Introduction
L'introduction des technologies de surexpression soit stimulé les études biochimiques du faible nombre de copies enzymes et la production industrielle de protéines pharmacologiquement actives (par exemple, l'insuline). Depuis l'avènement de ces technologies, des progrès significatifs ont été réalisés pour augmenter le rendement et la qualité des protéines recombinantes. En outre, 1,2 procaryotes et eucaryotes 3 systèmes de surexpression ont été développés au cours des années, offrant des alternatives utiles à la "cheval de travail" de la biotechnologie de la protéine, ce est à dire, Escherichia coli. En particulier, la disponibilité des plates-formes alternatives à E. coli conduit à la production de peptides ou de protéines portant des modifications post-traductionnelles de recombinaison. Toutefois, il convient de mentionner que E. coli représente encore l'organisme de choix pour la production de protéines recombinantes. Cela est dû à plusieurs facteurs, parmi lesquels peuvent être les plus pertinentsconsidéré: i) la disponibilité d'un certain nombre de systèmes de surexpression (vecteurs d'expression et souches) pour E. coli 1,2; ii) fois le court de production, et des rendements élevés de la biomasse, de E. coli dans une variété de médias riche et synthétique; iii) la manipulation facile, soit à la substance biochimique et génétique au niveau de ce micro-organisme; iv) l'isolement de souches capables de produire des protéines toxiques 4; v) la construction de souches présentant induction homogène au niveau de la population 5,6. En outre, il a été récemment montré que des systèmes d'expression appropriés pour la production dans E. coli de protéines modifications post-traductionnelles peut être conçu et construit deux.
À l'heure actuelle, surexpression de la protéine est principalement utilisé pour obtenir des protéines monomères ou homo-oligomères, dont hypersynthése peut être réalisée avec un seul gène cloné dans un plasmide approprié. Toutefois, l'attention a récemment étéversée à la construction de E. systèmes protéines co-expression coli, contestant la production, in vivo, de complexes hétéro-oligomères 2. Fait intéressant, les premières expériences de protéines co-expression adressé à l'Assemblée inter-espèces de grands et de petits sous-unités de carboxylase cyanobactéries ribulose-1,5-bisphosphate / oxygénase 7,8, et l'association des formes tronquées et pleine longueur du VIH-1 transcriptase inverse neuf. Ces études pionnières ont démontré que la protéine co-expression représente une alternative puissante et traditionnelles dans la reconstitution in vitro. En outre, la protéine co-expression dans E. coli a été utilisée pour produire différentes protéines portant des modifications post-traductionnelles 2, pour obtenir des protéines contenant des acides aminés non naturels 2, et d'augmenter le rendement des protéines membranaires surexprimés 2. En outre, le potentiel de la protéine co-expression en tant qu'outil de conférer à E. coli concurrencence dans la sécrétion de protéines est sous enquête active 2.
Deux principales stratégies de protéines co-expression dans E. coli peut être poursuivi: i) l'utilisation d'un seul plasmide d'accueillir les différents gènes pour être surexprimé; ii) l'utilisation de plusieurs plasmides dans des cellules individuelles pour co-exprimer les protéines cibles. Dans le premier cas, les critères pour le choix du plasmide ne diffèrent pas de ceux des expériences traditionnelles protéines de surexpression simples, bien que particulier des plasmides contenant des éléments promoteur / opérateur en tandem ont été construits pour la co-expression 10. Cette première approche est donc très simple. Toutefois, il convient de mentionner que l'utilisation d'un seul plasmide de co-exprimer des protéines différentes se heurte à deux difficultés majeures: i) la masse moléculaire du vecteur augmente avec le nombre de gènes hébergés, ce qui limite le nombre de protéines co-exprimées; ii) lorsque plusieurs gènes sont clones sous le contrôle d'un promoteur unique, la polarité peut dimienvoyer l'expression des gènes à partir du promoteur distal. L'utilisation de plasmides double ou multiple unique dans E. cellules coli doit accomplir la compatibilité des vecteurs de choix, donc imposer des contraintes aux combinaisons admissibles de plasmides. Toutefois, cette deuxième stratégie de co-expression comporte l'avantage de contenir la masse moléculaire de vecteurs, et limite la polarité. Nous avons récemment construit un système de co-expression de protéines conçu pour faciliter le mouvement alternatif de gènes entre les plasmides co-expression 11. En particulier, nous avons construit la série de vecteurs de pgood, les éléments pertinents qui sont: i) une origine de p15A de réplication, pour assurer la compatibilité des plasmides pgood avec les vecteurs commerciaux contenant l'origine ColE1 (par exemple, la série pBAD 12); ii) une cassette de résistance à la tetracycline; iii) la présence du lac -derived éléments de régulation, ce est à dire, le promoteur-opérateur (O 1) En couple et la LACI q gène. Utiliser un couple pBAD-pgood appropriée, nous avons pu surexpriment le noyau catalytique de E. coli DNA polymerase III, composé de trois sous-unités différentes, ce est-α (la polymerase, ε (3'-5'-3 '5)' exonucléase) et θ (ε stabilisant) 13. En particulier, nous avons démontré que la co-expression du complexe de αεθ était strictement dépendante de l'ajout de la E. coli milieu de culture à la fois de l'IPTG et arabinose, le déclenchement et la surexpression de pgood pBAD, respectivement (figure 1A).
Dans le présent rapport, nous illustrons comment des protéines co-expression peut résoudre efficacement les difficultés liées à la faible solubilité d'une protéine sous-unité complexe. En outre, nous montrons comment dans des tests de complémentation de protéines in vivo peut être effectuée, et nous rapportons enfin sur l'utilisation de protéines co-expression de régler la fréquence de mutation dans E. coli. Dans ce but, nous avons utilisé les couples pgood-PBAD appropriés pour illustrer des exemples pertinents de chaque étude de cas.
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Protocol
1. Isolement de E. coli co-transformants
- Préparer des cellules électro-compétentes du E. appropriée coli souche à transformer. Transfert à 1 ml de milieu LB (tryptone, extrait de levure, NaCl à 10, 5 et 10 g / l, respectivement) d'une seule colonie de la souche de choix, et incuber à 37 ° C dans des conditions de secousse, 180 tours par minute. Diluer la pré-culture 1: 500 dans 25 ml de milieu LB frais et on incube la culture à 37 ° C.
- Au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 minutes), et remettre en suspension le culot dans 10%, v / v glacée eau-glycérol stérile dans la moitié du volume de la culture d'origine. Répétez cette étape 4 fois, de réduire de moitié chaque fois le volume de la remise en suspension. Enfin, remettre le culot dans du glycérol / eau et diviser la suspension des cellules dans 50 aliquotes. Stocker les aliquots à -80 ° C jusqu'à 6 mois.
- Dissoudre le plasmide désiré dans l'eau stérile supplémenté avec 0,5 mM d'EDTA. Thaw sur ice une aliquote de cellules électro-compétentes et mélanger avec une quantité appropriée (2,5-5 ng) du vecteur. Verser le mélange dans une cuvette de 0,1 cm convient pour l'électroporation, et appliquer 1,8 kV.
- Transférer immédiatement les cellules électroporées dans 1 ml de milieu SOC (milieu LB complété avec 0,2% p / v de glucose, 10 mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl), incuber pendant 1 h sous agitation, et enfin le transfert des aliquotes de 100 ul à des boîtes de Pétri contenant agar LB avec l'antibiotique approprié. Incuber O / N à 37 ° C.
- Purifier les transformants en stries des colonies isolées sur des boîtes de Pétri.
- Préparer des cellules électro-compétentes des transformants primaires et répétez les étapes 1.1 à 1.5 pour transformer avec d'autres plasmides.
- Préparer des stocks de glycerol des co-transformants. Transfert d'une seule colonie dans LB supplémenté avec les antibiotiques appropriés, incuber à 37 ° C sous agitation, et au journal phase (0,6 OD) centrifuger la suspension de cellules à 5000 g pendant 20 min. Resuspend le culot dans du milieu LB contenant les antibiotiques-support 15% v / v glycérol. Répartir en aliquotes et stocker à - 80 ° C.
2. Co-expression des sous-unités α et ε de E. coli DNA polymerase III
- Transfert avec une boucle stérile une petite quantité du stock de glycérol de souche appropriée (par exemple, TOP10 / pgood-ε243 et TOP10 / pgood-ε243-θ / pBADα1160, voir la figure 1) dans une boîte de Pétri contenant le milieu LB et des antibiotiques. Laissez le suspension de cellules sec sur la boîte de Pétri, et série les cellules gouttelettes. Incuber à 37 ° CO / N.
- Transfert, en utilisant un cure-dents stérile, une colonie unique de 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber 8 h à 37 ° C. Diluer la pré-culture 1: 500 dans du milieu frais et on incube à 30 ° C pendant 15 heures.
- Ajouter IPTG, l'arabinose, ou l'arabinose et IPTG, 1 mM chacun. Incuber à 30 ° C pendant 2,5 heures. Recueillir les cellules, et de stocker les granulés à -20 ° C.
- Décongeler les pastilles sur de la glace et remettre en suspension dans du tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 2,5 mM de dithiothréitol, du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM (PMSF), pH 8). Homogénéiser doucement la suspension de cellules avec un potier de verre à froid.
- Soniquer à 15 W pendant 15 secondes, suivie de 15 sec temps de refroidissement (4 cycles).
- Centrifuger les extraits de protéines totales à 10 000 xg pendant 20 min, à 4 ° C pour récupérer la fraction soluble.
- Analyse par SDS-PAGE (12,5% d'acrylamide) des fractions aliquotes de chaque extrait protéique soluble. Dans ce but, transférer 20 pi de chaque extrait protéique soluble dans des tubes Eppendorf contenant 60 ul de H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) SDS, 50% (v / v) de glycerol, 0,25% (p / v) de bleu de bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h.
3. Co-expression de α sous-unité de Deinococradiodurans cus ADN polymérase III et ε sous-unité de E. coli DNA polymerase III
- Préparer un pré-culture de l'E. coli souche TOP10 / Dr pBAD-α / pgood-ε243 dans 1 ml de milieu LB-ampicilline tétracycline et incuber 8 h à 37 ° C. Diluer 1: 1000 dans un milieu frais et incuber O / N à 37 ° C.
- Diluer 1: 100 dans 200 ml de milieu frais, incuber à 37 ° C pendant 3 heures, puis induire pendant 3 heures avec l'arabinose et IPTG, 1 mM de chacun. Récolter les cellules, et de stocker le culot à -20 ° C.
- Reprendre le culot dans 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogénéiser et perturber les cellules comme décrit dans 2.4 et 2.5.
- Centrifuger immédiatement les cellules lysat à 10 000 g pendant 20 min. Jeter le culot. Filtrer le surnageant avec un entonnoir Büchner équipé avec trois couches de papier filtre. Appliquer une dépression douce. Pour éviter un excès de mousse, garder le vide erlenmeyer sur la glace lors de la filtration.
- Déterminer la concentration en protéine selon Bradford 14.
4. Filtration sur gel Une Chromatographie
- Equilibrer un 16x70 chemise d'eau (200) colonne de filtration sur gel avec 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, pH 8. charge sur la colonne de l'extrait protéique soluble. Pour une résolution optimale, utiliser une boucle échantillon de 1 ml. Effectuer la chromatographie à 0,6 ml / min. Maintenir la température de la colonne à 4 ° C tout au long.
- Récupérer 0,9 ml des fractions et de les analyser par SDS-PAGE. Transférer 20 pl de chaque fraction en rapport avec des tubes Eppendorf contenant 60 ul de H2O et 20 ul de tampon de chargement (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM de β-mercaptoéthanol, 10% (p / v) de SDS, 50% ( v / v) de glycérol, 0,25% (p / v) bleu bromophénol) et faire bouillir pendant 5 min. Charge 18 pi de chaque échantillon et effectuer la électrophorèse à 140 V pendant environ 1,5 h.
- Déterminer l'exonucléase 3'-5 et de l'activité d'ADN polymérase de chaque fraction dans 96 nousll microplaques. Doser l'activité d'exonucléase en utilisant la thymidine 5'-monophosphate ester de p-nitrophényle (p NP-TMP) comme substrat 15. Estimer une activité de polymerase d'ADN en utilisant le PPX (Pyrophosphatase, la purine nucléoside phosphorylase, la xanthine oxydase) enzyme couplé à essai 16 et de 2- (4-iodo-phényl) -3- (4-nitrophényl) de chlorure -5-phényl-2H-tétrazolium (INT) comme accepteur 16 d'électrons.
5. Mutation analyse des populations co-exprimant le type sauvage ε sous-unité de E. coli ADN polymérase III et l'mutagènes εD12A Variant
- Transférer une seule colonie de E. coli TOP10 contenant le pBAD-ε et les pGOOD1-εD12A 11 vecteurs à 1 ml de milieu LB-antibiotiques. Incuber O / N à 37 ° C.
- Diluer la pré-culture 1: 250 dans des flacons contenant du milieu frais 3 (10 ml), ajouter les inducteurs appropriés (arabinose, de l'IPTG, et de l'arabinose ou de l'IPTG 1 mM chacun) et incuber à 37 ° Cpendant 8 heures. Préparation de cultures parallèles non induit.
- Recueillir des aliquotes de 1 ml, puis diluer 1: 500 dans de nouveaux flacons contenant du milieu frais (10 ml) supplémenté ou non avec les inducteurs appropriés. Incuber O / N à 37 ° C.
- Répétez les étapes 5.2 et 5.3 et de recueillir des aliquotes de 1 ml.
- Déterminer le nombre de générations est produit dans chaque culture. Transfert sur des plaques LB, 100 pi de dilutions en série appropriées d'inoculum et de la culture. Incuber O / N à 37 ° C. Compter les colonies sur des plaques LB, et calculer le logarithme du nombre de cellules présentes dans l'inoculum (log I) et dans la culture à la fin de la croissance (log C). Pour déterminer le nombre de générations, utiliser la formule: (log C - log I) /0.301.
- Centrifuger à 5000 xg pendant 20 min et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM de NaCl. Pour perméabiliser les cellules, ajouter 2 à 3 gouttes de chloroforme et vortex pendant 20 s.
- Déterminer la β-glucosidase de chaque aliquote dans une microplaque à 96 puits, en utilisant du p-nitrophényl-β-D-glucopyranoside (PNPGluc) comme substrat. Ajouter à chaque puits 100 pi de cellules perméabilisées et 100 pi de substrat (16 mg / ml solution mère dans H 2 O). Prenez soin d'éviter les bulles d'air dans les puits. Lire l'absorbance à 420 nm, en utilisant un lecteur de microplaques et le filtre approprié.
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Representative Results
La sous-unité ε de E. coli l'ADN polymérase III se compose de 243 acides aminés et dispose d'une faible solubilité 17,18, à moins que les résidus 187 à 243 sont supprimés 17. Cependant, nous avons précédemment montré 11 que la co-expression de α-métrages, ε, et sous-unités θ donne soluble ADN polymérase III noyau catalytique (figure 1). En particulier, en utilisant le système pBAD-pgood co-expression, nous avons démontré que: i) la surexpression de sous-unités α et ε peut être contrôlé de façon indépendante par IPTG et arabinose, respectivement (figure 1A); ii) la sous-unité de longueur totale ε peut être détectée dans des extraits protéiques solubles isolés à partir de E. coli surexprimant les cellules α, ε, et θ et soumis à une filtration sur gel (figure 1B). Dans ce cas, l'activité d'exonucléase a été distribué dans trois grands pics (figure 1B, cercles pleins), et le pic centré à fraction 23 a été montré pour contenir le cœur catalytique αεθ (figures 1C et 1D). La stabilité de ε est fortement augmentée lors de la liaison α et θ. Lorsque nous avons précédemment surexprimé pleine longueur ε dans E. coli, une faible quantité de ε libre a été détectée par western blot en protéines solubles extrait 19 (figure 2A). Il est intéressant de noter que, dans les mêmes conditions, nous avons toujours détecté des quantités plus élevées de C libre-ter formes tronquées de ε (ε-234, ε-228, ε-213, ou ε-186), parmi lesquels ε-186 une meilleure performance 19 (figure 2A). Nous ne avons montrons également que la protéolyse de ε domaine C-terminal est empêché par la liaison à sous-unités α et θ 19. L'effet, le cas échéant, de co-expression de la solubilité de ε peut être facilement testée. Comme indiqué sur la figure 2B, des extraits protéiques solubles isolés à partir de cellules surexprimantα, ε, α ou ε et peuvent être analysés par SDS-PAGE, et idéalement par rapport à des extraits de protéines totales. Dans ce cas, l'analyse par électrophorèse indique que, lorsque surexprimé seul, les caractéristiques de sous-unité ε faible solubilité (comparer les pistes 1 et 2), alors que la co-expression de α augmente considérablement la concentration de l'ε dans les extraits de protéines solubles (comparer les pistes 3 et 4 ).
La co-expression peut également être utilisé pour effectuer des tests de complémentation inter-espèces. En conséquence, nous avons pensé qu'il pourrait être intéressant d'évaluer l'interaction entre les sous-unités appartenant aux mécanismes de réplication de Gram + et Gram -. Bactéries Deinococcus radiodurans est une bactérie Gram +, avec une grande sous-unité α (1335 acides aminés, 150 kDa) et une sous-unité ε putatif contenant 197 acides aminés. Il est intéressant de D. la sous-unité de radiodurans est dépourvue du domaine C-terminal présent dans la E. coli E. coli et D. les sous-unités de radiodurans sont égales à 29% et 59%, respectivement (compte tenu de la région 1-178, D. radiodurans coordonne). Pour doser la compétence de D. radiodurans polymérase III sous-unité α (α Dr) dans la liaison de E. la sous-unité de l'coli, on a clone dans le vecteur pBAD un gène synthétique codant pour α Dr et nous avons co-transformé E. coli avec pBAD-α et Dr pgood-ε. L'addition simultanée d'IPTG et arabinose au milieu de culture déclenche la co-expression de α et ε Dr (figure 3A). L'association de ces deux protéines a été testée par filtration sur gel. Les cellules co-exprimant l'ADN polymérase III α et ε Dr sous-unités ont été recueillies par centrifugation (5000 xg, 20 min), en suspension dans un tampon de lyse, perturbé par sonication, et les protéines solubles ont été immédiatsly chargée sur une colonne Superdex 200 (figure 3B). Comme le montre la figure 3C, où les fractions recueillies ont été soumises à une exonucléase 3'-5 'de l'ADN polymerase et à des essais d'activité, les pics d'activité ont été détectés à des positions décalées de façon significative, ce qui suggère que α ne est pas compétent Docteur en liaison E. la sous-unité de coli. Cela a été confirmé lorsque des aliquotes de fractions 32, 36 et 52 ont été concentrées et analysées par SDS-PAGE. 36 La fraction se est révélé contenir le Dr α et d'être dépourvus de E. la sous-unité de l'coli, tandis que la fraction contenait 52 E. coli ε mais était dépourvu de α Dr (Figure 3D).
fidélité de réplication repose essentiellement sur la capacité des ADN polymerases à discriminer les appariements de bases erronés pendant l'extension de l'ADN. Néanmoins, désoxynucléotides incompatibles peuvent être incorporés à 10 -4 fréquence 20, et l'actiondes 3'-5 'exonucléases est essentiel de relire le brin d'ADN nouvellement synthétisé. En outre, il a été estimé que cette action d'édition d'ADN augmente fidélité de la réplication par trois ordres de grandeur 20. En conséquence, des souches de mutation peuvent être construits par l'altération de l'ADN relecture, par exemple, par expression conditionnelle, une variante de E. mutagène la sous-unité de l'ADN polymerase III coli. Ceci peut être obtenu construction d'une variante de ε compétente dans la liaison α, mais dépourvue de son activité de correction d'épreuves, et le contrôle de la production de ε mutagène par des systèmes d'expression appropriés. En utilisant cette stratégie, il a été montré que E. coli fréquence de mutation augmente dans des conditions induisant variantes mutagènes de ε 11,21. Cependant, aucun réglage fin de la fréquence de mutation a été effectuée par ce moyen. Co-expression de la protéine peut être utilisée pour obtenir un meilleur contrôle de souches de mutation. Dans ce but, nous avons co-transformé E. coli avecpBAD-ε et pGOOD1-εD12A, afin d'induire l'expression de type sauvage et la variante de D12A mutagène de ε avec arabinose et IPTG, respectivement. Comme un test phénotypique, nous avons déterminé l'apparition de l'activité β-glucosidase, qui est cryptique (BGL -) à l'état sauvage de type E. coli 22,23. Mutants spontanés capables d'utiliser β-glucosides comme sources de carbone (BGL +) peuvent être enrichis ou isolés en utilisant 23 liquides ou solides médias 24, respectivement. Lorsque les cellules ont été induites pour exprimer la D12A variante mutagène, l'activité β-glucosidase a été acquise en ca. 20 générations (figure 4A). Il convient de noter que la même tendance a été observée dans les cellules non induites (figure 4A), probablement parce que le contrôle de transcription exercée sur pGOOD1 est plutôt de fuite 11. Toutefois, lorsque la sous-unité ε de type sauvage a été induite, seul ou en combinaison avec la variante de D12A, β-glucosidasel'activité a été acquise par E. coli à des niveaux modérés (figure 4A). L'activité β-glucosidase de BGL + mutants a été signalé pour se situer entre 3 et 40 pM / min 23. Le niveau déterminé ici à E. coli populations soumises à l'expression de εD12A est beaucoup plus faible, mais il devrait être considéré que nous ne avons pas essayé d'isoler Bgl + mutants sur un milieu solide.
Figure 1. Co-expression de E. coli l'ADN polymerase III de noyau catalytique. (A) SDS-PAGE des protéines totales extraites à partir de E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / pgood-ε243 cultivé en l'absence d'inducteurs, en présence d'arabinose que, d'IPTG seulement, ou dans un milieu supplémenté avec IPTG et arabinose à la fois (pistes 1-4, respectivement). (B) Absorbance (cercles vides) et l'activité d'exonucléase (cercles pleins) de fractions isolées en soumettant à une filtration sur gel des protéines solubles extraites de E. coli TOP10 surexprimant α, ε, θ et sous-unités de E. coli ADN Pol-III. (C) SDS-PAGE de fractions 6, 12, 23, 31, et 41 (pistes 1 à 5, respectivement) ont rapporté dans le panneau B. (D) SDS-PAGE d'une fraction aliquote de concentré 23, dont l'activité d'exonucléase et électrophorétique motif sont signalés dans les panneaux B et C, respectivement. Reproduit avec la permission de Biotechnology Letters, 33, Conte et al:. "PGOODs: nouveaux plasmides pour la co-expression de protéines dans Escherichia coli"., 1815-1821 (2011) Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. La protéolyse de E. coli l'ADN polymérase III ε sous-unité. (A) La dégradation de monomère tel que révélé par Western blot de protéines extraites de E. coli TOP10 surexprimant pleine longueur ou des formes tronquées de ε; pointes de flèches indiquent la position des 25 et 19 kDa marqueurs moléculaires pré-colorées. Reproduit avec la permission d'Elsevier de Biochimica et Biophysica Acta protéines et en protéomique, 1794, Bressanin et al. "Protéolyse de la sous-unité de relecture contrôle l'ensemble de la polymérase III noyau catalytique Escherichia coli l'ADN", 1606-1615 (2009). (B) Co-expression des sous-unités α et ε de E. coli l'ADN polymerase III de noyau catalytique. SDS-PAGE sur un total de (pistes 1 et 3) et solubles (lignes 2 et 4) un supplément de protéinescts isolés à partir de cellules surexprimant la sous-unité ε (pistes 1 et 2), ou des sous-unités α et ε (pistes 3 et 4).
Figure 3. La co-expression de l'ADN polymérase III α et ε sous-unités de Deinococcus radiodurans et Escherichia coli, respectivement. (A) SDS-PAGE des extraits de protéines totales isolées à partir de cellules non induites (piste 1), ou induites pour surexprimer α Dr, ε, α ou ε et Dr (pistes 2-4, respectivement). (B) Chromatogramme (cercles vides, axe gauche) et la concentration en protéine des fractions (cercles pleins, axe de droite) éluées former une colonne de filtration sur gel (Superdex 200) chargé avec des protéines solubles extraites de E. coli surexprimant une α Drnd de les sous-unités. (C) Relecture (cercles vides, axe de gauche) et de l'ADN polymérase (cercles pleins, axe de droite) les activités des fractions signalés dans le Panneau de B. (D) SDS-PAGE des fractions aliquotes concentrées de 32, 36, et 52. Se il vous plaît cliquer sur ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. fréquence de mutation de E. cellules coli soumis ou non de co-expression de type sauvage et la variante D12A mutagène de la sous-unité de l'ADN polymérase III. La carte de la nouvelle Pfine plasmide est également indiquée. (A) l'activité β-glucosidase de E. coli TOP10 pas induite (Pas Ind) ou soumis à la surexpression de type sauvage sous-unité ε (Ara), la variante D12A mutagène (IPTG), ou les deux sous-unités de ε-type sauvage et D12A (Ara + IPTG). L'activité β-glucosidase est rapporté en fonction de générations. (B) Plan du nouveau vecteur d'expression Pfine. Le site de clonage multiple (MCS) de ce plasmide est identique à celles présentes dans les vecteurs pBAD et pgood compatibles, laissant-vient facile de gènes entre eux.
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Discussion
Les protéines peuvent être intrinsèquement désordonnée, avec des régions dont la structure tertiaire ne est pas restreinte à un nombre limité de conformations 25. Ces protéines désordonnées sont généralement sujettes à l'agrégation 25, et de leur isolement et la caractérisation pourraient représenter une tâche difficile. La sous-unité ε de E. coli DNA polymerase III possède deux domaines distincts 26,27, à savoir: i) le domaine N-ter, portant la 'activité 3'-5' exonucléase, et compétent en la sous-unité de liaison de θ; ii) le domaine C-ter, responsable de la liaison à l'α (polymerase) sous-unité. Le domaine C-ter de ε est connu pour conférer une solubilité médiocre de cette protéine, la promotion de son agrégation. Il a été en effet démontré que ε-186, une forme tronquée de la protéine dépourvue du domaine C-ter, est soluble, et peut être purifié avec des rendements élevés 17. Toutefois, lorsque l'interaction avec de ε α est étudié pour être quantitativement(Par exemple, pour déterminer la KD du complexe αε), la purification de pleine longueur ε est nécessaire, ce qui implique une tâche difficile biochimique. Dans ce cadre, la protéine co-expression fournit une estimation qualitative de la liaison d'α ε à. Nous avons montré que des rendements élevés du complexe αεθ peuvent être obtenus in vivo par co-expression (figure 1), sans passer par la faible solubilité de la sous-unité ε. Remarquablement, la purification du complexe d'αεθ surexprimé a été rapporté 28,29. La stratégie de co-expression peut également être utilisé pour tester si oui ou non l'insertion des mutations spécifiques au site dans l'un des partenaires d'interaction nuit à la formation du complexe. En conséquence, la protéine co-expression est un outil commode et rapide pour effectuer des tests qualitatifs de l'interaction protéine-protéine. Il convient également de noter que le système de co-expression se appuie sur deux différents inducteurs, ce est-arabinose et IPTG. Par conséquent, des contrôles appropriés peuvent être facilement effectuées lors de l'essai de la formation d'un complexe de protéine, par exemple, en omettant une inducteur dans le milieu de croissance bactérienne (figure 1A).
Nous avons présenté ici une procédure optimisé pour la co-expression de la sous-unités α et ε de E. coli DNA polymerase III. Lorsque ce protocole a été conçu et testé, les paramètres suivants ont été identifiés comme critiques pour le succès des expériences de co-expression: i) la température à laquelle est effectuée l'induction; ii) la durée de temps de l'induction; iii) la concentration de l'inducteur (s). En particulier, nous ne avons pu obtenir soluble αεθ complexe 11 à partir de cellules induites à 37 ° C, indépendamment du temps d'induction. Nous proposons donc de tester différentes températures pendant l'étape d'induction, et pour vérifier la surexpression de protéines en fonction du temps. En outre, l'évaluation parallèle de la co-expression dans différents E. coli souches peuvent être utiles lorsque des rendements modérés en regard des protéines cibles.
Nous avons rapporté ici une expérience représentative réalisée pour tester la liaison de protéines à partir de différentes espèces, et nous avons montré que la protéine co-expression est utile pour tester rapidement l'association de deux protéines hétérologues dans un complexe fonctionnel hybride. Chromatographie de filtration sur gel a été utilisé ici pour évaluer la formation du complexe (Figure 3). Cependant, l'insertion d'un marqueur approprié pour l'un des partenaires d'interaction pourrait faciliter cette évaluation, permettant l'utilisation de méthodes de capture d'affinité. Pour éviter toute interférence de l'étiquette avec les interactions protéine-protéine, le gène codant pour l'un des partenaires d'interaction pourrait être inséré en parallèle dans pBAD / His et pBAD / Myc-His vecteurs, conférant respectivement un motif de hexahistidine à l'extrémité N- et C -terminale de la protéine cible.
E. coli Mutatosouches r disposent fréquences de mutation plus élevés que leurs homologues de type sauvage. souches de mutation sont d'un intérêt 30 dans la biotechnologie, par exemple, d'évoluer rapidement une souche cible, vers de nouveaux phénotypes souhaités,. Nous avons fourni ici la preuve que co-exprimant le type sauvage et une sous-unité ε mutagène de E. coli DNA polymerase III, la fréquence de mutation de l'hôte bactérien peut être réglé avec la commodité suffisante. Pour améliorer encore cette technologie, des vecteurs d'expression étroitement réglementés sont nécessaires pour réprimer autant que possible l'expression de la variante de D12A fortement mutagène de la sous-unité ε. En particulier, il serait intéressant de tester la fréquence de mutation dans E. coli transformée avec le pBAD-εD12A et pGOOD1-ε, ce est à dire, la configuration alternative à celle présentée ici. Les vecteurs PBAD sont en effet connues pour être étroitement régulée 12, et cette caractéristique pourrait aider à garder la concentration basale de εD12Aà de faibles niveaux.
Les exemples de protéines co-expression présentés ici témoignent les multiples facettes de cette technique. Cependant, il est important de noter que l'utilisation d'une pluralité de plasmides compatibles unique dans E. cellules coli peuvent élargir considérablement les défis qui peuvent être prises par la protéine co-expression. Au cours des dernières années, un travail intense a été consacrée à élargir le répertoire de plasmides compatibles pour être utilisés pour la protéine co-expression. En particulier, un système ternaire en se appuyant sur des plasmides portant des origines compatibles ColE1, P15A, pSC101 et de replication a été utilisé pour co-exprimer soit des protéines 31 bactériennes et de mammifères. Récemment, un système de co-expression quaternaire a été signalé. Dans ce cas, 13 gènes hétérologues ont été co-exprimées dans E. coli co-transformé avec quatre vecteurs d'expression compatibles, contenant le ColE1, p15A, CloDF13 et origines de RSF de réplication 32. Ce système de co-expression a été utilisée avec succès pour produireE. coli hydrogénase soluble fonctionnellement actif I de Pyrococcus furiosus 32. Pour agrandir notre système binaire, nous avons construit un nouveau vecteur d'expression, Pfine, contenant l'origine de réplication pSC101, une cassette résistance à la néomycine, et les éléments de régulation de lac (figure 4B). Ce plasmide contient le même lieur multisite présent dans pBAD et pgood vecteurs, ce qui facilite la navette gène parmi les trois composantes du système de co-expression. Bien Pfine est un faible nombre de copies plasmide, sa stabilité a été jugée satisfaisante lors des essais en milieu riche. Nous sommes actuellement engagés dans l'expansion de notre système de co-expression ternaire. Dans ce but, nous avons construit un dérivé de pBAD contenant une cassette de résistance au chloramphénicol, et nous sommes sur le chemin d'échanger l'origine ColE1 de réplication avec une compatible avec ColE1, p15A et pSC101. Ce est en effet notre avis que l'utilisation de plusieurs plasmides en simple E. coli cellules repsente un outil puissant pour contester l'expression in vivo des complexes de protéines composées d'une multitude de différentes sous-unités.
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Acknowledgments
L'autorisation par Springer et Elsevier réimprimer chiffres est grandement reconnu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
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