة تركزت في فاركوقد تبين نشوئها 23 إلى احتواء الأساسية الحفاز αεθ (أرقام 1C و1D). يتم زيادة استقرار ε حد كبير على ملزم لα و θ. عندما كنا في السابق overexpressed كامل طول ε في E. تم الكشف عن كولاي، كمية قليلة من ε المجاني من النشاف الغربي في البروتين القابلة للذوبان مقتطفات 19 (الشكل 2A). ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أنه، في ظل نفس الظروف، ونحن دائما الكشف عن كميات أكبر من C-ثالثا أشكال اقتطاع خالية من ε (ε-234، ε-228، ε-213، أو ε-186)، من بينها ε-186 أداء أفضل 19 (الشكل 2A). ونحن لم تظهر أيضا أن التحلل البروتيني من ε-C محطة نطاق والوقاية منها عن طريق الربط إلى α ومفارز θ 19. في الواقع، إن وجدت، من شارك في التعبير عن ذوبان ε يمكن اختبارها بسهولة. وكما ورد في الشكل 2B، ومقتطفات من البروتين القابلة للذوبان معزولة من خلايا overexpressingα، ε، أو α ε ويمكن تحليلها بواسطة SDS-PAGE، وسهولة مقارنة بإجمالي مقتطفات البروتين. في هذه الحالة، فإن التحليل الكهربي، يشير إلى أنه عندما overexpressed وحدها، وميزات فرعية ε الذوبان الفقراء (مقارنة حارات 1 و 2)، في حين أن شارك في التعبير عن α يعزز إلى حد كبير تركيز ε في مقتطفات البروتين القابلة للذوبان (مقارنة الممرات 3 و 4 ).
ويمكن أيضا شارك في التعبير استخدامها لتنفيذ أمور الأنواع الاختبارات تكامل. وفقا لذلك، كنا نظن أنه قد يكون من مصلحة لتقييم التفاعل بين مفارز تابعة لأجهزة تنسخي من غرام + والغرام - البكتيريا radiodurans Deinococcus هي غرام + البكتيريا، ويضم وحدة فرعية α كبيرة (1،335 الأحماض الأمينية، و 150 كيلو دالتون) و وحدة فرعية ε المفترضة التي تحتوي على 197 الأحماض الأمينية. ومن المثير للاهتمام، D. radiodurans ε فرعية هي خالية من-C محطة الحاضر المجال في E. لها القولونية E. القولونية وD. مفارز radiodurans ε تساوي 29٪ و 59٪ على التوالي (النظر المنطقة 1-178، بتنسيق د. radiodurans). لفحص اختصاص D. radiodurans البلمرة III فرعية α (α الدكتور) في ملزمة E. القولونية ε فرعية، قمنا المستنسخة في ناقلات pBAD الجينات الاصطناعية الترميز لα الدكتور وشاركنا في حولت-E. القولونية مع pBAD-α الدكتور وpGOOD-ε. إضافة في وقت واحد من IPTG وأرابينوز إلى مستنبت مشغلات المشارك التعبير عن α الدكتور وε (الشكل 3A). تم اختبار ارتباط هذه البروتينات 2 عن طريق الترشيح هلام. خلايا المشارك تعبر عن البلمرة DNA تم جمع III α الدكتور وε مفارز بواسطة الطرد المركزي (5،000 x ج، 20 دقيقة)، وعلقت في تحلل العازلة، تعطلت بسبب صوتنة، وكانت بروتينات قابلة للذوبان فوريلاي تحميلها على عمود Superdex 200 (الشكل 3B). كما يبين الشكل 3C، عندما تعرض للكسور التي تم جمعها لنوكلياز خارجية 3'-5 "والبلمرة DNA المقايسات النشاط، تم الكشف عن القمم النشاط في تحول كبير المواقف، مما يوحي بأن α الدكتور ليس المختص في ملزمة E. القولونية ε فرعية. وأكد ذلك عندما تركزت aliquots من الكسور 32، 36، و 52 وتحليلها بواسطة SDS-PAGE. تم العثور على جزء 36 لاحتواء α الدكتور وأن تكون خالية من E. القولونية ε فرعية، في حين أن نسبة 52 يرد E. القولونية ε لكن كان خاليا من α الدكتور (الشكل 3D).
النسخ المتماثل الإخلاص يعتمد في المقام الأول على قدرة بلمرة DNA للتمييز ضد أزواج قاعدة خاطئة خلال تمديد DNA. ومع ذلك، يمكن إدراجها deoxynucleotides متطابقة في 10 -4 تردد 20، والعملمن 3'-5 "exonucleases أمر ضروري لتدقيق حبلا الحمض النووي توليفها حديثا. وعلاوة على ذلك، فإن التقديرات تشير إلى أن هذا العمل التحرير DNA يزيد تكرار الإخلاص بنسبة 3 أوامر من حجم 20. وفقا لذلك، والسلالات mutator يمكن بناؤها من قبل إضعاف تصحيح التجارب المطبعية DNA، على سبيل المثال، بالإعراب عن مشروط البديل مطفرة من E. القولونية DNA بوليميريز الثالث ε فرعية. هذا ويمكن الحصول على بناء البديل من ε المختصة في ملزمة α لكن تخلو من النشاط التدقيق بها، والسيطرة على إنتاج ε مطفرة من قبل أنظمة التعبير المناسبة. باستخدام هذه الاستراتيجية، فقد تبين أن E. القولونية زيادة تردد طفرة في ظل ظروف حمل المتغيرات مطفرة من ε 11،21. ومع ذلك، تم إنجاز أي ضبط وتيرة الطفرة من قبل هذا يعني. يمكن استخدام البروتين شاركت في التعبير للحصول على تحكم أفضل سلالات mutator. لتحقيق هذا الهدف، شاركنا في تحويل E. القولونية معpBAD-ε وpGOOD1-εD12A، وذلك للحث على التعبير من النوع البري والبديل D12A مطفرة من ε مع أرابينوز وIPTG، على التوالي. كاختبار المظهري، توصلنا إلى ظهور النشاط β جلوكوزيد، وهو خفي (BGL -) في البرية من نوع E. القولونية 22،23. المسوخ عفوية قادرة على الاستفادة glucosides-β كمصادر الكربون (BGL +) ويمكن إثراء أو عزل باستخدام السائلة أو الصلبة وسائل الاعلام 23 24، على التوالي. عندما تم يسببها الخلايا للتعبير عن D12A البديل مطفرة، تم الحصول النشاط β جلوكوزيد في كاليفورنيا. 20 الأجيال (الشكل 4A). وتجدر الإشارة إلى أن اتجاها مماثلا لوحظ في الخلايا غير الناجم عن (الشكل 4A)، وعلى الأرجح لأن السيطرة النسخي التي تمارس على pGOOD1 هو راشح بدلا 11. ومع ذلك، عندما كان المستحث من النوع البري ε فرعية، وحدها أو بالاشتراك مع البديل D12A، β جلوكوزيدوقد اكتسبت النشاط E. القولونية في مستويات معتدلة (الشكل 4A). وذكرت تقارير ان النشاط β جلوكوزيد من BGL + المسوخ أن تتراوح بين 3 و 40 ميكرومتر / دقيقة 23. مستوى تحديد هنا في E. السكان القولونية تعرض للتعبير عن εD12A هو أقل بكثير، ولكن ينبغي النظر في ذلك أننا لم محاولة لعزل BGL + المسوخ على وسائل الاعلام الصلبة.
الشكل 1. المشارك التعبير عن E. القولونية DNA بوليميريز III الأساسية الحفاز. (A) SDS-PAGE من إجمالي البروتينات المستخرجة من E. القولونية TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 نمت في غياب المحرضات، في حضور أرابينوز فقط، من IPTG فقط، أو في المتوسطة تستكمل مع كل من أرابينوز وIPTG (الممرات 1-4، على التوالي). (B) الامتصاصية (دوائر فارغة) والنشاط نوكلياز خارجية (الدوائر شغل) الكسور معزولة بإخضاع إلى هلام الترشيح البروتينات القابلة للذوبان المستخرجة من E. القولونية TOP10 overexpressing α، ε، ومفارز θ من E. القولونية DNA بول-III. (C) SDS-PAGE الكسور 6، 12، 23، 31، و 41 (الممرات 1-5، على التوالي) التي أعلن عنها في لوحة B. (D) SDS-PAGE من قسامة مركزة من جزء 23، الذي النشاط نوكلياز خارجية والكهربي يتم الإبلاغ عن النمط السائد في لوحات B و C، على التوالي. أعيد طبعها بإذن من التكنولوجيا الحيوية الآداب، 33، كونتي وآخرون: "pGOODs: البلازميدات جديدة للشارك في التعبير عن البروتينات في القولونية".، 1815-1821 (2011) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. التحلل البروتيني من E. القولونية DNA بوليميريز الثالث ε فرعية. (A) تدهور موحودي كما يتضح من النشاف الغربي من البروتينات المستخرجة من E. القولونية TOP10 overexpressing طول كامل أو أشكال اقتطاع من ε. النصال تدل على موقف 25 و 19 الواسمات الجزيئية الملطخة مسبقا كيلو دالتون. أعيد طبعها بإذن من السيفير من Biochimica آخرون Biophysica اكتا البروتينات والبروتيوميات، 1794، Bressanin وآخرون: "التحلل البروتيني من الوحيدات تصحيح التجارب المطبعية تسيطر على تجميع القولونية DNA بوليميريز III الأساسية الحفاز"، 1606-1615 (2009). (ب) المشاركة في التعبير عن α ε ومفارز من E. القولونية DNA بوليميريز III الأساسية الحفاز. SDS-PAGE من مجموع (حارات 1 و 3) والقابلة للذوبان (الممرات 2 و 4) البروتين اضافيةسنت معزولة من خلايا overexpressing فرعية ε (حارات 1 و 2)، أو α ومفارز ε (الحارات 3 و 4).
الشكل 3. المشارك التعبير من الحمض النووي بوليميريز الثالث α ε ومفارز من radiodurans Deinococcus والإشريكية القولونية، على التوالي. (A) SDS-PAGE من إجمالي مقتطفات البروتين معزولة من خلايا لا يسببها (حارة 1)، أو التي يسببها لبإفراط α الدكتور، ε، أو α الدكتور وε (الممرات 2-4، على التوالي). (ب) المخطط الاستشرابي (دوائر فارغة، محور الأيسر) وتركيز البروتين الكسور (الدوائر شغلها، المحور الأيمن) مزال تشكيل العمود الترشيح هلام (Superdex 200) محملة البروتينات القابلة للذوبان المستخرجة من E. القولونية overexpressing α الدكتور لمفارز الثانية ε. (C) التدقيق (دوائر فارغة، محور الأيسر) والبلمرة DNA (الدوائر شغلها، المحور الأيمن) أنشطة الكسور التي أعلن عنها في لوحة B. (D) SDS-PAGE من مأخوذة مركزة من الكسور 32، 36، و 52. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. تردد الطفرة من E. خلايا القولونية تعرض أو عدم المشاركة في التعبير من النوع البري وD12A البديل مطفرة من حدة فرعية الحمض النووي بوليميريز الثالث ε. ويظهر أيضا خريطة البلازميد pFINE جديدة. (A) النشاط β جلوكوزيد من E. القولونية TOP10 لا يسببها (لا إنديانا) أو تعرضوا لoverexpression من النوع البري ε فرعية (آرا)، وD12A مطفرة البديل (IPTG)، أو كليهما من النوع البري وD12A مفارز ε (آرا + IPTG). وذكر أن النشاط β جلوكوزيد بوصفها وظيفة من الأجيال. (B) خريطة للناقلات التعبير الجديد pFINE. موقع استنساخ متعددة (MCS) من هذا البلازميد هو مماثلة لتلك الموجودة في pBAD وpGOOD ناقلات متوافقة، مما يتيح مكوكية سطحي من الجينات فيما بينها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن تكون البروتينات المختلين جوهريا، ويضم المناطق التي لا تقتصر على عدد محدود من التشكل 25 الهيكل العالي. هذه البروتينات المختلين وعادة ما تكون عرضة لتجميع 25، وعزلتهم وتوصيف قد تمثل مهمة صعبة. الوحيدات ε من E. القولونية DNA بوليميريز III ملامح اثنين من المجالات المتميزة 26،27، وهما: أ) المجال N-ثالثا، تحمل "النشاط نوكلياز خارجية 3'-5، والمختصة في ملزمة الوحيدات θ. ب) المجال C-ثالثا، المسؤولة عن الربط إلى α (البلمرة) فرعية. ومن المعروف المجال C-ثالثا من ε لمنح الفقراء الذوبان لهذا البروتين، وتشجيع تجميع لها. وقد تجلى بالفعل أن ε-186، وهو شكل اقتطاع من البروتين يخلو من المجال C-ثالثا، قابل للذوبان، ويمكن تنقيته مع عوائد عالية (17). ومع ذلك، عندما تفاعل مع ε α يجب أن يكون درس كميا(على سبيل المثال، لتحديد K D من مجمع αε)، مطلوب تطهير كامل طول ε، مما يعني ضمنا مهمة صعبة البيوكيميائية. في هذا الإطار، يوفر البروتين شاركت في التعبير التقديرات النوعية للربط ε α ل. لقد أثبتنا أن عوائد عالية من مجمع αεθ يمكن الحصول في الجسم الحي من قبل المشارك التعبير (الشكل 1)، وتجاوز الذوبان سوء فرعية ε. بشكل ملحوظ، وقد تم الإبلاغ عن تنقية مجمع αεθ overexpressed 28،29. ويمكن أيضا أن استراتيجية التعاون التعبير استخدامها لاختبار ما إذا كان أو لم يكن الإدراج من الطفرات في مواقع محددة في واحدة من شركاء التفاعل يضعف تشكيل تعقيدا. وفقا لذلك، والبروتين شاركت في التعبير يمثل أداة مريحة وسريعة لأداء اختبارات النوعية للتفاعل البروتين البروتين. كما تجدر الإشارة إلى أن لدينا نظام المشاركة في التعبير يعتمد على 2 مختلف محرضات، أي أرابينوز وIPTG. لذلك، والضوابط المناسبة يمكن القيام بها بسهولة عندما يختبر تشكيل مجمع البروتين، على سبيل المثال، وحذف محفز واحد من وسط النمو البكتيري (الشكل 1A).
قدمنا هنا إجراء الأمثل للشارك في التعبير عن α ومفارز ε من E. القولونية DNA بوليميريز III. عندما تم تصميم هذا البروتوكول واختبارها، تم تحديد المعلمات التالية في غاية الأهمية لنجاح التجارب شاركت في التعبير: أ) درجة الحرارة التي يتم تنفيذ الاستقراء. ب) وطول الوقت من الاستقراء. ج) تركيز محفز (ق). على وجه الخصوص، لم نتمكن من الحصول على ذوبان αεθ معقد 11 من خلايا يسببها عند 37 درجة مئوية، بصرف النظر عن زمن التحريض. لذا فإننا نقترح لاختبار درجات حرارة مختلفة للخطوة الاستقراء، وللتحقق من overexpression من البروتينات بوصفها وظيفة من الزمن. وبالإضافة إلى ذلك، وتقييم مواز من شارك في التعبير في فرقerent E. يمكن أن سلالات القولونية تكون عونا عند مواجهة عوائد معتدلة من البروتينات المستهدفة.
لقد ذكرت هنا تجربة تمثيلية يؤديها لاختبار ملزمة للبروتينات من مختلف الأنواع، ونحن قد أظهرت أن بروتين شاركت في التعبير مفيد لاختبار بسرعة الجمعية من 2 البروتينات غير متجانسة إلى مجمع ظيفية الهجين. كان يستخدم الترشيح هلام اللوني هنا لتقييم تشكيل معقد (الشكل 3). ومع ذلك، يمكن إدخال علامة المناسبة لأحد الشركاء التفاعل تسهيل هذا التقييم، والسماح للاستخدام وسائل التقاط التقارب. لتفادي أي تشويش من العلامة مع تفاعلات البروتين البروتين، الجين الترميز لأحد الشركاء التفاعل ويمكن إدراج بالتوازي في pBAD / صاحب وpBAD / Myc على العاهل ناقلات، منح التوالي عزر hexahistidine في N- وC -terminus من البروتين الهدف.
E. القولونية mutatoسلالات ص ميزة ترددات طفرة أعلى من نظرائهم نوع البرية. سلالات Mutator ذات أهمية في مجال التكنولوجيا الحيوية 30، على سبيل المثال، أن تتطور بسرعة سلالة الهدف نحو الرواية، المطلوب، الظواهر. قدمنا هنا دليل على أن تشارك في التعبير عن النوع البري وحدة فرعية ε مطفرة من E. القولونية DNA بوليميريز الثالث، وتواتر تحور المضيف البكتيري يمكن ضبطها مع راحة كافية. لزيادة تحسين هذه التكنولوجيا، وناقلات التعبير ينظم بإحكام ضرورية لقمع قدر الإمكان التعبير عن البديل D12A مطفرة بقوة فرعية ε. على وجه الخصوص، سيكون من المثير للاهتمام أن اختبار تردد طفرة في E. القولونية تحولت مع pBAD-εD12A وpGOOD1-ε، أي بديل التكوين لتلك المقدمة هنا. من المعروف أن ناقلات pBAD الواقع أن ينظم بإحكام 12، وهذه الميزة يمكن أن تساعد في الحفاظ على تركيز القاعدية من εD12Aعند مستويات منخفضة.
وذكرت أمثلة من البروتين شاركت في التعبير هنا تشهد طبيعة متعددة الأوجه من هذه التقنية. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن استخدام عدد وافر من البلازميدات متوافقة في واحد E. خلايا القولونية يمكن توسيع كثيرا من التحديات التي يمكن تناولها من قبل البروتين شارك في التعبير. في السنوات الأخيرة، كرس العمل المكثف لتوسيع ذخيرة من البلازميدات متوافقة لاستخدامها في البروتين شارك في التعبير. على وجه الخصوص، تم استخدام النظام الثلاثي الاعتماد على البلازميدات متوافقة تحمل أصول ColE1، p15A، وpSC101 النسخ المتماثل للمشاركة في التعبير عن إما البروتينات البكتيرية والثدييات 31. في الآونة الأخيرة، أفيد نظام شاركت في التعبير رباعي. في هذه الحالة، 13 الجينات مغاير وقد شارك أعرب في E. تحولت المشارك القولونية مع 4 ناقلات التعبير متوافقة، التي تحتوي على ColE1، p15A، CloDF13، وأصول مراسلون بلا حدود النسخ المتماثل 32. وقد استخدم هذا النظام شاركت في التعبير بنجاح لإنتاج فيE. القولونية الفومارية للذوبان نشاطا وظيفيا أنا من Pyrococcus furiosus 32. للتكبير نظام ثنائي لدينا، وشيدت متجه تعبير جديد، pFINE، التي تحتوي على أصل pSC101 النسخ المتماثل، كاسيت النيوميسين المقاومة، والعناصر التنظيمية أمريكا اللاتينية والكاريبي (الشكل 4B). يحتوي هذا البلازميد نفس polylinker موجودة في pBAD وpGOOD ناقلات، مما يسهل الجينات في رحلات مكوكية بين مكونات 3 من نظام المشاركة في التعبير. وعلى الرغم من pFINE هو انخفاض في عدد النسخ البلازميد، تم العثور على استقرارها لتكون مرضية عند اختباره في المتوسط الغني. نحن منخرطون حاليا في مزيد من التوسع في موقعنا الثلاثي نظام المشاركة في التعبير. لتحقيق هذا الهدف، ونحن شيدت مشتق pBAD تحتوي على كاسيت الكلورامفينيكول المقاومة، ونحن في الطريق لتبادل أصل ColE1 من النسخ المتماثل مع واحد متوافق مع ColE1، p15A، وpSC101. هو في الواقع رأينا أن استخدام البلازميدات متعددة في واحد E. القولونية خلايا مندوبيمقت أداة قوية لتحدي التعبير في الجسم الحي من المجمعات البروتين يتكون من عدد وافر من مفارز مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
واعترف بشكل كبير على إذن من الوثاب وإلسفير في إعادة طبع الأرقام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
