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Biology

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in Published: February 5, 2015 doi: 10.3791/52431
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

Introduction

Die Einführung der Überexpression Technologien erhöht entweder die biochemische Untersuchungen von niedriger Kopienzahl Enzyme und die industrielle Herstellung von pharmakologisch aktiven Proteinen (zB Insulin). Seit der Einführung dieser Technologien wurden erhebliche Fortschritte erzielt worden, um die Ausbeute und Qualität von rekombinanten Proteinen zu erhöhen. Darüber hinaus wurden 1,2 prokaryotischen und eukaryotischen 3 Überexpression Systeme über die Jahre entwickelt und bietet sinnvolle Alternativen zu dem "Arbeitspferd" der Proteinbiotechnologie, also Escherichia coli. Insbesondere die Verfügbarkeit von alternativen Plattformen E. coli führte zur Produktion von rekombinanten Peptiden oder Proteinen, die post-translationale Modifikationen. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass E. coli stellt noch immer den Organismus der Wahl für die Produktion rekombinanter Proteine. Dies ist auf mehrere Faktoren, von denen die relevantesten sein kannberücksichtigt: i) die Verfügbarkeit von einer ganzen Reihe von Überexpression Systeme (Expressionsvektoren und Stämme) für E. coli 1,2; ii) die kurze Generationszeiten und hohe Biomasseerträge, der E. coli in einer Vielzahl von reichen und synthetische Medien; iii) die leichte Manipulation entweder auf biochemischer und genetischer Ebene dieses Mikroorganismus; iv) die Isolierung der Stämme, die die Produktion von toxischen Proteinen 4; v) die Konstruktion von Stämmen mit homogenen Induktion auf Bevölkerungsebene 5,6. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass Expressionssysteme für die Produktion in E. coli von posttranslational modifizierten Proteinen entwickelt werden können, und 2 aufgebaut.

Gegenwärtig wird die Proteinexpression vor allem zur monomeren oder homo-oligomere Proteine, deren hypersynthesis kann mit einem einzigen Gen in ein geeignetes Plasmid kloniert geführt werden erhalten. Doch vor kurzem war die Aufmerksamkeitfür den Bau von E. bezahlt coli-Protein co-Expressionssysteme, gegen die Produktion, in vivo, der Hetero oligomeren Komplexen 2. Interessanterweise frühen Experimenten von Protein Co-Expression adressiert die Interspezies-Montage von großen und kleinen Untereinheiten der Cyanobakterien Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase / Oxygenase 7,8, und die Assoziation von abgeschnitten und in voller Länge Formen von HIV-1- Reverse-Transkriptase-9. Diese bahnbrechenden Studien gezeigt, dass Protein Co-Expression stellt eine leistungsstarke Alternative zu herkömmlichen in vitro Rekonstitution. Zusätzlich Protein Co-Expression in E. coli wurde verwendet, um verschiedene Proteine ​​tragen post-translationale Modifikationen 2 zu produzieren, um Proteine, die unnatürliche Aminosäuren 2 zu erhalten, und die Ausbeute an überexprimiert Membranproteine ​​2 zu erhöhen. Ferner wird das Potential der Protein Coexpression als Werkzeug zum E. verleihen coli Wettbewerbnce in Proteinsekretion ist aktiv untersucht 2.

Zwei Hauptstrategien von Protein Co-Expression in E. coli können verfolgt werden: i) die Verwendung eines einzigen Plasmid, um die verschiedenen Gene Gastgeber zu überexprimiert wird; ii) die Verwendung von mehreren Plasmiden in einzelnen Zellen zu co-exprimieren, die Zielproteine. Im ersten Fall müssen die Kriterien für die Auswahl von Plasmid nicht von denen der traditionellen einzelnen Proteinexpression Experimente unterscheiden, auch wenn insbesondere Plasmide, die Tandem-Promotor / Operator-Elemente wurden für die Co-Expression 10 aufgebaut. Dieser erste Ansatz ist daher ganz einfach. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass die Verwendung von einem einzigen Plasmid zu co-exprimieren verschiedene Proteine ​​vor zwei Hauptschwierigkeiten: i) die Molekularmasse des Vektors mit der Anzahl von bereitgestellten Gene, wodurch die Anzahl der co-exprimierten Proteine; ii) wenn mehrere Gene unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors kloniert, können Polarität Verklee die Expression der Gene, die distal von dem Promotor. Die Verwendung von Doppel- oder Mehrfach Plasmide in Einzel E. coli-Zellen hat, um die Kompatibilität der Vektoren der Wahl zu erreichen, daher Ohne Zwang auf die förderfähigen Kombinationen von Plasmiden. Diese zweite Co-Expression Strategie verfügt jedoch den Vorteil, das die Molekülmasse von Vektoren und begrenzt Polarität. Wir haben vor kurzem gebaut ein Protein Co-Expressionssystem entwickelt, um die Pendel von Genen zwischen den Co-Expressionsplasmide 11 zu erleichtern. Insbesondere konstruierten wir das PGOOD Vektoren Serie, die relevanten Merkmale davon sind: i) einem p15A-Replikationsursprung, um die Kompatibilität der PGOOD Plasmide mit den kommerziellen Vektoren, die den ColE1 Ursprung (zB den pBAD-Serie 12) bereitzustellen; ii) ein Tetracyclin-Resistenz-Kassette; iii) die Anwesenheit von lac abgeleitete regulatorische Elemente, dh der Promotor-Operator (O 1) Paar und das lacI q Gen. Unter Verwendung eines geeigneten pBAD-PGOOD Paar, waren wir in der Lage, den katalytischen Kern von E. überexprimieren coli-DNA-Polymerase III, die aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, das heißt, α (der 5'-3'-Polymerase), ε (der 3'-5'-Exonuklease) und θ (Stabilisierungs ε) 13. Insbesondere haben wir gezeigt, dass die Co-Expression des αεθ Komplex war streng abhängig von der zusätzlich zu dem E. coli-Kulturmedium sowohl IPTG und Arabinose, Auslösung Expression von PGOOD und pBAD, bzw. (1A).

In diesem Bericht zeigen wir, wie Protein Co-Expression effizient Schwierigkeiten der schlechten Löslichkeit von einem Proteinkomplex Untereinheit verbunden zu lösen. Darüber hinaus zeigen wir, wie in vivo Protein Ergänzung Tests durchgeführt werden, und wir endlich über die Verwendung von Protein Co-Expression zu stimmen Mutationsfrequenz in E. berichten colich a. Zu diesem Zweck haben wir PGOOD-pBAD Paare geeignet, relevante Beispiele für jede Fallstudie veranschaulichen.

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Protocol

1. Isolierung von E. coli Cotransformanten

  1. Bereiten elektrokompetenten Zellen des entsprechenden E. coli-Stamm transformiert werden. Transfer zum 1 ml LB-Medium (Trypton, Hefeextrakt, NaCl bei 10, 5 und 10 g / L, respectively) einer Einzelkolonie des Stammes der Wahl, und bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen von 180 Umdrehungen pro Minute. Verdünne die Vorkultur 1: 500 in 25 ml frischem LB-Medium und Inkubation der Kultur bei 37 ° C.
  2. Bei log-Phase (0,6 OD) Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 × g für 20 min), und das Pellet in 10%, v / v eiskaltes steriles Glycerin-Wasser in die Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal, jedes Mal, wenn die Halbierung der Resuspensionsvolumen. Schließlich das Pellet in Glycerin / Wasser und teilen Sie die Zellsuspension in 50 ul Aliquots. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 ° C bis zu 6 Monaten.
  3. Lösen Sie das gewünschte Plasmid in sterilem Wasser mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Thaw auf ice ein Aliquot elektrokompetenter Zellen und Mischen mit einer geeigneten Menge (2,5-5 ng) des Vektors. Abgeben der Mischung in eine 0,1 cm-Küvette für Elektroporation und gelten 1,8 kV.
  4. Die elektroporierten Zellen unmittelbar Transfer in 1 ml SOC-Medium (LB-Medium mit 0,2% w / v Glucose, 10 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl ergänzt), Inkubation für 1 h unter Schütteln und schließlich dann 100 ul Aliquots auf Petrischalen, LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  5. Reinige die Transformanten durch Ausstreichen von Einzelkolonien auf Petrischalen.
  6. Bereiten von elektrokompetenten Zellen der primären Transformanten und die Schritte 1.1 bis 1.5 mit weiteren Plasmide transformieren.
  7. Bereiten Glycerin Aktien der Co-Transformanten. Übertragen einer einzelnen Kolonie in LB mit den geeigneten Antibiotika ergänzt, bei 37 ° C unter Schütteln und bei log-Phase (0,6 OD) Zentrifuge die Zellen Suspension bei 5000 g für 20 min. Resuspend des Pellets in LB-Medium, das Antibiotika, 15% v / v Glycerin. Dispense in Aliquots und Lagerung ist - 80 ° C.

2. Die Co-Expression von α und ε-Untereinheiten von E. coli DNA Polymerase III

  1. Übertragen Sie mit einer sterilen Schleife eine kleine Menge des entsprechenden Stammes Glycerolstammlösung (zB TOP10 / PGOOD-ε243 und TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, siehe Abbildung 1) in eine Petrischale mit LB-Medium und Antibiotika. Lassen Sie die Zellsuspension trocken auf die Petrischale, und streifen die Zellen Tröpfchen. Bei 37 ° CO / N.
  2. Transfer mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne Kolonie zu 1 ml LB-Medium Antibiotika. Inkubieren 8 h bei 37 ° C. Verdünnen Sie die Vorkultur 1: 500 in frischem Medium und Inkubation bei 30 ° C für 15 Stunden.
  3. Fügen IPTG, Arabinose, oder Arabinose und IPTG, 1 mM jeweils. Inkubiere bei 30 ° C für 2,5 Std. Sammeln Sie die Zellen, und die Pellets lagern bei -20 ° C.
  4. Tau-Pellets auf Eis und Resuspendieren in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH 8). Homogenisierung vorsichtig die Zellsuspension mit einem kalten Glas Töpfer.
  5. Ultraschallbehandlung bei 15 W für 15 Sekunden, gefolgt von 15 Sekunden Kühlintervall (4 Zyklen).
  6. Zentrifugieren der Gesamtproteinextrakte bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um die lösliche Fraktion zu gewinnen.
  7. Analyse durch SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) Aliquots jeder löslichen Proteinextrakt. Zu diesem Zweck übertragen 20 ul jeder löslichen Proteinextrakt in Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 60 & mgr; l H 2 O und 20 & mgr; l Ladepuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) Glycerin, 0,25% (w / v) Bromphenolblau) eingestellt und die Mischung 5 min. Last 18 ul jeder Probe und führen Sie die Elektrophorese bei 140 V für ca. 1,5 Stunden.

3. Co-Expression der α-Untereinheit des Deinococcus durans DNA Polymerase III und ε-Untereinheit von E. coli DNA Polymerase III

  1. Bereiten Sie eine Vorkultur des E. coli-Stamm TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 in 1 ml LB-Ampicillin-Tetracyclin Medium und Inkubation 8 h bei 37 ° C. Gebrauchslösung: 1: 1000 in frischem Medium und Inkubation O / N bei 37 ° C.
  2. Verdünne 1: 100 in 200 ml frischem Medium, Inkubation bei 37 ° C für 3 Stunden inkubiert, anschließend für 3 h mit Arabinose und IPTG, 1 mM jedes induzieren. Ernten Sie die Zellen, und speichern Sie das Pellet bei -20 ° C.
  3. Das Pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogenisieren und stören die Zellen wie in 2.4 und 2.5 beschrieben.
  4. Unmittelbar Zentrifuge die Zellen Lysat bei 10.000 × g für 20 min. Entsorgen Sie das Pellet. Den Überstand mit einem Büchner-Trichter mit 3 Lagen Filterpapier ausgestattet. Bewerben leichtem Vakuum. Um eine übermäßige Schaumbildung zu vermeiden, halten das Vakuum-Erlenmeyerkolben auf Eis während der Filtration.
  5. Bestimmen der Proteinkonzentration nach Bradford 14.

4. Gelfiltrationschromatographie

  1. Äquilibrieren einem mit Wassermantel 16x70 (200) Gelfiltrationssäule mit 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Laden auf die Säule die löslichen Proteinextrakt. Für die optimale Auflösung, verwenden Sie ein 1 ml Probenschleife. Führen Sie die Chromatographie bei 0,6 ml / min. Halten Säulentemperatur bei 4 ° C im gesamten.
  2. Sammeln 0,9 ml-Fraktionen und zu analysieren durch SDS-PAGE. Transfer 20 ul jeder relevanten Fraktion in Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 60 & mgr; l H 2 O und 20 & mgr; l Ladepuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) Glycerol, 0,25% (w / v) Bromphenolblau) eingestellt und die Mischung 5 min. Last 18 ul jeder Probe und führen Sie die Elektrophorese bei 140 V für ca. 1,5 Stunden.
  3. Bestimmen die 3'-5'-Exonuclease und der DNA-Polymerase-Aktivität von jeder Fraktion in 96-well Mikrotiterplatten. Assay wird die Exonukleaseaktivität mit Thymidin-5'-monophosphat-p-nitrophenylester (p NP-TMP) als das Substrat 15. Abzuschätzen DNA-Polymerase-Aktivität unter Verwendung des PPX (Pyrophosphatase, Purinnucleosidphosphorylase, Xanthinoxidase) enzymgekoppelten Assay 16 und 2- (4-Jodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (INT) als Elektronenakzeptor 16.

5. Mutationsanalyse von Populationen Co-Expression des Wildtyp-ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III und die mutagene εD12A Variant

  1. Übertragen einer Einzelkolonie von E. coli TOP10, die das pBAD-ε und die pGOOD1-εD12A 11 Vektoren zu 1 ml LB-Medium Antibiotika. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  2. Verdünnen Sie die Vorkultur 1: 250 in 3-Kolben mit frischem Medium (10 ml), fügen Sie die entsprechenden Induktoren (Arabinose, IPTG oder Arabinose und IPTG 1 mM jeweils) und bei 37 ° C8 h. Bereiten parallel nicht-induzierten Kulturen.
  3. Sammeln Aliquots von 1 ml, dann verdünnt 1: 500 in neue Kolben mit frischem Medium (10 ml) ergänzt oder nicht mit den entsprechenden Induktoren. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 und sammeln Aliquots von 1 ml.
  5. Bestimmung der Anzahl der Generationen in jeder Kultur aufgetreten. Übertragen auf LB-Platten, 100 & mgr; l geeignete Verdünnungen des Inokulums und der Kultur. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C. Die Kolonien auf den LB-Platten, und berechnet den Logarithmus der Anzahl der im Inokulum vorhanden ist (log I) und in der Kultur am Ende des Wachstums (log C) Zellen. Um die Anzahl der Generationen zu bestimmen, verwenden Sie die Formel: (log C - log I) /0.301.
  6. Zentrifuge bei 5000 × g für 20 min, und die Zellen werden in 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Um die Zellen durchlässig, fügen Sie 2-3 Tropfen Chloroform und Vortex für 20 Sekunden.
  7. Bestimmen Sie die β-Glukosidase Aktivität jedes Aliquot in einer 96-Well-Mikroplatte, unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (PNPGluc) als Substrat. Hinzufügen zu jeder Vertiefung 100 ul der permeabilisierten Zellen und 100 ul Substrat (16 mg / ml Stammlösung in H 2 O). Achten Sie auf Luftblasen in den Vertiefungen zu vermeiden. Die Absorption bei 420 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät und den entsprechenden Filter.

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Representative Results

Die ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III aus 243 Aminosäuren und verfügt Schwerlöslichkeit 17,18, wenn die Stoffreste 187-243 deletiert 17. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass 11 die Co-Expression von Volllängen-α, ε und θ-Untereinheiten ergibt lösliche DNA-Polymerase III katalytischen Kern (Abbildung 1). Insbesondere unter Verwendung des pBAD-PGOOD Co-Expressionssystem, zeigten wir, dass: i) die Überexpression von α und ε-Untereinheiten können unabhängig von Arabinose und IPTG, bzw. (1A) gesteuert werden; ii) in voller Länge ε-Untereinheit kann in löslichen Proteinextrakten aus E. getrennt erfasst werden coli-Zellen überexprimieren α, ε und θ und Gelfiltration (1B) unterzogen. In diesem Fall wurde Exonucleaseaktivität in 3 Hauptpeaks (1B, gefüllte Kreise) verteilt und bei frac der Peak zentrierttion 23 wurde gezeigt, dass die αεθ katalytischen Kern (1C und 1D) enthalten. Die Stabilität von ε stark bei Bindung an α und θ erhöht. Wenn wir vorher überexprimiert voller Länge ε in E. coli, eine geringe Menge an freiem ε wurde durch Western-Blot in löslichem Protein nachgewiesen extrahiert 19 (2A). Es ist interessant festzustellen, daß unter den gleichen Bedingungen, wir erkannt immer größere Mengen an freien C-Ter verkürzte Formen von ε (ε-234, ε-228, ε-213 oder ε-186), unter denen ε-186 besser ab 19 (2A). Wir haben auch zeigen, dass die Proteolyse von ε C-terminale Domäne wird durch die Bindung an α und θ Einheiten 19 verhindert. Die Wirkung, wenn überhaupt, der Co-Expression auf die Löslichkeit von ε kann leicht getestet werden. Wie in 2B angegeben, löslichen Proteinextrakten aus überexprimierenden Zellen isoliertα, ε oder ε und α können durch SDS-PAGE analysiert werden, und einfach im Vergleich zu Gesamtproteinextrakten. In diesem Fall zeigt die elektrophoretische Analyse, dass, wenn sie allein überexprimiert, ε-Untereinheit Funktionen schlechte Löslichkeit (vergleiche Spuren 1 und 2), während die Co-Expression von α die Konzentration von ε in lösliche Proteinextrakten stark erhöht (vergleiche Bahnen 3 und 4 ).

Die Co-Expression kann auch verwendet werden, um zwischen verschiedenen Arten Komplementationstests auszuführen. Daher dachten wir, es von Interesse sein, die Interaktion zwischen Untereinheiten zu den Replikations Maschinen von Gram + und Gram gehört zu bewerten. - Bakterien Deinococcus radiodurans ist ein Bakterium Gram +, mit einem großen α-Untereinheit (1335 Aminosäuren, 150 kDa) und a putative ε-Untereinheit, enthaltend 197 Aminosäuren. Interessant ist, D. durans ε-Untereinheit ist frei von in seinem E. der C-terminalen Domäne vorhanden coli E. coli und D. durans ε-Untereinheiten gleich 29% und 59%, bzw. sind (unter Berücksichtigung der Region 1-178 koordiniert D. radiodurans). Um die Kompetenz von D. Assay radiodurans-Polymerase III-α-Untereinheit (α Dr) in verbindliche E. coli ε-Untereinheit haben wir in den pBAD-Vektor ein synthetisches Gen für α Dr Codierung kloniert und wir co-transformiert E. coli mit pBAD-α Dr und PGOOD-ε. Die gleichzeitige Zugabe von IPTG und Arabinose zu dem Kulturmedium löst die Co-Expression von α Dr und ε (3A). Die Verbindung dieser zwei Proteine ​​wurde durch Gelfiltration getestet. Zellen zur Co-Expression der DNA-Polymerase III α Dr und ε-Untereinheiten wurden durch Zentrifugation (5000 xg, 20 min) gesammelt, in Lyse-Puffer suspendiert, durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen, und die löslichen Proteine ​​wurden sofortly geladen auf eine Superdex 200-Säule (3B). Wie 3C zeigt, wenn die gesammelten Fraktionen wurden 3'-5'-Exonuklease und DNA-Polymerase-Aktivitätstests unterzogen, deren Aktivitätspeaks wurden bei deutlich erkannt verschobenen Positionen, was darauf hindeutet, dass α Dr nicht an der Bindung E. zuständigen coli ε-Untereinheit. Dies wurde bestätigt, als Aliquots der Fraktionen 32, 36 und 52 wurden durch SDS-PAGE eingeengt und analysiert. Fraktion 36 wurde festgestellt, α Dr enthalten und frei von E. sein coli ε-Untereinheit, während die Fraktion 52 enthielt E. coli ε aber war frei von α Dr (3D).

Replikationsgenauigkeit beruht hauptsächlich auf der Fähigkeit der DNA-Polymerasen, um gegen Basenfehlpaarungen in DNA-Verlängerungs diskriminieren. Trotzdem kann mismatched Deoxynukleotide an 10 -4 Frequenz 20 aufgenommen werden, und die Tätigkeitder 3'-5'-Exonukleasen ist wichtig, um die neu synthetisierte DNA-Strang Korrektur gelesen. Außerdem wurde geschätzt, dass diese DNA-Editierungsfunktion Replikationsgenauigkeit erhöht um 3 Grßenordnungen 20. Dementsprechend kann Mutatorstämmen durch Beeinträchtigung der DNA Korrektur, beispielsweise durch ein mutagenes Variante E. bedingt exprimieren konstruiert werden coli-DNA-Polymerase III ε-Untereinheit. Dies kann erzielt Konstruieren einer Variante ε zuständigen in Bindungs ​​α, aber ohne ihre Korrektursystem, und zum Steuern der Erzeugung von mutagenen ε durch geeignete Expressionssysteme werden. Unter Verwendung dieser Strategie wurde gezeigt, dass E. coli Mutationsfrequenz erhöht sich unter Bedingungen zu induzieren mutagene Varianten ε 11,21. Es wurde jedoch keine Feinabstimmung der Mutationsfrequenz erreicht auf diesem Wege. Protein co-Ausdruck verwendet, um eine bessere Kontrolle der Mutationsstämmen erhalten werden. Zu diesem Zweck haben wir cotransformiert E. coli mitpBAD-ε und pGOOD1-εD12A, um die Expression des Wildtyp und die mutagene D12A Variante ε mit Arabinose und IPTG bzw. induzieren. (Bgl -) in Wildtyp-E als phänotypische Test, das Auftreten von β-Glucosidase-Aktivität, die kryptisch ist wir festgestellt, coli 22,23. Spontane Mutanten in der Lage, β-Glucoside als Kohlenstoffquellen (Bgl +) nutzen kann, angereichert oder isoliert Flüssigkeit 23 oder feste Medien 24 verbunden werden. Wenn die Zellen veranlasst, die D12A mutagene Variante auszudrücken, wurde β-Glucosidase-Aktivität in ca. erworben 20 Generationen (4A). Es sollte beachtet werden, dass ein ähnlicher Trend wurde in nicht-induzierten Zellen (4A), wahrscheinlich weil die Transkriptionskontrolle auf pGOOD1 ausgeübt beachten ist eher leaky 11. Trotzdem, wenn das Wildtyp-ε-Untereinheit induziert wurde, alleine oder in Verbindung mit dem D12A Variante β-GlucosidaseAktivität wurde durch E. erworben coli auf moderatem Niveau (4A). Die β-Glucosidase-Aktivität von Bgl + Mutanten wurde berichtet, dass zwischen 3 und 40 & mgr; M / min 23 reichen. Die Höhe hier in E. bestimmt coli Populationen auf die Expression von εD12A ausgesetzt ist viel niedriger, jedoch sollten Sie beachten, dass wir nicht versuchen, Bgl + Mutanten auf festen Medien zu isolieren.

Figur 1
Abbildung 1. Die Co-Expression von E. coli-DNA-Polymerase III katalytischen Kern. (A) SDS-PAGE des Gesamtproteins von E. extrahierten coli TOP10 / pBAD-α1160 / PGOOD-ε243 in Abwesenheit von Induktoren gewachsen in Gegenwart von nur Arabinose IPTG einzige oder in Medium mit sowohl Arabinose und IPTG (Bahnen 1-4 bezeichnet) ergänzt. (B) Absorption (leere Kreise) und Exonukleaseaktivität (gefüllte Kreise) von Fraktionen, die durch Unterziehen einer Gelfiltration löslichen Proteine ​​aus E. extrahiert isoliert coli TOP10 überexprimieren α, ε, θ und Untereinheiten der E. coli-DNA-Pol-III. (C) SDS-PAGE von Fraktionen, 6, 12, 23, 31 und 41 (Bahnen 1-5 bezeichnet) in Feld B gemeldet (D) SDS-PAGE eines konzentrierten Aliquots der Fraktion 23, deren Exonukleaseaktivität und elektrophoretische Muster werden in Panels B und C, ausgewiesen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Biotechnology Letters, 33, Conte et al. "PGOODs: neue Plasmide für die Co-Expression von Proteinen in Escherichia coli"., 1815-1821 (2011) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Die Proteolyse von E. coli-DNA-Polymerase III ε-Untereinheit. (A) Abbau von monomeren, wie durch Western-Blotting von Proteinen aus E. extrahiert enthüllt coli TOP10 überexprimieren voller Länge oder verkürzte Formen von ε; Pfeilspitzen zeigen die Position von 25 und 19 kDa vorgefärbten molekularen Markern. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Elsevier aus Biochimica et Biophysica Acta Proteine ​​und Proteomics 1794 Bressanin et al. "Proteolyse des Korrektureinheit steuert die Montage von Escherichia coli-DNA-Polymerase III katalytischen Kern", 1606-1615 (2009). (B) Die Co-Expression von α und ε-Untereinheiten von E. coli-DNA-Polymerase III katalytischen Kern. SDS-PAGE des gesamten (Bahnen 1 und 3) und lösliche (Bahnen 2 und 4) Protein zusätzlichencts aus überexprimierenden Zellen ε-Untereinheit isoliert (Bahnen 1 und 2) oder der α und ε-Untereinheiten (Spuren 3 und 4).

Figur 3
Abbildung 3. Die Co-Expression der DNA-Polymerase III α und ε-Untereinheiten von Deinococcus radiodurans und Escherichia coli sind. (A) SDS-PAGE von Gesamtproteinextrakte aus den Zellen nicht induziert (Bahn 1) oder induziert α Dr überexprimieren, ε oder ε und α Dr (Bahnen 2-4 bezeichnet) isoliert. (B) Das Chromatogramm (leere Kreise, linke Achse) und die Proteinkonzentration der Fraktionen (gefüllte Kreise, rechte Achse) eluiert bilden eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200) mit löslichen Proteinen aus E. extrahierten geladenen coli überexprimieren α Dr einnd ε-Untereinheiten. (C) Korrektur (leere Kreise, linke Achse) und DNA-Polymerase (gefüllte Kreise, rechte Achse) Tätigkeiten der Fraktionen in Feld B (D) SDS-PAGE konzentrierter Aliquots der Fraktionen 32, 36 und 52 angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4
Abbildung 4. Mutationsfrequenz von E. coli-Zellen unterzogen oder nicht Co-Expression des Wildtyp und mutagenen Varianten D12A der DNA-Polymerase III ε-Untereinheit. Die Karte des neuen Plasmids pFINE ist ebenfalls gezeigt. (A) β-Glucosidase-Aktivität von E. coli TOP10 nicht induziert (No Ind) oder Überexpression von Wildtyp-ε-Untereinheit (zogenAra), die mutagene Varianten D12A (IPTG) oder beide Wildtyp und D12A ε-Untereinheiten (Ara + IPTG). Die β-Glucosidase-Aktivität als Funktion der Generationen berichtet. (B) Karte des neuen Expressionsvektor pFINE. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) dieses Plasmids ist identisch zu denjenigen, die in dem kompatiblen pBAD und PGOOD Vektoren lassen facile Shuttling von Genen unter ihnen.

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Discussion

Proteine ​​können sich nicht in Ordnung sein, mit Regionen, deren Tertiärstruktur ist nicht auf eine begrenzte Anzahl von Konformationen, 25 beschränkt. Diese ungeordnete Proteine ​​sind in der Regel anfälliger für Aggregation 25, und deren Isolierung und Charakterisierung könnte eine schwierige Aufgabe darstellen. Die ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III verfügt über zwei getrennte Bereiche 26,27, und zwar: i) die N-ter-Domain, mit dem 3'-5'-Exonukleaseaktivität, und kompetenter bei der Bindung des θ-Untereinheit; ii) der C-ter Domäne um die Bindung an den α (Polymerase) -Untereinheit verantwortlich. Die C-ter Bereich der ε ist bekannt, geringe Löslichkeit verleihen dieses Proteins, die Förderung ihrer Aggregation. Es wurde in der Tat gezeigt, dass ε-186, eine verkürzte Form des Proteins ohne die C-ter Domäne löslich ist, und kann mit hoher Ausbeute 17 gereinigt werden. Wenn jedoch das Zusammenwirken der mit α ε ist, quantitativ untersucht werden(Zum Beispiel, um den K D des αε Komplex zu bestimmen), ist die Reinigung von Volllängen-ε erforderlich, was eine schwierige Aufgabe biochemischen. In diesem Rahmen stellt Protein Coexpression qualitative Abschätzungen der Bindung von ε zu α. Wir haben gezeigt, daß hohe Ausbeuten des αεθ Komplex kann in vivo durch die Co-Expression (Figur 1) erhalten werden, unter Umgehung der schlechten Löslichkeit von ε-Untereinheit. Bemerkenswert ist, die Reinigung des überexprimierten αεθ Komplex wurde berichtet, 28,29. Das Co-Expressionsstrategie kann auch verwendet werden, um zu testen, ob das Einführen der ortsspezifischen Mutationen in einer der interagierenden Partner beeinträchtigt Komplexbildung. Dementsprechend Protein Co-Expression stellt eine bequeme und rasche Werkzeug zur qualitativen Tests von Protein-Protein-Wechselwirkung durchzuführen. Es sollte auch darauf hingewiesen, dass unser Coexpression System beruht auf 2 verschiedenen Induktoren, dh, Arabinose und IPTG werden. Daher können geeignete Kontrollen leicht durchgeführt werden, wenn die Prüfung der Bildung eines Protein-Komplexes, beispielsweise Weglassen eines Induktors aus der Bakterienwachstumsmedium (1A).

Wir präsentierten hier ein optimiertes Verfahren für die Co-Expression der α und ε-Untereinheiten der E. coli DNA Polymerase III. Wenn dieses Protokoll wurde entwickelt und getestet, wurden die folgenden Parameter als kritisch für den Erfolg der Co-Expressionsversuche ermittelt: i) die Temperatur bei der Induktion durchgeführt wird; ii) die Zeitlänge Induktion; iii) die Konzentration des Induktors (s). Insbesondere konnten wir αεθ Komplex 11 löslichen von Zellen bei 37 ° C induziert, um zu erhalten, unabhängig von der Induktionszeit. Wir schlagen daher vor, verschiedene Temperaturen für den Induktionsschritt prüfen, und um die Überexpression von Proteinen als eine Funktion der Zeit zu überprüfen. Darüber hinaus ist die parallele Auswertung Coexpression in diffErent E. coli-Stämme können helfen, wenn vor mäßigen Ausbeuten der Zielproteine ​​sein.

Wir haben hier ein repräsentatives Experiment durchgeführt, um aus verschiedenen Spezies zu testen, die Bindung von Proteinen berichtet, und wir haben gezeigt, dass Protein Co-Expression ist nützlich, um schnell testen Sie die Vereinigung von zwei heterologen Proteinen in einem Hybrid-Funktionskomplex. Gelfiltrationschromatographie wurde hier verwendet, um die Komplexbildung (Figur 3) zu bewerten. Jedoch könnte die Einfügung eines entsprechenden Tag einem der interagierenden Partner diese Beurteilung zu ermöglichen, lassen die Verwendung von Affinitätserfassungsmethoden. Um Störungen des Tag mit Protein-Protein-Wechselwirkungen zu vermeiden, kann das Gen für einen der Interaktionspartner kodierende parallel in pBAD eingefügt / His und pBAD / Myc-His-Vektoren, die jeweils zur Übertragung einer Hexahistidin-Motiv an den N- und C Terminus des Zielproteins.

E. coli mutator Stämme verfügen Mutation Frequenzen höher als ihre Wildtyp-Gegenstücke. Mutator-Stämme sind von Interesse in der Biotechnologie 30, zum Beispiel, um ein Ziel Dehnung in Richtung Roman Wunsch Phänotypen schnell entwickeln. Wir versehen Sie hier, Beweise, die Co-Expression der Wildtyp und eine mutagene ε-Untereinheit von E. coli-DNA-Polymerase III, der Mutationsfrequenz von dem bakteriellen Wirt mit ausreichender Komfort eingestellt werden. Zur weiteren Verbesserung dieser Technologie sind eng regulierten Expressionsvektoren erforderlich, so viel wie möglich die Expression des stark mutagenen D12A Variante der ε-Untereinheit unterdrücken. Insbesondere wäre es interessant, um die Mutationshäufigkeit in E. Testen coli mit dem pBAD-εD12A und pGOOD1-ε, dh die Konfiguration Alternative, die hier vorgestellt transformiert. Die pBAD-Vektoren sind in der Tat bekannt, streng reguliert werden 12, und diese Funktion kann bei der Beibehaltung der basalen Konzentration εD12A helfenauf einem niedrigen Niveau.

Die Beispiele für Protein Co-Expression berichtet hier zeugen von der Vielschichtigkeit dieser Technik. Jedoch ist es wichtig zu beachten, dass die Verwendung einer Vielzahl von kompatiblen Plasmiden in einzelne E. coli-Zellen, die Herausforderungen, die von Protein Co-Expression ergriffen werden können erheblich erweitern. In den vergangenen Jahren wurde intensive Arbeit gewidmet, das Repertoire von kompatiblen Plasmiden für Protein co-Expression verwendet werden erweitern. Insbesondere wurde ein Dreistoffsystem unter Berufung auf kompatible Plasmide, die ColE1, p15A und pSC101 Replikations verwendet werden, um co-exprimieren entweder Bakterien- und Säugerproteinen 31. Kürzlich wurde ein quaternäres Coexpression System gemeldet. In diesem Fall 13 heterologer Gene in E. coexprimiert coli cotransformiert mit 4-kompatible Expressionsvektoren, enthaltend das ColE1, p15A, CloDF13 und RSF Replikations 32. Diese Co-Expressionssystem wurde erfolgreich in der Herstellung verwendet inE. coli funktionell aktiven löslichen Hydrogenase I von Pyrococcus 32. Zum Vergrössern unserer binären System konstruierten wir einen neuen Expressionsvektor, pFINE, mit dem pSC101 Replikationsursprung, ein Neomycin-Resistenz-Kassette und die lac regulatorischen Elemente (4B). Dieses Plasmid enthält in pBAD und PGOOD Vektoren die gleiche vorliegenden Polylinker erleichtert so Gen pendelt zwischen den 3 Komponenten des Co-Expressionssystem. Obwohl pFINE ist ein in geringer Kopienzahl Plasmid, wurde die Stabilität als zufriedenstellend befunden, wenn sie in Vollmedium getestet. Wir sind derzeit in den weiteren Ausbau unserer ternären Co-Expressionssystem beschäftigt. Zu diesem Zweck konstruierten wir einen pBAD Derivat eine Chloramphenicol-Resistenzkassette enthält, und sind auf dem Weg, den ColE1-Replikationsursprung mit einem mit ColE1, p15A, pSC101 kompatibel auszutauschen. Es ist in der Tat unserer Meinung nach, dass die Verwendung von mehreren Plasmiden in Einzel E. coli-Zellen repärgert ein leistungsfähiges Werkzeug, um die in vivo Expression von Proteinkomplexen aus einer Vielzahl von verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt herauszufordern.

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Die Genehmigung von Springer und Elsevier Zahlen Nachdruck stark anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
Chloroform Sigma-Aldrich 288306
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
INT Sigma-Aldrich I8377
IPTG Sigma-Aldrich I5502
KCl Sigma-Aldrich P9541
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
NaCl Sigma-Aldrich 31434
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PNP-gluc Sigma-Aldrich N7006
pNP-TMP Sigma-Aldrich T0251
Tetracyclin Sigma-Aldrich 87128
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Sigma-Aldrich 95039
Yeast extract Fluka 70161
Acrylamide solution 30% BioRad 161-0158 For gel electrophoresis
Ammonium persolphate BioRad 161-0700 For gel electrophoresis
Glycine BioRad 161-0718 For gel electrophoresis
SDS BioRad 161-0302 For gel electrophoresis
TEMED BioRad 161-0800 For gel electrophoresis
Tris BioRad 161-0719 For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm BioRad 1652089 For electroporation
Centrifuge 5415R Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation BioRad
Microplate Reader 550 Biorad
MiniProtean 3 cell BioRad
Power Supply BioRad
Sonicator 3000 Misonix

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References

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Biochemie Heft 96, Protein Co-Expression kompatiblen Plasmiden Komplementationstest DNA-Polymerase III Mutatorstämme
Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em
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Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), e52431, doi:10.3791/52431 (2015).

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