Introduction
La introducción de tecnologías de sobreexpresión impulsado cualquiera de los estudios bioquímicos de las enzimas bajo número de copias y la producción industrial de proteínas farmacológicamente activas (por ejemplo, insulina). Desde la llegada de estas tecnologías, los avances se han logrado importantes para aumentar el rendimiento y la calidad de las proteínas recombinantes. Además, los sistemas de sobreexpresión procariotas y eucariotas 1,2 3 fueron desarrollados en los últimos años, ofreciendo alternativas útiles a la "caballo de batalla" de la biotecnología de proteínas, es decir, la Escherichia coli. En particular, la disponibilidad de plataformas alternativas a E. coli condujo a la producción de péptidos o proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales recombinantes. Sin embargo, se debe mencionar que la E. coli sigue siendo el organismo de elección para la producción de proteínas recombinantes. Esto se debe a varios factores, entre los cuales los más relevantes se puedenconsiderado: i) la disponibilidad de un buen número de sistemas de sobreexpresión (vectores de expresión y cepas) para E. coli 1,2; ii) veces el corto generación y altos rendimientos de biomasa, de E. coli en una variedad de medios ricos y sintético; iii) la fácil manipulación ya sea en la bioquímica y en el nivel genético de este microorganismo; iv) el aislamiento de cepas capaces de la producción de proteínas tóxicas 4; v) la construcción de cepas que ofrecen inducción homogénea a nivel de población 5,6. Además, se ha demostrado recientemente que los sistemas de expresión adecuados para la producción en E. coli de proteínas después de la traducción modificados se puede diseñar y construir 2.
En la actualidad, la sobreexpresión de proteínas se utiliza principalmente para obtener proteínas monoméricas o homo-oligómero, cuyos hiperproducción se puede realizar con un solo gen clonado en un plásmido apropiado. Sin embargo, la atención fue recientementepagado a la construcción de E. sistemas de la proteína co-expresión de E. coli, desafiando la producción, in vivo, de complejos hetero-oligoméricos 2. Curiosamente, los primeros experimentos de la proteína co-expresión se dirigieron a la asamblea inter-especies de grandes y pequeñas subunidades de carboxilasa cianobacterias ribulosa-1,5-bisfosfato / oxigenasa 7,8, y la asociación de formas truncadas y de longitud completa de VIH-1 transcriptasa inversa 9. Estos estudios pioneros demostraron que la proteína co-expresión representa una poderosa alternativa a los tradicionales en la reconstitución in vitro. Además, la proteína co-expresión en E. coli se utilizó para producir diferentes proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales 2, para obtener proteínas que contienen aminoácidos no naturales 2, y para aumentar el rendimiento de proteínas de la membrana sobreexpresados 2. Por otra parte, el potencial de la proteína co-expresión como una herramienta para confiere a E. coli competirna vez en la secreción de la proteína está bajo investigación activa 2.
Dos estrategias principales de proteínas co-expresión en E. coli puede perseguirse: i) el uso de un único plásmido para albergar los diferentes genes que se sobreexpresa; ii) el uso de múltiples plásmidos en células individuales para co-expresar las proteínas diana. En el primer caso, los criterios para la elección del plásmido no difieren de las de los experimentos de sobreexpresión de la proteína individuales tradicionales, aunque plásmidos particulares que contienen elementos en tándem promotor / operador se construyeron para la co-expresión 10. Por tanto, esta primera aproximación es bastante simple. Sin embargo, se debe mencionar que el uso de un único plásmido para co-expresar diferentes proteínas se enfrenta a dos dificultades principales: i) la masa molecular de los vectores aumenta con el número de genes alojados, lo que limita el número de proteínas co-expresó; ii) cuando múltiples genes se clonan bajo el control de un único promotor, de polaridad puede decrease la expresión de los genes distales del promotor. El uso de plásmidos dobles o múltiples en una sola E. células de E. coli tiene que lograr la compatibilidad de los vectores de elección, por lo tanto, la imposición de limitaciones a las combinaciones admisibles de plásmidos. Sin embargo, esta segunda estrategia de co-expresión cuenta con la ventaja de contener la masa molecular de los vectores, y limita la polaridad. Recientemente hemos construido un sistema de co-expresión de la proteína diseñada para facilitar el vaivén de genes entre los plásmidos co-expresión 11. En particular, se construyó la serie vectores PGOOD, las características relevantes de los cuales son los siguientes: i) un origen de replicación p15A, para proporcionar compatibilidad de los plásmidos PGOOD con los vectores comerciales que contiene el origen ColE1 (por ejemplo, la serie pBAD 12); ii) un casete de resistencia a tetraciclina; iii) la presencia de lac -derivado elementos reguladores, es decir, el promotor-operador (O 1) par y el lacI q gen. El uso de un par pBAD-PGOOD apropiado, hemos sido capaces de sobreexpresan el núcleo catalítico de E. coli DNA polimerasa III, compuesto de tres subunidades diferentes, es decir, α (la 'de la polimerasa, ε (la 3'-5 5'-3)' exonucleasa) y θ (ε estabilización) 13. En particular, hemos demostrado que la co-expresión del complejo αεθ era estrictamente dependiente de la adición a la E. coli medio de cultivo tanto de IPTG y arabinosa, desencadenando la sobreexpresión de PGOOD y pBAD, respectivamente (Figura 1A).
En el presente informe, se expone cómo la proteína co-expresión puede resolver eficientemente las dificultades vinculadas a la mala solubilidad de una subunidad de proteína compleja. Además, se muestra cómo en ensayos de complementación de proteínas in vivo se pueden realizar, y finalmente nos informe sobre el uso de la proteína co-expresión de la frecuencia de mutación sintonizar E. columnayo. Para ello, utilizamos parejas PGOOD-PBAD adecuados para ilustrar ejemplos relevantes de cada estudio de caso.
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Protocol
1. Aislamiento de E. coli cotransformantes
- Preparar las células electro-competente del E. apropiado cepa de E. coli que se transforma. Traslado a 1 ml de medio LB (triptona, extracto de levadura, NaCl a 10, 5, y 10 g / l, respectivamente) de una sola colonia de la cepa de elección, y se incuba a 37 ° C bajo condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1: 500 en 25 ml de medio LB fresco y se incuba el cultivo a 37 ° C.
- En fase logarítmica (0,6 OD) centrifugar la suspensión de células a 5.000 xg durante 20 min), y resuspender el pellet en 10%, v / v de glicerol-agua estéril enfriada con hielo en la mitad del volumen de cultivo original. Repita este paso 4 veces, reducir a la mitad cada vez que el volumen de resuspensión. Por último, volver a suspender el sedimento en glicerol / agua y dividir la suspensión de células en 50 ml de alícuotas. Almacene las alícuotas a -80 ° C hasta 6 meses.
- Disolver el plásmido deseado en agua estéril suplementado con EDTA 0,5 mM. Deshielo en ice una alícuota de células electro-competente y mezclar con una cantidad apropiada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar la mezcla en una cubeta de 0,1 cm adecuado para electroporación, y aplicar 1,8 kV.
- Inmediatamente transferir las células a electroporación en 1 ml de medio SOC (medio LB suplementado con 0,2% w / v de glucosa, 10 mM de MgCl 2, KCl 2,5 mM), se incuba durante 1 h bajo agitación, y, finalmente, transferir 100 ml de alícuotas a placas de Petri que contiene agar LB con el antibiótico apropiado. Incubar O / N a 37 ° C.
- Purifica los transformantes estriando colonias individuales en placas de Petri.
- Preparar las células electro-competentes de los transformantes primarios y repita los pasos 1.1 a 1.5 para transformar con otros plásmidos.
- Preparar las existencias de glicerol de los co-transformantes. Transferencia de una sola colonia en LB suplementado con los antibióticos apropiados, se incuba a 37 ° C bajo agitación, y en fase logarítmica (0,6 OD) Centrifugar la suspensión de células a 5.000 xg durante 20 min. Resuspend el sedimento en LB-antibióticos que contienen medio de 15% v / v de glicerol. Distribuir en alícuotas y almacenar a - 80 ° C.
2. Co-expresión de α y ε Subunidades de E. coli ADN polimerasa III
- Transferencia con un asa estéril una pequeña cantidad de la glicerol cepa apropiada (por ejemplo, TOP10 / PGOOD-ε243 y TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, véase la Figura 1) en una placa de Petri que contenían medio LB y los antibióticos. Deje que la células suspensión seca en la placa de Petri, y la racha de las células de las gotas. Se incuba a 37 ° CO / N.
- Transfer, usando un palillo de dientes estéril, una sola colonia de 1 ml de medio LB-antibióticos. Incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir el precultivo 1: 500 en medio fresco y se incuba a 30 ° C durante 15 hr.
- Añadir IPTG, arabinosa, o arabinosa y IPTG, 1 mM cada uno. Se incuba a 30 ° C durante 2,5 horas. Recoger las células, y almacenar los pellets a -20 ° C.
- Pellets de descongelación en hielo y se resuspende en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), pH 8). Homogeneizar suavemente la suspensión de células con un alfarero vaso frío.
- Someter a ultrasonidos a 15 W durante 15 segundos, seguido por 15 seg intervalo de refrigeración (4 ciclos).
- Centrifugar los extractos de proteínas totales a 10.000 xg durante 20 min, a 4 ° C para recuperar la fracción soluble.
- Analizar por alícuotas de cada extracto de proteína soluble SDS-PAGE (12,5% de acrilamida). Para este objetivo, transferir 20 l de cada extracto de proteína soluble a tubos Eppendorf que contienen 60 l de H 2 O y 20 l de tampón de carga (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) y hervir durante 5 min. Cargar 18 l de cada muestra y realizar la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 1,5 hr.
3. Co-expresión de la subunidad α de Deinococradiodurans CUS ADN polimerasa III y ε Subunidad de E. coli ADN polimerasa III
- Preparar un cultivo previo de la E. coli cepa TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 en 1 ml de medio LB-ampicilina-tetraciclina e incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir 1: 1000 en medio fresco y se incuba O / N a 37 ° C.
- Diluir 1: 100 en 200 ml de medio fresco, se incuba a 37 ° C durante 3 horas, a continuación, inducir durante 3 horas con arabinosa y IPTG, 1 mM de cada uno. Recoger las células, y almacenar el pellet a -20 ° C.
- Resuspender el precipitado en 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogeneizar y romper las células como se describe en 2.4 y 2.5.
- Inmediatamente Centrifugar las células lisado a 10.000 xg durante 20 min. Deseche la pastilla. Se filtra el sobrenadante con un embudo Büchner equipado con 3 capas de papel de filtro. Aplicar vacío suave. Para evitar la excesiva formación de espuma, mantenga el matraz Erlenmeyer vacío en hielo durante la filtración.
- Determinar la concentración de proteína de acuerdo con Bradford 14.
4. Cromatografía de filtración en gel
- Equilibrar la columna de filtración en gel un 16x70 con camisa de agua (200) con 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8. carga sobre la columna del extracto de proteína soluble. Para una resolución óptima, utilice un bucle de muestra de 1 ml. Realizar la cromatografía en 0,6 ml / min. Mantenga temperatura de la columna a 4 ° C en todo.
- Recoger fracciones de 0,9 ml y analizarlas por SDS-PAGE. Transferencia de 20 l de cada fracción correspondiente a tubos Eppendorf que contienen 60 l de H 2 O y 20 l de tampón de carga (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) y hervir durante 5 min. Cargar 18 l de cada muestra y realizar la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 1,5 hr.
- Determinar la 3'-5 'exonucleasa y la actividad de la ADN polimerasa de cada fracción en 96-nosll microplacas. Ensayar la actividad exonucleasa usando timidina 5'-monofosfato de éster p-nitrofenil (p NP-TMP) como sustrato 15. Estimar la actividad de la polimerasa de ADN utilizando la PPX (pirofosfatasa, purina nucleósido fosforilasa, la xantina oxidasa) de la enzima de acoplamiento de ensayo de 16 y 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolio (INT) como aceptor de electrones 16.
5. Mutación análisis de las poblaciones Co-expresan la subunidad ε de tipo silvestre de E. coli ADN polimerasa III y la mutagénico εD12A Variant
- Transferir una sola colonia de E. coli TOP10 contiene el pBAD-ε y los pGOOD1-εD12A 11 vectores a 1 ml de medio LB-antibióticos. Incubar O / N a 37 ° C.
- Diluir el precultivo 1: 250 en 3 matraces que contenían medio fresco (10 ml), agregar los inductores apropiados (arabinosa, IPTG, o arabinosa y IPTG, 1 mM cada uno) y se incuba a 37 ° Cdurante 8 horas. Preparar cultivos paralelos no inducidas.
- Recoger alícuotas de 1 ml, luego se diluye 1: 500 en los nuevos matraces que contienen medio fresco (10 ml) suplementado o no con los inductores apropiados. Incubar O / N a 37 ° C.
- Repita los pasos 5.2 y 5.3 y recoger alícuotas de 1 ml.
- Determinar el número de generaciones se produjo en cada cultura. Traslado en placas de LB, 100 l de diluciones en serie apropiadas de inóculo y la cultura. Incubar O / N a 37 ° C. Contar las colonias en las placas de LB, y calcular el registro del número de células presentes en el inóculo (log I) y en el cultivo al final del crecimiento (log C). Para determinar el número de generaciones, utilice la fórmula: (log C - log I) /0.301.
- Centrifugar a 5000 xg durante 20 min y resuspender las células en 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar las células, añadir 2-3 gotas de cloroformo y agitar durante 20 segundos.
- Determinar la β-actividad glucosidasa de cada alícuota en una microplaca de 96 pocillos, usando p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como sustrato. Añadir a cada pocillo 100 l de células permeabilizadas y 100 l de sustrato (16 mg / ml solución madre en H 2 O). Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire en los pozos. Leer la absorbancia a 420 nm, usando un lector de microplacas y el filtro apropiado.
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Representative Results
La subunidad ε de E. coli ADN polimerasa III consta de 243 aminoácidos y tiene poca solubilidad 17,18, a menos que se eliminan los residuos 187-243 17. Sin embargo, hemos demostrado que el 11 co-expresión de α de longitud completa, ε y θ subunidades produce ADN polimerasa III soluble núcleo catalítico (Figura 1). En particular, utilizando el sistema de pBAD-PGOOD co-expresión, hemos demostrado que: i) la sobreexpresión de α y ε subunidades puede ser controlado independientemente por arabinosa y IPTG, respectivamente (Figura 1A); ii) la subunidad de longitud completa ε puede ser detectada en extractos de proteínas solubles aislados de E. células de E. coli que sobreexpresa α, ε, y θ y se sometió a filtración en gel (Figura 1B). En este caso, la actividad exonucleasa se distribuyó en 3 picos principales (Figura 1B, círculos rellenos), y el pico centrado en fracla 23 se muestra para contener el núcleo catalítico αεθ (Figuras 1C y 1D). La estabilidad de ε se incrementa en gran medida de la unión a α y θ. Cuando previamente sobreexpresa larga duración ε en E. coli, una baja cantidad de ε libre se detectó por Western Blot en extractos de proteína soluble 19 (Figura 2A). Es interesante observar que, en las mismas condiciones, que siempre se detectan cantidades más altas de C-ter libres formas truncadas de ε (ε-234, ε-228, ε-213, o ε-186), entre los que ε-186 obtenido mejores 19 (Figura 2). Hicimos también demostramos que la proteólisis de dominio ε C-terminal es impedido por la unión a las subunidades α y θ 19. El efecto, en su caso, de la co-expresión de la solubilidad de ε puede probarse fácilmente. Como se informó en la Figura 2B, extractos de proteínas solubles aislados a partir de células que sobreexpresanα, ε, o α y ε pueden ser analizados por SDS-PAGE, y convenientemente en comparación con los extractos de proteínas totales. En este caso, el análisis electroforético indica que, cuando se sobreexpresa solo, características subunidad ε pobre solubilidad (comparar los carriles 1 y 2), mientras que la co-expresión de α mejora en gran medida la concentración de ε en extractos de proteínas solubles (comparar los carriles 3 y 4 ).
Co-expresión también se puede utilizar para llevar a cabo ensayos de complementación entre especies. En consecuencia, pensamos que podría ser de interés para evaluar la interacción entre subunidades pertenecientes a las maquinarias de replicación de Gram + y Gram -. Bacteria Deinococcus radiodurans es una bacteria Gram +, que ofrece una gran subunidad α (1.335 aminoácidos, 150 kDa) y una subunidad ε putativo que contiene 197 aminoácidos. Curiosamente, D. radiodurans subunidad ε está desprovista de la C-terminal de dominio presente en su E. coli E. coli y D. subunidades radiodurans ε son iguales a 29% y 59%, respectivamente (teniendo en cuenta la región 1-178, D. radiodurans coordenadas). Para analizar la competencia de D. radiodurans polimerasa III subunidad α (α Dr) en E. vinculante subunidad ε coli, hemos clonado en el vector pBAD un gen sintético que codifica para α Dr y hemos co-transformado E. coli con pBAD-α Dr y PGOOD-ε. La adición simultánea de IPTG y arabinosa al medio de cultivo desencadena la co-expresión de α Dr y ε (Figura 3A). La asociación de estas 2 proteínas se ensayó por filtración en gel. Las células co-expresión de la ADN polimerasa III subunidades α y ε Dr se recogieron por centrifugación (5.000 xg, 20 min), se suspendió en tampón de lisis, se rompen por sonicación, y las proteínas solubles fueron inmediatosLy cargó en una columna Superdex 200 (Figura 3B). Como muestra la Figura 3C, cuando las fracciones recogidas fueron sometidas a exonucleasa 3'-5 'y para ensayos de actividad ADN polimerasa, se detectaron los picos de actividad significativamente cambiado de posición, lo que sugiere que α Dr no es competente en E. vinculante subunidad ε coli. Esto se confirmó cuando se concentraron y se analizaron alícuotas de las fracciones 32, 36, y 52 por SDS-PAGE. Fracción 36 se encontró que contenía α doctor y estar desprovisto de E. subunidad ε coli, mientras que la fracción 52 contenía E. coli ε pero carecía de α Dr (Figura 3D).
Fidelidad de replicación se basa principalmente en la capacidad de las ADN polimerasas para discriminar a los emparejamientos erróneos de bases de ADN durante la extensión. Sin embargo, desoxinucleótidos no coincidentes se pueden incorporar a las 10 -4 frecuencia 20, y la acciónde 3'-5 'exonucleasa es esencial para corregir la cadena de ADN recién sintetizado. Por otra parte, se estimó que esta acción de edición de ADN aumenta la fidelidad de replicación por 3 órdenes de magnitud 20. Por consiguiente, las cepas mutantes se pueden construir por alterar la corrección de pruebas de ADN, por ejemplo, por condicionalmente expresar una variante mutagénico de E. subunidad coli ADN polimerasa III ε. Esto se puede obtener la construcción de una variante de ε competente en la unión α pero desprovista de su actividad de corrección de pruebas, y el control de la producción de ε mutagénico por los sistemas de expresión apropiados. Utilizando esta estrategia, se demostró que E. aumenta la frecuencia de mutación coli bajo condiciones de inducción variantes mutagénicas de ε 11,21. Sin embargo, ningún ajuste fino de la frecuencia de mutación fue lograda por este medio. La proteína co-expresión puede ser usada para obtener un mejor control de cepas mutantes. Para este objetivo, cotransformó E. coli conpBAD-ε y pGOOD1-εD12A, con el fin de inducir la expresión de la de tipo salvaje y la variante D12A mutagénico de ε con arabinosa y IPTG, respectivamente. Como una prueba fenotípica, se determinó la aparición de la actividad β-glucosidasa, que es críptico (Bgl -) de tipo salvaje E. coli 22,23. Mutantes espontáneos capaz de utilizar β-glucósidos como fuentes de carbono (Bgl +) se pueden enriquecer o aislar usando líquidos o sólidos 23 medios de comunicación 24, respectivamente. Cuando se indujeron células para expresar el D12A variante mutagénico, la actividad β-glucosidasa fue adquirida en ca. 20 generaciones (Figura 4a). Cabe señalar que se observó una tendencia similar en las células no inducidas (Figura 4A), muy probablemente debido a que el control transcripcional ejercida sobre pGOOD1 es bastante permeable 11. Sin embargo, cuando se indujo la subunidad ε de tipo salvaje, solo o en combinación con la variante D12A, β-glucosidasala actividad fue adquirido por E. coli a niveles moderados (Figura 4A). Se informó que la actividad β-glucosidasa de BgI + mutantes que oscile entre los 3 y 40 micras / min 23. El nivel determinado aquí en E. coli poblaciones sometidas a la expresión de εD12A es mucho menor, pero se debe considerar que no se intentó aislar BgI + mutantes en medios sólidos.
Figura 1. Co-expresión de E. coli DNA polimerasa III núcleo catalítico. (A) SDS-PAGE de proteínas totales extraídas de E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / PGOOD-ε243 cultiva en ausencia de inductores, en presencia de arabinosa solamente, de IPTG solamente, o en el medio suplementado tanto con arabinosa y IPTG (carriles 1-4, respectivamente). (B) Absorbancia (círculos vacíos) y la actividad exonucleasa (círculos rellenos) de las fracciones aisladas por someter a filtración en gel proteínas solubles extraídos de E. coli TOP10 que sobreexpresan α, ε, y θ subunidades de E. coli ADN Pol-III. (C) SDS-PAGE de las fracciones 6, 12, 23, 31, y 41 (carriles 1-5, respectivamente) informaron en el Panel B. (D) SDS-PAGE de una alícuota de concentrado de la fracción 23, cuya actividad exonucleasa y electroforética patrón se presentan en los paneles B y C, respectivamente. Reproducido con permiso del Biotechnology Letters, 33, Conte et al:. "PGOODs: nuevos plásmidos para la co-expresión de proteínas en Escherichia coli"., 1815-1821 (2011) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La proteólisis de E. coli ADN polimerasa III subunidad ε. (A) Degradación de monomérico tal como se revela mediante inmunotransferencia de tipo Western de proteínas extraídas de E. coli TOP10 con sobreexpresión de longitud completa o formas truncadas de ε; puntas de flecha indican la posición de los 25 y los 19 marcadores moleculares kDa pre-manchado. Reproducido con permiso de Elsevier de Biochimica et Biophysica Acta Proteínas y Proteómica, 1794, Bressanin et al:. "La proteólisis de la subunidad corrección controla el montaje de la polimerasa III núcleo catalítico de ADN de Escherichia coli", 1606-1615 (2009). (B) Co-expresión de α y ε subunidades de E. coli DNA polimerasa III núcleo catalítico. SDS-PAGE del total (carriles 1 y 3) y solubles (carriles 2 y 4) proteína extracts aisladas a partir de células que sobreexpresan la subunidad ε (carriles 1 y 2), o α y subunidades ε (carriles 3 y 4).
Figura 3. Co-expresión de la ADN polimerasa III α y ε subunidades de Deinococcus radiodurans y Escherichia coli, respectivamente. (A) SDS-PAGE de extractos de proteínas totales aislados a partir de células no inducidas (carril 1), o inducidas para sobreexpresar α Dr, ε, o α Dr y ε (carriles 2-4, respectivamente). (B) Cromatograma (círculos vacíos, eje de la izquierda) y la concentración de proteína de las fracciones (círculos rellenos, eje derecho) eluyeron formar una columna de filtración en gel (Superdex 200) cargado con proteínas solubles extraídos de E. coli que sobreexpresa α Dra unsubunidades nd ε. (C) Corrección (círculos vacíos, eje izquierdo) y la ADN polimerasa (círculos rellenos, eje derecho) actividades propias de las fracciones reportados en el Panel B. (D) SDS-PAGE de las alícuotas concentradas de las fracciones 32, 36, y 52. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La frecuencia de mutación de E. células de E. coli sometidas o no a la co-expresión de la de tipo salvaje y la variante D12A mutagénico de la subunidad ADN polimerasa III ε. También se muestra el mapa del nuevo plásmido pFINE. (A) la actividad β-glucosidasa de E. coli TOP10 no inducida (n Ind) o sometido a la sobreexpresión de ε de tipo salvaje subunidad (Ara), la variante D12A mutagénico (IPTG), o ambos de tipo salvaje y D12A subunidades ε (Ara + IPTG). La actividad β-glucosidasa se reporta como una función de las generaciones. (B) Mapa de la nueva pFINE vector de expresión. El sitio de clonación múltiple (MCS) de este plásmido es idéntico a los presentes en los vectores pBAD y PGOOD compatibles, dejando shuttling facile de genes entre ellos.
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Discussion
Las proteínas pueden ser intrínsecamente desordenados, con regiones cuya estructura terciaria no está restringido a un número limitado de conformaciones 25. Estas proteínas desordenadas son generalmente propensos a la agregación 25, y su aislamiento y caracterización pueden representar una tarea difícil. La subunidad ε de E. coli DNA polimerasa III tiene dos dominios distintos 26,27, a saber: i) el dominio N-ter, teniendo la 'actividad exonucleasa 3'-5, y competente en la unión de la subunidad θ; ii) el dominio C-ter, responsable de la unión a la α (polimerasa) subunidad. El dominio C-ter de ε se conoce para conferir escasa solubilidad a esta proteína, la promoción de su agregación. En efecto, se demostró que ε-186, una forma truncada de la proteína carece del dominio C-ter, es soluble, y se puede purificar con altos rendimientos 17. Sin embargo, cuando la interacción de ε con α ha de ser estudiado cuantitativamente(Por ejemplo, para determinar la K D del complejo αε), se requiere la purificación de longitud completa ε, lo que implica una tarea difícil bioquímica. En este marco, la proteína co-expresión proporciona estimaciones cualitativas de la unión de ε a α. Hemos demostrado que los altos rendimientos del complejo αεθ se pueden obtener in vivo mediante la co-expresión (Figura 1), sin pasar por la escasa solubilidad de la subunidad ε. Sorprendentemente, la purificación del complejo αεθ sobreexpresada ha informado 28,29. La estrategia de co-expresión también se puede utilizar para probar si o no la inserción de mutaciones específicas de sitio en uno de los socios que interactúan perjudica la formación de complejos. En consecuencia, la proteína co-expresión representa una herramienta conveniente y rápido para llevar a cabo pruebas cualitativas de interacción proteína-proteína. También debe tenerse en cuenta que nuestro sistema de co-expresión se basa en 2 diferentes inductores, es decir, arabinosa y IPTG. Por lo tanto, los controles apropiados se pueden realizar fácilmente cuando se prueba la formación de un complejo de proteínas, por ejemplo, omitiendo una inductor del medio de crecimiento bacteriano (Figura 1A).
Presentamos aquí un procedimiento optimizado para la co-expresión de la α y ε subunidades de E. coli DNA polimerasa III. Cuando este protocolo fue diseñado y probado, los siguientes parámetros fueron identificados como críticos para el éxito de los experimentos de co-expresión: i) la temperatura a la que se realiza la inducción; ii) el tiempo-longitud de inducción; iii) la concentración de inductor (s). En particular, no hemos podido obtener soluble αεθ complejo 11 de células inducidas a 37 ° C, con independencia del tiempo de inducción. Por lo tanto sugerimos probar diferentes temperaturas para la etapa de inducción, y para comprobar la sobreexpresión de las proteínas en función del tiempo. Además, la evaluación paralela de co-expresión en different E. cepas de E. coli pueden ser de ayuda cuando se enfrentan a rendimientos moderados de las proteínas diana.
Hemos informado aquí un experimento representativo realizado para probar la unión de las proteínas de diferentes especies, y hemos demostrado que la proteína co-expresión es útil para probar rápidamente la asociación de 2 proteínas heterólogas en un complejo funcional híbrido. Cromatografía de filtración en gel se utiliza aquí para evaluar la formación de complejos (Figura 3). Sin embargo, la inserción de una etiqueta adecuada a uno de los socios que interactúan podría facilitar esta evaluación, dejando que el uso de los métodos de captura por afinidad. Para evitar la interferencia de la etiqueta con las interacciones proteína-proteína, el gen que codifica para uno de los socios que interactúan podría insertarse en paralelo en pBAD / His y pBAD / Myc vectores -Sus, que confieren respectivamente un motivo de hexahistidina en el extremo N y el C -terminal de la proteína diana.
E. coli Mutantecepas r cuentan con frecuencias de mutación más altos que sus homólogos de tipo salvaje. Las cepas mutantes son de interés en la biotecnología 30, por ejemplo, a evolucionar rápidamente hacia una cepa objetivo novela, deseados, fenotipos. Proporcionamos aquí evidencia de que la co-expresión de la de tipo salvaje y una subunidad ε mutagénico de E. coli ADN polimerasa III, la frecuencia de mutación del huésped bacteriana puede ser sintonizado con suficiente comodidad. Para mejorar aún más esta tecnología, los vectores de expresión fuertemente reguladas son necesarias para reprimir tanto como sea posible la expresión de la variante D12A fuertemente mutagénico de la subunidad ε. En particular, sería interesante para probar la frecuencia de mutación en E. coli transformada con el pBAD-εD12A y pGOOD1-ε, es decir, la alternativa de configuración para que se presenta aquí. Los vectores PBAD son de hecho sabe que están estrictamente regulados 12, y esta característica puede ayudar a mantener la concentración basal de εD12Aen niveles bajos.
Los ejemplos de la proteína co-expresión informaron aquí atestiguan las múltiples facetas de esta técnica. Sin embargo, es importante señalar que el uso de una multiplicidad de plásmidos compatibles en una sola E. coli células pueden ampliar en gran medida los problemas que pueden ser absorbidos por la proteína co-expresión. En los últimos años, el trabajo intenso se dedicó a ampliar el repertorio de plásmidos compatibles para ser utilizados para la proteína co-expresión. En particular, se utilizó para co-expresar cualquiera de las proteínas bacterianas y de mamíferos 31 un sistema ternario depender de plásmidos compatibles que llevan los orígenes ColE1, p15A, pSC101 y de la replicación. Recientemente, se informó de un sistema de co-expresión cuaternario. En este caso, 13 genes heterólogos se coexpresarse en E. coli co-transformada con vectores de expresión compatibles 4, que contiene el ColE1, p15A, CloDF13, y los orígenes de la replicación RSF 32. Este sistema co-expresión se utilizó con éxito para producir enE. coli hidrogenasa soluble funcionalmente activa I de Pyrococcus furiosus 32. Para ampliar nuestro sistema binario, se construyó un nuevo vector de expresión, pFINE, que contiene el origen de la replicación de pSC101, un casete de resistencia a neomicina, y los elementos reguladores lac (Figura 4B). Este plásmido contiene el mismo poliligador presente en los vectores pBAD y PGOOD, facilitando así gen yendo y viniendo entre los 3 componentes del sistema de co-expresión. Aunque pFINE es un plásmido de bajo número de copias, su estabilidad se encontró que era satisfactoria cuando se prueba en medio rico. Estamos comprometidos actualmente en una mayor expansión de nuestro sistema de co-expresión ternaria. Para este objetivo, se construyó un derivado pBAD contiene un casete cloranfenicol-resistencia, y estamos en el camino para cambiar el origen de replicación ColE1 con uno compatible con ColE1, p15A y pSC101. De hecho, es nuestra opinión de que el uso de múltiples plásmidos en E. sola coli células represiente una poderosa herramienta para desafiar la expresión in vivo de los complejos de proteínas compuestas por una multitud de diferentes subunidades.
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Acknowledgments
El permiso de Springer y Elsevier reimprimir figuras se reconoce en gran medida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
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