Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב Published: February 5, 2015 doi: 10.3791/52431
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

Introduction

כניסתן של טכנולוגיות ביטוי יתר שיפרה גם מחקרים ביוכימיים של אנזימי מספר נמוך עותק והייצור התעשייתי של חלבונים פרמקולוגית פעילים (למשל, אינסולין). מאז כניסתו של טכנולוגיות אלה, התקדמות משמעותית הושגה להגדיל את התפוקה ואיכות של חלבונים רקומביננטי. בנוסף, מערכות ביטוי יתר פרוקריוטים 1,2 ואוקריוטים 3 פותחו לאורך השנים, המציעות חלופות שימושיות ל" סוס העבודה "של ביוטכנולוגיה חלבון, כלומר, Escherichia coli. בפרט, את הזמינות של פלטפורמות חלופיות לE. coli הוביל לייצור של פפטידים או חלבונים הנושאים לאחר translational שינויי רקומביננטי. עם זאת, יש לציין כי ה coli עדיין מייצג את האורגניזם של בחירה לייצור חלבון רקומביננטי. זאת בשל מספר גורמים, ביניהם הרלוונטיים ביותר יכול להיותנחשבת: i) את הזמינות של מספר לא מבוטל של מערכות ביטוי יתר (וקטורי ביטוי וזנים) לE. coli 1,2; ii) פעמים הדור הקצר, ותשואות ביומסה גבוהות, של א ' coli במגוון רחב של מדיה עשירה וסינתטי; iii) המניפולציה הקלילה או ביוכימיים וברמה הגנטית של מיקרואורגניזם זה; iv) הבידוד של זנים מסוגלים הייצור של חלבונים רעילים 4; v) הבנייה של זנים הכוללים אינדוקציה הומוגנית ברמת האוכלוסייה 5,6. בנוסף, הוא היה לאחרונה הראה כי מערכות הביטוי מתאימות לייצור בE. coli של חלבונים שונה-translationally פוסט ניתן המציא ונבנה 2.

נכון לעכשיו, ביטוי יתר של חלבון משמש בעיקר כדי להשיג חלבוני monomeric או הומו-oligomeric, hypersynthesis שניתן לבצע עם גן יחיד המשובט לתוך פלסמיד מתאים. עם זאת, תשומת לב הייתה לאחרונהששולם לבנייה של א ' מערכות coli שיתוף ביטוי חלבון, מאתגרים את הייצור, in vivo, מתחמי הטרו-oligomeric 2. מעניין, ניסויים מוקדמים של שיתוף ביטוי חלבון התייחסו להרכבה בין-המינים של תת-יחידות קטנות וגדולות של carboxylase ribulose-1,5-bisphosphate cyanobacterial / oxygenase 7,8, ואת הקשר של צורות קטועות ובאורך מלא של HIV-1 להפוך transcriptase 9. מחקריו החלוציים אלה הראו, כי שיתוף ביטוי חלבון מהווה אלטרנטיבה חזקה למסורתית בכינון מחדש חוץ גופית. בנוסף, חלבון שיתוף ביטוי בE. coli שימש לייצור חלבונים שונים הנושאים לאחר translational שינויים 2, כדי להשיג חלבונים המכילים חומצות אמינו לא טבעיות 2, ולהגדיל את התשואה של חלבונים בממברנה ביטוי יתר 2. יתר על כן, את הפוטנציאל של שיתוף ביטוי חלבון ככלי להענקה לE. coli להתחרותפליטות בהפרשת חלבון נמצאת תחת חקירה פעילה 2.

שתי אסטרטגיות עיקריות של שיתוף ביטוי חלבון בE. יכול להיות רדוף coli: i) השימוש בפלסמיד בודד לארח גנים השונים לביטוי יתר; ii) את השימוש בפלסמידים מרובים בתאים בודדים לשתף לבטא חלבוני היעד. במקרה הראשון, הקריטריונים לבחירה של פלסמיד לא שונים מאלה של ניסויי ביטוי יתר של חלבון בודדים מסורתיים, אם כי פלסמידים מסוימים המכילים אלמנטים של פרומוטר / מפעיל בד בבד נבנו לשיתוף ביטוי 10. הגישה הראשונה היא לכן די פשוט. עם זאת, יש לציין כי השימוש בפלסמיד בודד לשתף לבטא חלבונים שונים בפני שני קשיים עיקריים: א) המסה המולקולרית של עליות וקטור עם מספר גנים אירחו, הגבלת מספר החלבונים הביעו שיתוף; ii) כאשר מספר רב של גנים הם משובטים תחת שליטתו של יזם יחיד, קוטביות יכולה decreasדואר הביטוי של הגנים דיסטלי מהאמרגן. השימוש בפלסמידים כפולים או מרובים בE. אחת תאי coli יש להשיג את התאימות של הווקטורים של בחירה, ולכן הטלת מגבלות לצירופים הזכאים של פלסמידים. עם זאת, אסטרטגית שיתוף הביטוי שנייה זה כולל את היתרון של המכיל את המסה המולקולרית של וקטורים, ומגבילה את הקוטביות. לאחרונה בנו מערכת שיתוף ביטוי חלבון שנועדה להקל על הטלטלות של גנים בין פלסמידים שיתוף הביטוי 11. בפרט, אנו נבנו סדרת וקטורי pGOOD, התכונות הרלוונטיות שבהן: א) מקור p15A של שכפול, כדי לספק תאימות של פלסמידים pGOOD עם הווקטורים המסחריים המכילים את מקור ColE1 (למשל, סדרת pBAD 12); ii) קלטת טטרציקלין-התנגדות; iii) את נוכחותו של אק -derived אלמנטי רגולציה, כלומר, יזם-המפעיל (O 1) בני זוג והאצים q גן. באמצעות זוג pBAD-pGOOD מתאים, היינו יכול ביטוי יתר של הליבה הקטליטית של E. פולימראז coli DNA III, מורכב משלוש תת-יחידות שונות, כלומר, α ('פולימראז, ε (3'-5 5'-3)' exonuclease) וθ (ε ייצוב) 13. בפרט, הראינו כי שיתוף הביטוי של מתחם αεθ היה תלוי אך ורק על התוספת לE. בינוני coli תרבות של שני IPTG וarabinose, ביטוי יתר מפעילה מpGOOD וpBAD, בהתאמה (איור 1 א).

בדו"ח הנוכחי, אנו מדגימים כיצד שיתוף ביטוי חלבון ביעילות יכול לפתור קשיים צמודים לעניי המסיסות של מקטע מורכב חלבון. בנוסף, אנו מראים כיצד בבדיקות שלמת חלבון vivo יכול להתבצע, ובסופו אנו מדווחים על השימוש בשיתוף ביטוי חלבון לתדירות מוטציה המנגינה בE. coli. למטרה זו, השתמשנו זוגות pGOOD-pBAD מתאימים כדי להמחיש דוגמאות רלוונטיות של כל מקרה מבחן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד של א ' coli Co-transformants

  1. הכן תאי אלקטרו-המוסמך של E. המתאים זן coli להשתנות. העברה ל1 מיליליטר של מדיום LB (Tryptone, תמצית שמרים, NaCl בגיל 10, 5, ו -10 g / L, בהתאמה) מושבה אחת של הזן של בחירה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בתנאים רועדים של 180 סל"ד. לדלל את הקדם-תרבות 1: 500 ב- 25 מיליליטר של מדיום LB הטרי ודגירת התרבות על 37 מעלות צלזיוס.
  2. ביומן-שלב (0.6 OD) צנטריפוגה ההשעיה התאים בXG 5000 עבור 20 דקות), וresuspend גלולה ב 10%, v גליצרול-מים סטריליים קר כקרח / v במחצית התרבות המקורי הנפח. חזור על שלב זה 4 פעמים, וחצה בכל פעם resuspension הנפח. לבסוף, resuspend את הכדור בגליצרול / מים ומחלקים את ההשעיה התאים ב -50 aliquots μl. אחסן aliquots ב C עד -80 ° עד 6 חודשים.
  3. ממיסים את הפלסמיד הרצוי במים סטריליים בתוספת 0.5 mM EDTA. הפשרה בicדואר aliquot של תאי אלקטרו-מוסמך ולערבב עם כמות מתאימה (2.5-5 ng) של וקטור. לוותר התערובת לתוך קובט 0.1 סנטימטר מתאים לelectroporation, ולהחיל 1.8 kV.
  4. מייד להעביר את תאי electroporated לתוך 1 מיליליטר של מדיום SOC (מדיום LB בתוספת 0.2% w / v גלוקוז, 10 מ"מ MgCl 2, 2.5 מ"מ KCl), דגירה עבור שעה 1 ברעד, ובסופו להעביר 100 aliquots μl לצלחות פטרי המכיל אגר LB עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. לטהר את transformants ידי פסי מושבות אחת על צלחות פטרי.
  6. הכן תאי אלקטרו-המוסמך של transformants הראשוני וחזור על שלבים 1.1-1.5 להפוך עם פלסמידים נוספים.
  7. הכן מניות גליצרול של שיתוף transformants. העבר את מושבה אחת בLB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה, לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת רועד, וביומן-שלב (0.6 OD) צנטריפוגות ההשעיה התאים בXG 5000 עבור 20 דקות. Resuspend גלולה בLB-אנטיביוטיקה בינונית מכילה 15% גליצרול V / V. לוותר בaliquots ולאחסן ב-- 80 ° C.

2. שיתוף ביטוי של תת-יחידות α וε של א ' coli DNA פולימראז III

  1. העבר עם לולאת סטרילי כמות קטנה של מניות הזן המתאים גליצרול (לדוגמא, TOP10 / pGOOD-ε243 וTOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, ראה איור 1) לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני LB ואנטיביוטיקה. בואו יבש השעיה תאים על גבי צלחת פטרי, ופס תאי טיפה. לדגור על 37 מעלות CO / N.
  2. העברה, באמצעות קיסם סטרילי, מושבה אחת עד 1 מיליליטר של מדיום LB-אנטיביוטיקה. דגירה 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל את הקדם-תרבות 1: 500 במדיום חדש ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
  3. הוספת IPTG, arabinose, או arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2.5 שעות. לאסוף את התאים, ולאחסן את כדורים ב -20 ° C.
  4. כדורי הפשרה על קרח וגלול במאגר תמוגה (50 מ"מ טריס-HCl, 50 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, dithiothreitol 2.5 מ"מ, 1 מ"מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF), pH 8). בעדינות homogenize ההשעיה תאי הקדר זכוכית קרה עם.
  5. Sonicate ב 15 W במשך 15 שניות, ואחריו 15 שניות מרווח קירור (4 מחזורים).
  6. צנטריפוגה כוללת תמציות חלבון ב10,000 XG במשך 20 דקות, בשעה 4 ° C כדי לשחזר את החלק המסיס.
  7. לנתח ידי SDS-PAGE (acrylamide 12.5%) aliquots של כל תמצית חלבון מסיסה. למטרה זו, להעביר 20 μl של כל תמצית חלבון מסיסה לצינורות Eppendorf המכילים 60 μl של H 2 O ו -20 μl של חיץ טעינה (250 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% (w / v) גליצרול SDS, 50% (V / V), 0.25% (w / v) bromophenol הכחול) ולהרתיח במשך 5 דקות. עומס 18 μl של כל דגימה ולבצע אלקטרופורזה ב 140 V לכ -1.5 שעות.

3. שיתוף ביטוי של מקטע α של Deinococradiodurans cus DNA פולימראז III וε מקטע של א ' coli DNA פולימראז III

  1. הכן מראש תרבות של א ' TOP10 זן coli / pBAD-α ד"ר / pGOOD-ε243 ב 1 מיליליטר של מדיום LB-אמפיצילין-טטרציקלין והדגירה 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לדלל 1: 1,000 במדיום חדש ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל 1: 100 לכ -200 מיליליטר של מדיום חדש, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, ולאחר מכן להשרות במשך 3 שעות עם arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד. קציר התאים, ולאחסן את גלולה ב -20 ° C.
  3. Resuspend את הכדור ב 50 מ"מ טריס pH-HCl 8, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ PMSF. Homogenize ולשבש את התאים כמתואר ב2.4 ו -2.5.
  4. מייד בצנטריפוגה התאים lysate על 10,000 XG במשך 20 דקות. זורק את הכדור. סנן את supernatant עם משפך ביכנר מצויד ב3 שכבות של נייר סינון. החל ואקום עדין. כדי למנוע הקצפת יתר, לשמור על ארלנמייר הוואקום על קרח במהלך סינון.
  5. קביעת ריכוז חלבון על פי 14 ברדפורד.

4. ג'ל סינון כרומטוגרפיה

  1. לאזן 16x70 בז'קטים מים (200) טור סינון ג'ל עם 50 מ"מ טריס-HCl, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. טען על טור תמצית החלבון המסיס. לרזולוציה אופטימלית, להשתמש מדגם לולאת 1 מיליליטר. לבצע כרומטוגרפיה על 0.6 מיליליטר / דקה. לשמור על טמפרטורת טור ב 4 מעלות צלזיוס לאורך כל דרך.
  2. לאסוף 0.9 מיליליטר שברים ולנתח אותם על ידי SDS-PAGE. העברת 20 μl של כל חלק רלוונטי לצינורות Eppendorf המכילים 60 μl של H 2 O ו -20 μl של חיץ טעינה (250 טריס-HCl pH 6.8 מ"מ, 10 מ"מ β-mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v גליצרול / v), 0.25% (w / v) bromophenol הכחול) ולהרתיח במשך 5 דקות. עומס 18 μl של כל דגימה ולבצע אלקטרופורזה ב 140 V לכ -1.5 שעות.
  3. לקבוע את exonuclease 3'-5 'ופעילות DNA פולימרז של כל חלק ב96-ll microplates. Assay פעילות exonuclease באמצעות אסתר thymidine 5'-monophosphate p-nitrophenyl (עמ 'NP-TMP) כמצע 15. להעריך את פעילות ה- DNA פולימראז באמצעות PPX (Pyrophosphatase, phosphorylase nucleoside Purine, מונואמין Xanthine) מצמידים אנזים assay 16 ו2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) כלוריד -5-פניל-2H-tetrazolium (INT) כמקבל אלקטרונים 16.

5. ניתוח מוטציה של אוכלוסיות Co-המבטאת את מקטע ε Wild-הסוג של א ' coli DNA פולימראז III וmutagenic εD12A Variant

  1. העבר את מושבה אחת של E. coli TOP10 מכיל pBAD-ε ווקטורי pGOOD1-εD12A 11 עד 1 מיליליטר של מדיום LB-אנטיביוטיקה. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  2. לדלל את הקדם-תרבות 1: 250 ב 3 צלוחיות המכילות בינוני טרי (10 מיליליטר), להוסיף inducers המתאים (arabinose, IPTG, או arabinose וIPTG, 1 מ"מ כל אחד) ולדגור על 37 מעלות צלזיוסבמשך 8 שעות. הכן בתרבויות מושרה שאינן מקבילות.
  3. לאסוף aliquots של 1 מיליליטר, ואז לדלל 1: 500 בצלוחיות חדשות המכילות בינוני טרי (10 מיליליטר) בתוספת או לא עם inducers המתאים. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על שלבים 5.2 ו -5.3 ולאסוף aliquots של 1 מיליליטר.
  5. לקבוע את מספר הדורות התרחש בכל תרבות. העבר על צלחות LB, של דילולים סדרתי המתאימים של הבידוד ותרבות 100 μl. דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס. ספירת המושבות על צלחות LB, ולחשב את היומן של מספר תאים הנמצאים בבידוד (יומן I) ובתרבות בסוף הצמיחה (יומן C). כדי לקבוע את מספר הדורות, השתמש בנוסחה: (יומן C - להיכנס I) /0.301.
  6. צנטריפוגה בXG 5000 עבור 20 דקות וresuspend התאים 1 מיליליטר של 50 מ"מ טריס-HCl pH 7.6, 50 מ"מ NaCl. לpermeabilize התאים, להוסיף 2-3 טיפות של כלורופורם ומערבולת למשך 20 שניות.
  7. לקבוע את β-פעילות glucosidase של כל aliquot בmicroplate 96-היטב, באמצעות -nitrophenyl-β-D-glucopyranoside p (PNPGluc) כמצע. הוסף לכל טוב של תאי permeabilized 100 μl ושל מצע 100 μl (16 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות בH 2 O). תשמור על עצמך כדי למנוע בועות אוויר בבארות. קראו את הספיגה ב 420 ננומטר, באמצעות קורא microplate והמסנן המתאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מקטע ε של א ' coli DNA פולימראז III מורכב של 243 חומצות אמינו ותכונות מסיסות עניה 17,18, אלא אם כן השאריות 187-243 נמחקות 17. עם זאת, יש לנו הראינו בעבר 11 ששיתוף הביטוי של α באורך מלא, ε, ותת-יחידות θ מניב DNA פולימרז המסיס III ליבת קטליטי (איור 1). בפרט, באמצעות מערכת שיתוף ביטוי pBAD-pGOOD, הראינו כי: i) ביטוי היתר של α ויחידות משנת ε ניתן לשלוט באופן עצמאי על ידי arabinose וIPTG, בהתאמה (איור 1 א); ii) למקטע ε באורך מלא יכול להיות מזוהה בתמציות חלבון מסיסים מבודדות מE. תאי coli ביתר α, ε, וθ ונתונים לג'ל סינון (איור 1). במקרה זה, פעילות exonuclease הופצה ל 3 פסגות גדולות (איור 1, עיגולים מלאים), והשיא מרוכז בfraction 23 הראה להכיל את ליבת קטליטי αεθ (1C דמויות ו1D). היציבות של ε הוא גדל מאוד על מחייב לα וθ. כאשר אנו ביטוי יתר ε באורך מלא בעבר בE. coli, כמות נמוכה של ε החופשי זוהתה על ידי מערבי סופג בחלבון מסיס תמציות 19 (איור 2 א). זה מעניין לציין כי, באותם תנאים, אנחנו תמיד זוהו כמויות גדולות יותר של C-ter צורות חופשיות קטועות של ε (ε-234, ε-228, ε-213, או ε-186), ביניהם ε-186 19 (איור 2 א) ביצע טוב יותר. אנחנו גם לא מראים שproteolysis של תחום C-מסוף ε נמנעת על ידי המחייב לα ויחידות משנת θ 19. ההשפעה, אם בכלל, של שיתוף ביטוי על מסיסות של ε ניתן לבדוק בקלות. כפי שדווח באיור 2, תמציות חלבון מסיסים מבודדות מתאי overexpressingα, ε, או α ε ויכולים להיות מנותח על ידי SDS-PAGE, ובנוחות בהשוואה לסך תמציות חלבון. במקרה זה, ניתוח electrophoretic מציין כי, כאשר ביטוי יתר לבד, מסיסות עניה תכונות מקטע ε (השווה מסלולים 1 ו -2), ואילו שיתוף הביטוי של α משפר באופן משמעותי את הריכוז של ε בתמציות חלבון מסיסים (השווה מסלולים 3 ו -4 ).

גם שיתוף ביטוי יכול לשמש כדי לבצע בדיקות שלמה בין-מינים. בהתאם לכך, חשב שזה יכול להיות עניין להעריך את האינטראקציה בין תת-יחידות המשתייכות למנגנוני replicative של גראם + וגרמתי -. חיידקי radiodurans Deinococcus הוא גרם + חיידק, הכולל תת-יחידת α גדולה (1,335 חומצות אמינו, 150 KDA) ו מקטע ε משוער המכיל 197 חומצות אמינו. מעניין, ד ' מקטע ε radiodurans נטול הווה תחום C-המסוף בE. coli E. coli וד ' תת-יחידות ε radiodurans שווים ל -29% ו -59%, בהתאמה (בהתחשב באזור 1-178, ד 'radiodurans קואורדינטות). לassay כשירות של ד ' III מקטע radiodurans פולימראז α (α ד"ר) במחייב E. מקטע ε coli, יש לנו משובטים לתוך וקטור pBAD גן סינטטי קידוד עבור α ד"ר ויש לנו שיתוף הפך E. coli עם pBAD-α ד"ר וpGOOD-ε. בנוסף בו זמנית של IPTG וarabinose עד בינוני התרבות מפעיל את שיתוף הביטוי של α ד"ר וε (איור 3 א). העמותה של 2 חלבונים אלה נבדקה על ידי סינון ג'ל. תאי שיתוף להביע DNA פולימרז III יחידות משנה ד"ר וε α נאספו על ידי צנטריפוגה (XG 5000, 20 דקות), הושעה במאגר תמוגה, מופר על ידי sonication, והחלבונים המסיסים היו מיידייםly הועמס על עמודת Superdex 200 (איור 3). כאיור 3 ג תערוכות, כאשר השברים שנאספו היו נתונים לexonuclease '3'-5 ולמבחני פעילות DNA פולימרז, פסגות הפעילות התגלו באופן משמעותי השתנה עמדות, המצביע על כך α ד"ר אינו מוסמך במחייב E. מקטע ε coli. זה אושר כאשר aliquots של שברים 32, 36, ו -52 רוכזו ונותח על ידי SDS-PAGE. חלק 36 נמצא להכיל ד"ר α ולהיות נטול E. מקטע ε coli, ואילו חלק 52 הכיל E. coli ε אבל היה נטול α ד"ר (איור 3D).

נאמנות שכפול מסתמכת בעיקר על היכולת של polymerases DNA להפלות זוגות בסיס שגויים במהלך הארכת DNA. אף על פי כן, ניתן לשלב deoxynucleotides תואם ב 10 -4 תדר 20, והפעולהשל 3'-5 exonucleases 'הוא חיוני כדי להגיה גדיל DNA מסונתז החדש. יתר על כן, הוערך כי פעולת עריכת DNA זה מגבירה נאמנות שכפול על ידי 3 סדרי הגודל 20. בהתאם לכך, ניתן לבנות זני המוטטורי על ידי הפגיעה הגהה DNA, למשל, על ידי תנאי להביע גרסת mutagenic של א ' מקטע DNA פולימרז coli ε III. זה יכול להיות מושגת בניית גרסה של מוסמך ε במחייב α אבל נטול פעילות ההגהה שלה, ושליטה על הייצור של ε mutagenic על ידי מערכות ביטוי הולמות. באמצעות אסטרטגיה זו, שהראה כי א ' עליות תדירות המוטציה coli בתנאי גרימת גרסאות mutagenic של ε 11,21. עם זאת, אין כוונון עדין של תדר המוטציה בוצע על ידי זה אומר. חלבון שיתוף ביטוי יכול לשמש כדי להשיג שליטה טובה יותר של זני המוטטורי. למטרה זו, אנו משתפים הפכנו E. coli עםpBAD-ε וpGOOD1-εD12A, כדי לגרום לביטוי של wild-type וגרסת D12A mutagenic של ε עם arabinose וIPTG, בהתאמה. כמבחן פנוטיפי, קבענו את המראה של פעילות β-glucosidase, שהוא לא ברורים מאליהם (BGL -) בפרא-סוג E. coli 22,23. ניתן להעשיר את מוטציות ספונטניות יוכלו לנצל β-glucosides כמקורות פחמן (BGL +) או מבודדות באמצעות תקשורת נוזלית או מוצקה 23 24, בהתאמה. כאשר תאים מושרה להביע גרסת mutagenic D12A, פעילות β-glucosidase נרכשה בקירוב 20 דורות (איור 4 א). יש לציין כי מגמה דומה נצפתה בתאים מושרה-עישון (איור 4 א), סביר להניח כי שליטת תעתיק שהופעלה על pGOOD1 הוא לא דולף 11. אף על פי כן, כאשר מקטע ε wild-type היה מושרה, β-glucosidase לבד או בשילוב עם גרסת D12A,פעילות שנרכשה על ידי א ' coli ברמות מתונות (איור 4 א). פעילות β-glucosidase של BGL + מוטציות דווחה לנעה בין 3 ל -40 מיקרומטר / min 23. הרמה שנקבעה כאן בE. אוכלוסיות coli נתון לביטוי של εD12A היא הרבה יותר נמוכות, אבל זה צריך לקחת בחשבון שלא ינסו לבודד את BGL + מוטציות על תקשורת מוצקה.

איור 1
איור 1. Co-ביטוי של א ' פולימראז coli DNA III ליבת קטליטי. SDS-PAGE של חלבונים כולל מופקים E. () coli TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 גדלו בהעדר inducers, בנוכחות arabinose רק, של IPTG בלבד, או במדיום בתוספת שני arabinose וIPTG (נתיבי 1-4, בהתאמה). (B) ספיג (עיגולים ריקים) ופעילות exonuclease (עיגולים מלאים) של שברים המבודדים על ידי החשיפה לג'ל סינון חלבונים מסיסים המופקים מE. coli TOP10 ביתר α, ε, ותת-יחידות θ של א ' coli DNA Pol-III. (C) SDS-PAGE של שברים 6, 12, 23, 31, ו -41 (נתיבי 1-5, בהתאמה) דיווח בלוח ב '(D) SDS-PAGE של aliquot מרוכז של שבריר 23, שפעילות exonuclease וelectrophoretic דפוס מדווחים בלוחות B ו- C, בהתאמה. הודפס מחדש באישור מביוטכנולוגיה מכתבים, 33, קונטה et al:. "PGOODs: פלסמידים חדשים לשיתוף הביטוי של חלבונים בחיידק Escherichia"., 1815-1821 (2011) אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. proteolysis של א ' coli DNA פולימראז ε III למקטע. () השפלה של monomeric כפי שנחשף על ידי מערבי סופג של חלבונים המופקים מE. coli TOP10 ביתר באורך מלא או צורות קטועות של ε; ראשי חץ לציין את המיקום של 25 ו- 19 סמנים מולקולריים מוכתמים מראש kDa. הודפס מחדש באישור מElsevier מחלבונים Biochimica et Biophysica Acta ופרוטאומיקה, 1794, Bressanin et al:. "Proteolysis של מקטע הגהה שולטת בהרכבה של III ליבת קטליטי פולימראז Escherichia coli DNA", 1606-1615 (2009). Co-ביטוי של תת-יחידות α וε של א '(B) פולימראז coli DNA III ליבת קטליטי. SDS-PAGE של כולל (מסלולי 1 ו -3) ומסיס (נתיבים 2 ו -4) חלבון נוסףCTS מבודד מתאי overexpressing מקטע ε (נתיבי 1 ו -2), או α ויחידות משנת ε (מסלולים 3 ו -4).

איור 3
איור 3. שיתוף ביטוי של DNA פולימרז III תת-יחידות α וε מradiodurans Deinococcus וEscherichia coli, בהתאמה. () SDS-PAGE של תמציות חלבון כוללת מבודדות מהתאים לא מושרה (מסלול 1), או מושרה לביטוי יתר ד"ר α, ε, או α ד"ר וε (נתיבי 2-4, בהתאמה). (ב) chromatogram (עיגולים ריקים, ציר שמאלי) וריכוז חלבון של שברים (עיגולים מלאים, ציר ימני) eluted ליצור עמודת סינון ג'ל (Superdex 200) עמוסים חלבונים מסיסים המופקים מE. coli ביתר ד"ר αתת-יחידות ε nd. (C) הגהה (עיגולים ריקים, ציר שמאלי) וDNA פולימרז (עיגולים מלאים, ציר ימני) פעילויות של השברים שדווחו בלוח ב '(D) SDS-PAGE של aliquots המרוכז של שברים 32, 36, ו -52. אנא לחץ על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. תדירות מוטציה של א ' תאי coli נתון או לא לשתף ביטוי של wild-type וD12A גרסת mutagenic של מקטע DNA פולימרז ε III. המפה של pFINE פלסמיד החדש מצוינת גם כן. (א) פעילות β-glucosidase של א ' coli TOP10 לא מושרה (לא Ind) או נתון לביטוי יתר של מקטע ε wild-type (ערה), D12A mutagenic הגרסה (IPTG), או שניהם תת-יחידות ε wild-type וD12A (Ara + IPTG). פעילות β-glucosidase דווחה כפונקציה של דורות. מפה (B) של pFINE וקטור ביטוי החדש. האתר מרובה השיבוט (MCS) של פלסמיד זו זהה לנוכחים בוקטורי pBAD וpGOOD התואמים, ומאפשר לי טלטלות קלילה של גנים ביניהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חלבונים יכולים להיות במהות סדר, הכוללים אזורים שיישוני מבנה אינו מוגבלת למספר מצומצם של תצורות 25. חלבוני הפרעות אלה הם בדרך כלל נוטים לצבירה 25, והבידוד והאפיון שלהם עשוי לייצג משימה קשה. מקטע ε של א ' פולימראז coli DNA III כולל שני תחומים שונים 26,27, כלומר: תחום N-ter i), הנושא את פעילות exonuclease '3'-5, ומוסמך במחייב מקטע θ; ii) תחום C-ter, אחראי לקשירה לα המקטע (פולימראז). תחום C-ter של ε ידוע להעניק מסיסות עניה לחלבון זה, קידום הצבירה שלו. זה אכן הודגם כי ε-186, גרסה מקוצרת של החלבון נטול תחום C-ter, היא מסיסים, ויכולים להיות מטוהרים עם תשואות גבוהות 17. עם זאת, כאשר האינטראקציה של ε עם α יש להיחקר כמותית(לדוגמא, כדי לקבוע את K D של מתחם αε), טיהור ε באורך מלא נדרש, רומזת משימה קשה ביוכימיים. במסגרת זו, שיתוף ביטוי חלבון מספק הערכות איכותיות של הכריכה של ε לα. הראינו כי ניתן להשיג תשואות גבוהות של מתחם αεθ in vivo על ידי שיתוף ביטוי (איור 1), תוך עקיפת עני המסיסות של מקטע ε. למרבה הפלא, טיהור המורכבת αεθ ביטוי יתר דווחה 28,29. גם אסטרטגית שיתוף הביטוי יכולה לשמש כדי לבדוק אם ההכנסה של מוטציות ספציפיות לאתר באחד מהשותפים באינטראקציה פוגעת היווצרות מורכבת. בהתאם לכך, שיתוף ביטוי חלבון מהווה כלי נוח ומהיר לביצוע בדיקות איכותיות של אינטראקציה בין חלבונים. כמו כן יש לציין כי מערכת שיתוף הביטוי שלנו מסתמכת על 2 inducers, כלומר, arabinose וIPTG שונים. לכן, ניתן לבצע בקרות מתאימות בקלות כאשר בודקים את היווצרות חלבון מורכב, למשל, השמטת inducer אחד ממדיום גידול החיידקים (איור 1 א).

הצגנו כאן הליך מותאם לשיתוף הביטוי של α ויחידות משנת ε של א ' פולימראז coli DNA III. כאשר פרוטוקול זה תוכנן ונבדק, את הפרמטרים הבאים זוהו כקריטי להצלחה של ניסויי שיתוף ביטוי: i) בטמפרטורה שבי האינדוקציה מבוצעת; ii) הזמן באורך של אינדוקציה; iii) את הריכוז של inducer () s. בפרט, לא הצליחו להשיג מסיס αεθ 11 מורכבים מהתאים המושרה על 37 מעלות צלזיוס, באופן עצמאי מהזמן האינדוקציה. לפיכך, אנו ממליצים לבדוק את הטמפרטורות שונות לצעד האינדוקציה, וכדי לבדוק את ביטוי היתר של חלבונים כפונקציה של זמן. בנוסף, ההערכה המקבילה של שיתוף ביטוי בהבדלerent E. זני coli יכולים להיות לעזר כאשר מול תשואות מתונות של חלבוני היעד.

יש לנו דיווח כאן ניסוי נציג מבוצע על מנת לבחון את הכריכה של חלבונים ממינים שונים, והראה ששיתוף ביטוי החלבון הוא שימושי כדי לבדוק במהירות את הקשר בין 2 חלבוני Heterologous למורכב תפקודי היברידי. כרומטוגרפיה סינון ג'ל שימשה כאן כדי להעריך היווצרות מורכבת (איור 3). עם זאת, ההכנסה של תג מתאים לאחד מהשותפים באינטראקציה יכולה להקל על הערכה זו, ומאפשרת שימוש בשיטות לכידה זיקה. כדי למנוע הפרעה של התג עם אינטראקציות בין חלבונים, הקוד הגנטי לאחד מהשותפים באינטראקציה יכולה להיות מוכנס במקביל לpBAD / וpBAD כלי- Myc וקטורים /, בהתאמה המקנה מוטיב hexahistidine בN- וC -terminus של חלבון המטרה.

E. coli mutatoזני r כוללים תדרי מוטציה גבוהים יותר מאשר עמיתיהם הסוג הברים. זני המוטטורי הם עניין בביוטכנולוגיה 30, למשל, להתפתח זן יעד לרומן, רצוי, פנוטיפים במהירות. אנו ניתנים כאן עדות לכך שהשיתוף מבטא את wild-type ומקטע ε mutagenic של א ' coli DNA פולימראז III, תדירות המוטציה של מארח החיידקים יכול להיות מכוון עם נוחות מספיק. כדי לשפר את הטכנולוגיה הזו עוד יותר, וקטורי ביטוי בחוזקה מוסדרים נחוצים כדי לדכא ככל האפשר הביטוי של גרסת D12A מאוד mutagenic של מקטע ε. בפרט, זה יהיה מעניין לבחון את תדירות המוטציה בE. coli הפך עם pBAD-εD12A וpGOOD1-ε, כלומר, חלופת תצורה לזה שהוצג כאן. וקטורי pBAD אכן ידועים להיות מוסדר 12 בחוזקה, ותכונה זו יכולה לעזור בשמירה על הריכוז הבסיסי של εD12Aברמות נמוכות.

דוגמאות לשיתוף ביטוי חלבון דיווחו כאן להעיד ריבוי הפנים של טכניקה זו. עם זאת, חשוב לשים לב כי שימוש בריבוי של פלסמידים תואמים בE. אחת תאי coli יכולים להרחיב באופן משמעותי את האתגרים שיכולים להיות נלקח על ידי שיתוף ביטוי חלבון. בשנים האחרונות, עבודה אינטנסיבית הוקדשה להרחיב את הרפרטואר של פלסמידים תואמים לשמש לשיתוף ביטוי חלבון. בפרט, מערכת משולשת הסתמכות על פלסמידים תואמים הנושאים את מקורות ColE1, p15A, וpSC101 של שכפול שימשה לשני חלבונים חיידקיים ויונקי שיתוף לבטא 31. לאחרונה, מערכת שיתוף ביטוי רבעונים דווחה. במקרה זה, 13 גנים Heterologous היו שיתוף באו לידי ביטוי בE. coli שיתוף הפך עם 4 וקטורי ביטוי תואמים, המכיל את ColE1, p15A, CloDF13, ומקורות RSF של שכפול 32. מערכת שיתוף ביטוי זה בהצלחה המשמשת לייצור בE. coli hydrogenase המסיס תפקודי הפעיל אני מfuriosus Pyrococcus 32. להגדלת מערכת בינארית שלנו, בנינו וקטור ביטוי חדש, pFINE, המכילים את המוצא pSC101 של שכפול, קלטת neomycin-התנגדות, ואלמנטים לאק רגולציה (איור 4). פלסמיד זה מכיל את אותו נוכחי polylinker בוקטורי pBAD וpGOOD, ובכך להקל גן הלוך בין 3 המרכיבים של מערכת שיתוף הביטוי. למרות pFINE הוא פלסמיד עותק מספר נמוך, יציבותה נמצאה משביע רצון כאשר נבדקו במדיום עשיר. בימים אלו אנו עוסקים בהרחבה נוספת של מערכת שיתוף הביטוי המשולש שלנו. למטרה זו, אנו נבנו נגזרים pBAD מכיל קלטת כלורמפניקול-התנגדות, ואנחנו בדרך להחליף את מקור ColE1 של שכפול עם אחד בקנה אחד עם ColE1, p15A, וpSC101. זה אכן דעתנו כי השימוש בפלסמידים מרובים בE. אחת נציג תאי coliמתמרמר כלי רב עוצמה לאתגר את ביטוי in vivo של קומפלקסי חלבונים מורכבים ממספר רב של תת-יחידות שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

הרשות על ידי Springer וElsevier הדפס דמויות היא הודתה מאוד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ampicillin Sigma-Aldrich A9518
Chloroform Sigma-Aldrich 288306
EDTA Sigma-Aldrich EDS
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
INT Sigma-Aldrich I8377
IPTG Sigma-Aldrich I5502
KCl Sigma-Aldrich P9541
L-Arabinose Sigma-Aldrich A3256
MgCl2 Sigma-Aldrich M2670
NaCl Sigma-Aldrich 31434
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PNP-gluc Sigma-Aldrich N7006
pNP-TMP Sigma-Aldrich T0251
Tetracyclin Sigma-Aldrich 87128
Trizma base  Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Sigma-Aldrich 95039
Yeast extract Fluka 70161
Acrylamide solution 30% BioRad 161-0158 For gel electrophoresis
Ammonium persolphate BioRad 161-0700 For gel electrophoresis
Glycine BioRad 161-0718 For gel electrophoresis
SDS BioRad 161-0302 For gel electrophoresis
TEMED BioRad 161-0800 For gel electrophoresis
Tris BioRad 161-0719 For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm BioRad 1652089 For electroporation
Centrifuge 5415R Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation BioRad
Microplate Reader 550 Biorad
MiniProtean 3 cell BioRad
Power Supply BioRad
Sonicator 3000 Misonix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
  2. Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
  3. Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
  4. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  5. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
  6. Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
  7. Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
  8. Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
  9. Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
  10. Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
  11. Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
  12. Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  13. McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
  16. Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
  17. DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
  18. Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
  19. Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
  20. Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
  21. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  22. Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
  23. Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
  24. Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
  25. Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
  26. Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
  27. Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
  28. Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
  29. Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
  30. Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
  31. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  32. Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).

Tags

ביוכימיה גיליון 96, זני המוטטורי DNA פולימרז חלבון שיתוף ביטוי פלסמידים תואמים בדיקת שלמה III
תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte,… More

Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (96), e52431, doi:10.3791/52431 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter