Introduction
Införandet av överuttryck teknik ökas antingen de biokemiska studier av låg-kopietal enzymer och industriell produktion av farmakologiskt aktiva proteiner (t.ex. insulin). Sedan tillkomsten av dessa tekniker, har betydande framsteg gjorts för att öka avkastningen och kvaliteten av rekombinanta proteiner. Dessutom var prokaryota 1,2 och eukaryota 3 överuttryck system utvecklats under åren, som erbjuder användbara alternativ till "arbetshäst" av protein bioteknik, dvs Escherichia coli. I synnerhet tillgången till alternativa plattformar till E. coli ledde till produktion av rekombinanta peptider eller proteiner som bär post-translationella modifieringar. Det bör dock nämnas att E. coli representerar fortfarande organismen i valet för rekombinant proteinproduktion. Detta beror på flera faktorer, bland vilka de mest relevanta kan varabeaktas: i) tillgången till ett stort antal överuttryck system (expressionsvektorer och stammar) för E. coli 1,2; ii) den korta generationstider och hög avkastning biomassa, av E. coli i en mängd rik och syntetiska medier; iii) facile manipulering antingen på den biokemiska och på genetisk nivå av denna mikroorganism; iv) isolering av stammar som kan produktion av toxiska proteiner 4; v) byggandet av stammar terar homogen induktion på befolkningsnivå 5,6. Dessutom har nyligen visat att uttryckssystem lämpliga för framställning i E. coli av post-translation modifierade proteiner kan utformas och konstrueras 2.
För närvarande, är proteinuttryck används främst för att erhålla monomera eller homo-oligomera proteiner, vilkas hypersynthesis kan utföras med en enda gen klonas in i en lämplig plasmid. Men uppmärksamhet var nyligenbetalas till byggandet av E. coli protein co-expressionssystem, utmanande produktion, in vivo, av hetero-oligomera komplex 2. Intressant, tidiga experiment protein samtidigt uttryck tog upp mellan djurarter montering av stora och små subenheter av cyanobakterier ribulos-1,5-bisfosfatkarboxylas / oxigenas 7,8, och föreningen av stympade och fullängds former av HIV-1 omvänt transkriptas 9. Dessa banbrytande studier visade att protein samuttryckning utgör ett kraftfullt alternativ till traditionella in vitro beredning. Dessutom protein samuttryck i E. coli användes för att producera olika proteiner som bär post-translationella modifieringar 2, för att erhålla proteiner innehållande onaturliga aminosyror 2, och för att öka utbytet av överuttryckta membranproteiner 2. Dessutom, för att den potential som protein samuttryckning som verktyg ge till E. coli tävlaIOU i proteinutsöndring är under aktiv utredning 2.
Två huvudstrategier för protein samtidigt uttryck i E. coli kan eftersträvas: i) användandet av en enda plasmid som värd för olika gener som ska överuttryckt; ii) användningen av multipla plasmider i enstaka celler att samuttrycka målproteinerna. I det första fallet, gör kriterierna för valet av plasmiden inte skiljer sig från traditionella enkla proteinöveruttryck experiment, även om vissa plasmider innehåller tandem promotor / operatörselement byggdes för samtidigt uttryck 10. Denna första metoden är därför ganska enkelt. Det bör dock nämnas att användningen av en enda plasmid att co-uttrycka olika proteiner står inför två stora svårigheter: i) molekylvikt av vektor ökar med antalet av värd gener, begränsar antalet samuttryckta proteinerna; ii) när multipla gener klonas under kontroll av en enda promotor, polaritet kan decrease expressionen av generna distala från promotorn. Användningen av dubbla eller multipla plasmider i enstaka E. coli-celler måste åstadkomma förenlighet vektor av val, därför införa begränsningar för de stödberättigade kombinationer av plasmider. Emellertid, denna andra samexpression strategin finns den fördelen innehållande molekylmassan för vektorer, och begränsar polaritet. Vi konstruerade nyligen en protein co-expressionssystem för att underlätta skytt av gener mellan co-expressionsplasmidema 11. Särskilt konstruerade vi pGOOD vektor serien, de relevanta delarna av dessa är: i) en p15A replikationsstart, för att ge kompatibilitet av pGOOD plasmider med de kommersiella vektorer som innehåller ursprunget ColE1 (t.ex. pBAD serien 12); ii) en tetracyklinresistens kassetten; iii) förekomsten av lac-härledda regulatoriska element, dvs Promotorn-Operator (O 1) par och lacl q-genen. Använda en lämplig pBAD-pGOOD par, kunde vi överuttrycker den katalytiska kärnan i E. coli DNA-polymeras III, som består av tre olika subenheter, dvs α (5'-3 'polymeras), ε (3'-5' exonukleas) och θ (stabiliserande ε) 13. I synnerhet visade vi att samuttrycket av αεθ komplexet var strikt beroende av tillägg till E. coli-odlingsmedium av både IPTG och arabinos, utlöser överuttryck från pGOOD och pBAD, respektive (Figur 1A).
I denna rapport, visar vi hur protein samtidigt uttryck effektivt kan lösa problem som är kopplade till den dåliga lösligheten av ett proteinkomplex subenhet. Dessutom visar vi hur in vivo proteinkompletterings tester kan utföras, och vi slutligen rapportera om användningen av protein samexpression att avstämma mutationsfrekvensen i E. coli. För detta syfte använde vi pGOOD-pBAD par lämpliga för att illustrera relevanta exempel på varje fallstudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av E. coli Co-transformanter
- Förbered elektro behöriga celler av lämplig E. coli-stammen som skall transformeras. Överföring till 1 ml av LB-medium (trypton, jästextrakt, NaCl vid 10, 5 och 10 g / L, respektive) en enda koloni av stammen enligt val, och inkubera vid 37 ° C under skakning förhållanden 180 rpm. Späd förkulturen 1: 500 i 25 ml färskt LB-medium och inkubera kulturen vid 37 ° C.
- Vid log-fas (0,6 OD) Centrifugera cellerna suspensionen vid 5000 xg under 20 min) och återsuspendera pelleten i 10%, volym / volym iskall steril glycerol-vatten i hälften av den ursprungliga odlingsvolymen. Upprepa detta steg 4 gånger, halvera varje gång resuspension volymen. Slutligen resuspendera pelleten i glycerol / vatten och delar upp celler suspension i 50 | il alikvoter. Förvara alikvoter vid -80 ° C upp till 6 månader.
- Lös den önskade plasmiden i sterilt vatten kompletterat med 0,5 mM EDTA. Tina på ICe en alikvot av elektrokompetenta celler och blanda med en lämplig mängd (2,5-5 ng) av vektorn. Dispensera blandningen i en 0,1 cm kuvett lämplig för elektroporering och tillämpa 1,8 kV.
- Överför omedelbart de elektroporerade cellerna i 1 ml SOC-medium (LB-medium kompletterat med 0,2% vikt / volym glukos, 10 mM MgCl2, 2,5 mM KCl), inkubera i 1 h under skakning och slutligen överföra 100 fil alikvoter till petriskålar innehållande LB-agar med ett lämpligt antibiotikum. Inkubera O / N vid 37 ° C.
- Rena transforman genom utstrykning enstaka kolonier på petriskålar.
- Förbered elektro behöriga celler av de primära transformanter och upprepa steg 1,1-1,5 för att omvandla vidare plasmider.
- Förbered glycerol lager av co-transformanter. Överför en enda koloni i LB kompletterat med lämpliga antibiotika, inkubera vid 37 ° C under skakning och vid log-fas (0,6 OD) Centrifugera cellerna suspensionen vid 5000 xg under 20 min. Resuspend pelleten i LB-antibiotika-medium innehållande 15% volym / volym glycerol. Fördela i alikvoter och förvaras vid - 80 ° C.
2. Co-uttryck av α och ε subenheter av E. coli DNA-polymeras III
- Överför med en steril ögla en liten mängd av den lämpliga stammen glycerolstam (t.ex. Top10 / pGOOD-ε243 och Top10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, se figur 1) i en petriskål innehållande LB-medium och antibiotika. Låt cellerna fjädring torrt på petriskål, och strimma cellerna droppe. Inkubera vid 37 ° CO / N.
- Överför med en steril tandpetare, en enda koloni till 1 ml LB-antibiotika medium. Inkubera 8 h vid 37 ° C. Späd förkulturen 1: 500 i färskt medium och inkubera vid 30 ° C under 15 h.
- Lägg IPTG, arabinos eller arabinos och IPTG, 1 mm vardera. Inkubera vid 30 ° C under 2,5 h. Samla cellerna, och lagra pellets vid -20 ° C.
- Tina pellets på is och återsuspendera i lysbuffert (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), pH 8). Homogenisera Försiktigt celler fjädring med ett kallt glas potter.
- Sonikera vid 15 W under 15 sekunder, följt av 15 sek kylningsintervall (4 cykler).
- Centrifugera de totala proteinextrakten vid 10.000 xg under 20 min, vid 4 ° C för att återvinna den lösliga fraktionen.
- Analysera genom SDS-PAGE (12,5% akrylamid) alikvoter av varje lösligt proteinextrakt. För detta syfte, överföra 20 | il av varje lösligt protein extrakt till Eppendorf-rör innehållande 60 ^ il H2O och 20 ^ il laddningsbuffert (250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% (vikt / volym) SDS, 50% (volym / volym) glycerol, 0,25% (vikt / vol) bromfenolblått) och koka under 5 min. Load 18 pl av varje prov och utföra elektrofores vid 140 V under ca 1,5 tim.
3. Co-uttryck av α-subenheten av DeinococCUS radiodurans DNA-polymeras III och ε subenheten av E. coli DNA-polymeras III
- Förbered en pre-kultur av E. coli stam Top10 / pBAD-α Dr / pGOOD-ε243 i 1 ml LB-ampicillin-tetracyklin-medium och inkubera 8 h vid 37 ° C. Späd 1: 1000 i färskt medium och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Späd 1: 100 till 200 ml färskt medium, inkubera vid 37 ° C under 3 h, sedan inducera för 3 h med arabinos och IPTG, 1 mM vardera. Skörda cellerna, och lagra pelleten vid -20 ° C.
- Återsuspendera pelleten i 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogenisera och störa cellerna som beskrivs i 2.4 och 2.5.
- Centrifugera Omedelbart cellerna lysatet vid 10.000 xg under 20 min. Kassera pelleten. Filtrera supernatanten med en Biichner-tratt utrustad med tre lager av pappersfilter. Applicera mild vakuum. För att undvika överdriven skumning, hålla vakuumet Erlenmeyerkolv på is under filtreringen.
- Bestäm proteinkoncentration enligt Bradford 14.
4. Gelfiltreringskromatografi
- Jämvikta en vattenmantlad 16x70 (200) gelfiltreringskolonn med 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Belastning på kolonnen den lösliga proteinextraktet. För optimal upplösning, använd en 1 ml provslinga. Utför kromatografi på 0,6 ml / min. Håll kolonntemperatur vid 4 ° C under hela.
- Samla 0,9 ml fraktioner och analysera dem genom SDS-PAGE. Överför 20 ul av varje relevant fraktion till Eppendorf-rör innehållande 60 ^ il H2O och 20 ^ il laddningsbuffert (250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 mM β-merkaptoetanol, 10% (vikt / volym) SDS, 50% ( vol / vol) glycerol, 0,25% (vikt / vol) bromfenolblått) och koka under 5 min. Load 18 pl av varje prov och utföra elektrofores vid 140 V under ca 1,5 tim.
- Bestäm 3'-5 'exonukleas och DNA-polymerasaktiviteten för varje fraktion i 96-vill mikroplattor. Analysera exonukleasaktiviteten med användning tymidin 5'-monofosfat-p-nitrofenylester (p NP-TMP) som substrat 15. Uppskatta DNA-polymerasaktivitet med hjälp av PPX (pyrofosfatas, purinnukleosidfosforylas, Xantinoxidas) enzym-kopplad analys 16 och 2- (4-jodfenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5-fenyl-2H-tetrazoliumklorid (INT) som elektronacceptor 16.
5. Mutation Analys av populationer Co-uttrycker vildtyp ε subenheten av E. coli DNA-polymeras III och Mutagen εD12A Variant
- Överför enstaka koloni av E. coli TOP10 innehåller pBAD-ε och pGOOD1-εD12A 11 vektorer till 1 ml LB-antibiotika medium. Inkubera O / N vid 37 ° C.
- Späd förkulturen 1: 250 i 3 flaskor innehållande färskt medium (10 ml), lägga till lämpliga inducerare (arabinos, IPTG eller arabinos och IPTG, 1 mM vardera) och inkubera vid 37 ° Cför 8 timmar. Förbered i parallella icke-inducerade kulturer.
- Samla portioner av 1 ml, sedan späd 1: 500 i nya kolvar innehållande färskt medium (10 ml) kompletterat eller inte med lämpliga inducerare. Inkubera O / N vid 37 ° C.
- Upprepa steg 5.2 och 5.3 och samla portioner av 1 ml.
- Bestäm antal generationer inträffade i varje kultur. Transfer på LB-plattor, 100 pl lämpliga serieutspädningar av inokulat och kultur. Inkubera O / N vid 37 ° C. Räkna kolonier på LB-plattor, och beräkna logaritmen av antalet celler närvarande i inokulumet (log I) och i odlingen vid slutet av tillväxten (log C). För att bestämma antal generationer, använd formeln: (log C - log I) /0.301.
- Centrifugera vid 5000 xg under 20 min och återsuspendera cellerna i 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Att permeabilize cellerna, till 2-3 droppar kloroform och skaka i 20 sekunder.
- Bestäm β-glukosidasaktivitet av varje alikvot i en 96-brunnars mikroplatta, med användning av p-nitrofenyl-β-D-glukopyranosid (PNPGluc) som substrat. Lägg till varje brunn 100 pl av permeabiliserade celler och 100 | il substrat (16 mg / ml stamlösning i H2O). Var noga med att undvika luftbubblor i brunnarna. Läs av absorbansen vid 420 nm, med användning av en mikroplattläsare och lämpligt filter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ε subenheten av E. coli DNA-polymeras III består av 243 aminosyror och har dålig löslighet 17,18, om inte resterna 187-243 raderas 17. Vi har dock tidigare visat 11 att samtidigt uttryck av fullängds α, ε, och θ subenheter ger lösligt DNA-polymeras III katalytisk kärna (Figur 1). I synnerhet, med pBAD-pGOOD sam-expressionssystem visade vi att: i) kan överuttryck av α och ε subenheter oberoende kontrolleras av arabinos och IPTG, respektive (Figur 1A); ii) fullängds ε subenhet kan detekteras i lösliga proteinextrakt isolerade från E. coli-celler som överuttrycker α, ε, och θ och utsattes för gelfiltrering (Figur 1B). I detta fall var exonukleasaktivitet fördelad i 3 huvudtoppar (Figur 1B, fyllda cirklar), och toppen centrerad vid fracning 23 visades innehålla den αεθ katalytiska kärnan (figurerna 1C och 1D). Stabiliteten i ε är kraftigt förhöjd vid bindning till α och θ. När vi tidigare överuttryckt fullängds ε i E. coli, en låg mängd fri ε detekterades genom western blotting i löslig proteinextrakt 19 (Figur 2A). Det är intressant att notera att, på samma villkor, alltid upptäcks vi högre mängder fria C-ter stympade former av ε (ε-234, ε-228, ε-213, eller ε-186), bland vilka ε-186 presterat bättre 19 (Figur 2A). Vi gjorde också visa att proteolys av ε C-terminal domän förhindras genom bindning till α och θ subenheter 19. Effekten, om någon, av samuttryck på lösligheten av ε lätt kan testas. Som rapporterats i figur 2B, lösliga proteinextrakt isolerat från celler som överuttryckerα, ε, eller α och ε kan analyseras med SDS-PAGE, och enkelt jämfört med de totala proteinextrakt. I detta fall indikerar den elektroforetisk analys att när uttrycks ensam, ε subenheten funktioner dålig löslighet (jämför bana 1 och 2), medan samexpression av α förbättrar i hög grad av koncentrationen av ε i lösliga proteinextrakt (jämför spår 3 och 4 ).
Samexpression kan också användas för att utföra inter arter komplemente tester. Således tänkte vi att det kunde vara av intresse att utvärdera samspelet mellan subenheter som tillhör de replikativa maskinerier av Gram + och Gram -. Bakterier Deinococcus radiodurans är en Gram + bakterie, med en stor α subenhet (1335 aminosyror, 150 kDa) och en förmodad ε subenhet innehåller 197 aminosyror. Intressant, D. radiodurans ε subenhet saknar den C-terminala domänen närvarande i dess E. coli E. coli och D. radiodurans ε subenheter är lika med 29% och 59%, respektive (med tanke på området 1-178, D. radiodurans koordinater). För att analysera kompetens D. radiodurans polymeras III α subenhet (α Dr) i bindande E. coli ε subenhet har vi klonat in i pBAD vektorn en syntetisk gen som kodar för α Dr och vi har samar förvandlat E. coli med pBAD-α Dr och pGOOD-ε. Den samtidiga tillsatsen av IPTG och arabinos till odlingsmediet utlöser samuttryck av α Dr och ε (figur 3A). Associationen av dessa två proteiner testades genom gelfiltrering. Celler som samuttrycker DNA-polymeras III α Dr och ε subenheter uppsamlades genom centrifugering (5000 xg, 20 min), suspenderades i lyseringsbuffert, sönderdelas genom sonikering och de lösliga proteinerna var omedelbarly lastas på en Superdex 200 kolonn (Figur 3B). Som figur 3C visar, när de uppsamlade fraktionerna utsattes för 3'-5 'exonukleas och DNA-polymeras aktivitetsanalyser, var aktivitetstoppar detekteras vid betydligt skiftade positioner, vilket tyder på att α Dr inte är behörig i bindning E. coli ε subenheten. Detta bekräftades när alikvoter av fraktionerna 32, 36, och 52 koncentrerades och analyserades genom SDS-PAGE. Fraktion 36 befanns innehålla α Dr och sakna E. coli ε subenhet, medan fraktion 52 innehöll E. coli ε men saknade α Dr (Figur 3D).
Replikering trohet stöder sig främst på förmågan hos DNA-polymeraser att diskriminera felaktiga basparen under DNA-förlängning. Ändå kan inkompatibla deoxinukleotider införlivas vid 10 -4 frekvens 20, och de åtgärderav 3'-5 'exonukleaser är väsentligt att korrekturläsa den nysyntetiserade DNA-strängen. Dessutom uppskattades detta DNA redigering åtgärd ökar replikering trohet med 3 tiopotenser 20. Följaktligen kan mutatorstammar konstrueras genom att försämra DNA korrekturläsning, t.ex. genom villkor uttrycka en mutagen variant av E. coli DNA-polymeras III ε subenhet. Detta kan erhållas konstruera en variant av ε behörig i bindning α men saknar dess korrekturläsning aktivitet, och att kontrollera produktionen av mutagen ε genom lämpliga expressionssystem. Med användning av denna strategi, visades det att E. coli mutationsfrekvensen ökar under förhållanden som inducerar mutagena varianter av ε 11,21. Dock ingen finjustering av mutationsfrekvensen uppnås genom detta innebär. Protein samexpression kan användas för att erhålla en bättre kontroll av mutatorstammar. För detta syfte, vi samar transformerad E. coli medpBAD-ε och pGOOD1-εD12A, i syfte att inducera expression av vildtyp och den mutagena D12A variant av ε med arabinos och IPTG, respektive. Som en fenotypisk test bestäms vi uppkomsten av β-glukosidasaktivitet, vilket är kryptisk (Bgl -) i vildtyp E. coli 22,23. Spontana mutanter kunna utnyttja β-glukosider som kolkällor (Bgl +) kan berikas eller isoleras med hjälp flytande 23 eller fasta medier 24, respektive. När celler inducerades att uttrycka D12A mutagena varianten, var β-glukosidasaktivitet förvärvats i ca. 20 generationer (figur 4A). Det bör noteras att en liknande trend observerades i icke-inducerade celler (Figur 4A), troligen på grund av att transkriptionskontroll utövas på pGOOD1 är ganska läckande 11. Ändå, när vildtyp ε subenhet inducerades, ensamt eller i kombination med D12A varianten, β-glukosidasaktivitet förvärvades av E. coli vid måttliga nivåer (Figur 4A). Den β-glukosidasaktivitet av Bgl + mutanter rapporterades till mellan 3 och 40 ^ M / min 23. Nivån bestäms här i E. coli populationer utsätts för uttrycket av εD12A är mycket lägre, men det bör övervägas att vi inte försöka isolera Bgl + mutanter på fasta medier.
Figur 1. Samexpression av E. coli DNA-polymeras III katalytisk kärna. (A) SDS-PAGE av totala proteinerna extraherade från E. coli TOP10 / pBAD-α1160 / pGOOD-ε243 odlas i frånvaro av inducerare, i närvaro av arabinos endast, av IPTG endast, eller i medium kompletterat med både arabinos och IPTG (spår 1-4, respektive). (B) Absorbans (tomma cirklar) och exonukleasaktivitet (fyllda cirklar) av fraktioner isolerade genom att utsätta för gelfiltrering lösliga proteiner extraherade från E. coli TOP10 överuttrycker α, ε, och θ subenheter av E. coli-DNA-Pol-III. (C) SDS-PAGE av fraktionerna 6, 12, 23, 31, och 41 (banorna 1-5, respektive) rapporteras i panel B. (D) SDS-PAGE av en koncentrerad alikvot av fraktion 23, vars exonukleasaktivitet och elektrofore mönster redovisas i panelerna B och C, respektive. Återges med tillstånd från Biotechnology Letters, 33, Conte et al:. "PGOODs: nya plasmider för samtidigt uttryck av proteiner i Escherichia coli"., 1815-1821 (2011) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Proteolys av E. coli DNA-polymeras III ε subenhet. (A) Nedbrytning av mono vilket framgår av western blotting av proteiner som extraherats från E. coli TOP10 överuttrycker fullängds eller stympade former av ε; pilspetsar ange positionen för 25 och 19 kDa pre-färgade molekylära markörer. Omtryckt med tillstånd från Elsevier från Biochimica et Biophysica Acta proteiner och proteomics, 1794, Bressanin et al. "Proteolys av korrekturläsning subenheten styr montering av Escherichia coli DNA-polymeras III katalytisk kärna", 1606-1615 (2009). (B) Samuttryck av α och ε subenheter av E. coli DNA-polymeras III katalytisk kärna. SDS-PAGE av totala (banorna 1 och 3) och lösliga (spår 2 och 4) -protein extracts isolerade från celler som överuttrycker ε subenheten (spår 1 och 2), eller α och ε subenheter (spår 3 och 4).
Figur 3. Co-uttryck av DNA-polymeras III α och ε subenheter från Deinococcus radiodurans och Escherichia coli, respektive. (A) SDS-PAGE av totala proteinextrakt som isolerats från celler som inte inducerade (bana 1), eller inducerade för att överuttrycka α Dr, ε, eller α Dr och ε (banorna 2-4, respektive). (B) Kromatogram (tomma cirklar, vänstra axeln) och proteinkoncentration av fraktionerna (fyllda cirklar, höger axel) eluerades bilda en gelfiltreringskolonn (Superdex 200) laddad med lösliga proteiner extraherade från E. coli som överuttrycker α Dr ennd ε subenheter. (C) Korrekturläsning (tomma cirklar, vänster axel) och DNA-polymeras (fyllda cirklar, höger axel) verksamhet fraktionerna som redovisas i panel B. (D) SDS-PAGE av koncentrerade portioner av fraktionerna 32, 36 och 52. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. mutationsfrekvens på E. coli-celler utsattes eller inte till co-expression av vildtyp och den mutagena varianten D12A av DNA-polymeras III ε subenhet. Kartan över den nya plasmiden pFINE visas också. (A) β-glukosidas-aktivitet i E. coli TOP10 inte inducerade (Nej Ind) eller underkastas uttryck av vildtyp ε subenhet (Ara), den mutagena varianten D12A (IPTG), eller båda vildtyp och D12A ε subenheter (Ara + IPTG). Den β-glukosidas-aktivitet redovisas som en funktion av generationer. (B) Karta över den nya expressionsvek pFINE. Det multipla kloningsstället (MCS) av denna plasmid är identisk med de som är närvarande i de kompatibla pBAD och pGOOD vektorer, som möjliggör enkel shuttling av gener mellan dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteiner kan vara inneboende oordnad, med regioner som tertiär struktur är inte begränsad till ett begränsat antal konformationer 25. Dessa oordnade proteiner är oftast utsatta för aggregering 25, och deras isolering och karakterisering kan utgöra en svår uppgift. Den ε subenheten av E. coli DNA-polymeras III har två distinkta domäner 26,27, nämligen: i) N-ter-domän, med 3'-5 'exonukleasaktivitet och kompetent i bindning av θ subenheten; ii) C-ter-domänen, är ansvarig för bindning till α (polymeras) subenhet. Den C-ter domän ε är känd för att ge dålig löslighet till detta protein, främja dess aggregering. Det var visserligen visat att ε-186, en trunkerad form av proteinet som saknar den C-ter-domänen, är löslig, och kan renas med höga utbyten 17. Men när samspelet mellan ε med α har att kvantitativt studeras(T.ex. för att bestämma K D i αε komplexet), är rening av fullängds ε krävs, vilket innebär en svår biokemisk uppgift. I denna ram, ger protein samtidigt uttryck kvalitativa uppskattningar av bindningen av ε att α. Vi har visat att höga utbyten av den αεθ komplexet kan erhållas in vivo genom samexpression (figur 1), förbi den dåliga lösligheten av ε subenhet. Anmärkningsvärt, har rening av överuttryckt αεθ komplex rapporterats 28,29. Samuttrycket strategi kan också användas för att testa huruvida införandet av platsspecifika mutationer i en av de samverkande parterna försämrar komplexbildning. Följaktligen representerar protein samexpression ett bekvämt och snabbt verktyg för att utföra kvalitativa tester av protein-proteininteraktion. Det bör också noteras att vår sam-expressionssystem förlitar sig på två olika inducerare, dvs, arabinos och IPTG. Därför kan lämpliga kontroller enkelt utföras vid test av bildningen av ett proteinkomplex, t.ex., utelämnar en inducerare från bakterietillväxtmediet (Figur 1A).
Vi presenteras här ett optimerat förfarande för sam-expression av α och ε subenheterna av E. coli DNA-polymeras III. När detta protokoll utformades och testades, erhölls följande parametrar identifierats som avgörande för framgången av sam-expressionsexperiment: i) den temperatur, vid vilken induktion utförs; ii) tidslängd induktion; iii) koncentrationen av inducerare (er). Framför allt kunde vi inte få lösligt αεθ komplex 11 från celler inducerade vid 37 ° C, oberoende av induktionstiden. Vi föreslår därför att testa olika temperaturer för induktionssteget, och att kontrollera den överexpression av proteiner som en funktion av tiden. Dessutom parallell utvärdering av samarbete uttryck i difftekniker när E. coli-stammar kan vara till hjälp när man står inför moderata utbyten av målproteiner.
Vi har rapporterat här ett representativt experiment utfördes för att testa bindningen av proteiner från olika arter, och vi har visat att protein samexpression är användbart för att snabbt testa associationen av två heterologa proteiner till en hybrid funktionellt komplex. Gelfiltreringskromatografi användes här för att utvärdera komplexbildning (figur 3). Emellertid kunde insättning av en lämplig tagg till en av de interagerande partners lätta denna utvärdering, låter användningen av affinitetsinfångningsmetoder. För att undvika störningar av taggen med protein-proteininteraktioner, kunde genen kodar för ett av de samverkande parterna införas parallellt i pBAD / Hans och pBAD / Myc -His vektorer, respektive som ger en hexahistidin motiv vid N- och C -terminalen av målproteinet.
E. coli mutator stammar har mutationsfrekvenser högre än deras vildtyp motsvarigheter. Mutatorstammar är av intresse för bioteknik 30, t ex, för att snabbt utvecklas ett mål stam mot nya, önskade, fenotyper. Vi ges här bevis på att co-uttrycker vildtypen och en mutagen ε subenhet av E. coli DNA-polymeras III, mutationsfrekvensen av den bakteriella värden kan avstämmas med tillräcklig bekvämlighet. För att ytterligare förbättra denna teknik, tätt reglerade expressionsvektorer är nödvändig för att undertrycka så mycket som möjligt av uttrycket av den starkt mutagen D12A variant av ε subenhet. I synnerhet skulle det vara intressant att testa mutationsfrekvensen i E. coli transformerad med pBAD-εD12A och pGOOD1-ε, dvs konfigurations alternativ till det som presenteras här. PBAD vektorer är faktiskt kända för att vara tätt reglerad 12, och denna funktion kan hjälpa till att hålla den basala koncentrationen av εD12Avid låga nivåer.
Exemplen på protein samtidigt uttryck redovisas här vittnar fram mångfalden av denna teknik. Det är emellertid viktigt att notera att genom att använda en mångfald av kompatibla plasmider i enstaka E. coli-celler kan kraftigt utöka de utmaningar som kan tas upp av protein co-uttryck. Under senare år har ett intensivt arbete ägnas åt utöka repertoaren av kompatibla plasmider som skall användas för protein samexpression. I synnerhet var ett ternära systemet förlitar sig på kompatibla plasmider som bär ColE1, p15A och pSC101 replikations brukade samarbeta uttrycka antingen bakterie- och däggdjursproteiner 31. Nyligen var en kvartar samuttryck systemet rapporteras. I detta fall var 13 heterologa gener samuttryckas i E. coli samar transformerad med fyra kompatibla expressionsvektorer, innehållande ColE1, p15A, CloDF13 och RSF replikations 32. Denna sam-expressionssystem användes framgångsrikt för att producera iE. coli funktionellt aktiva lösliga hydrogenase jag från Pyrococcus furiosus 32. För att förstora vårt binärt system, konstruerade vi en ny expressionsvektor, pFINE, innehållande pSC101 replikationsursprung, en neomycin-resistens kassett, och Lac regulatoriska element (Figur 4B). Denna plasmid innehåller samma polylänken närvarande i pBAD och pGOOD vektorer och därmed underlätta gen shuttling bland de tre komponenterna i sam-expressionssystemet. Även pFINE är ett lågt kopietal, dess stabilitet befunnits vara tillfredsställande när den provas i rikt medium. Vi är för närvarande engagerade i ytterligare expansion av vår ternära co-expressionssystem. I detta syfte konstruerade vi en pBAD derivat innehållande en kloramfenikol-resistens kassett, och vi är på väg att byta ColE1 ursprunget för replikering med ett kompatibelt med ColE1, p15A och pSC101. Det är verkligen vår uppfattning att användningen av flera plasmider i enstaka E. coli-celler repsenterar ett kraftfullt verktyg för att utmana in vivo-uttryck av proteinkomplex bestående av en mångfald av olika subenheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Det tillstånd av Springer och Elsevier att skriva siffror är kraftigt erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| INT | Sigma-Aldrich | I8377 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| L-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PNP-gluc | Sigma-Aldrich | N7006 | |
| pNP-TMP | Sigma-Aldrich | T0251 | |
| Tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | 95039 | |
| Yeast extract | Fluka | 70161 | |
| Acrylamide solution 30% | BioRad | 161-0158 | For gel electrophoresis |
| Ammonium persolphate | BioRad | 161-0700 | For gel electrophoresis |
| Glycine | BioRad | 161-0718 | For gel electrophoresis |
| SDS | BioRad | 161-0302 | For gel electrophoresis |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | For gel electrophoresis |
| Tris | BioRad | 161-0719 | For gel electrophoresis |
| Cuvettes 0.1 cm | BioRad | 1652089 | For electroporation |
| Centrifuge 5415R | Eppendorf | ||
| Centrifuge Allegra 21R | Beckman | ||
| Chromatography apparatus GradiFrac | Pharmacia Biotech | ||
| Gene Pulser II electroporation | BioRad | ||
| Microplate Reader 550 | Biorad | ||
| MiniProtean 3 cell | BioRad | ||
| Power Supply | BioRad | ||
| Sonicator 3000 | Misonix |
References
- Durani, V., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. Simplifying protein expression with ligation-free, traceless and tag-switching plasmids. Protein Expr. Purif. 85 (1), 9-17 (2012).
- Hochkoeppler, A. Expanding the landscape of recombinant protein production in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 35 (12), 1971-1981 (2013).
- Geisse, S., Gram, H., Kleuser, B., Kocher, H. P. Eukaryotic expression systems: a comparison. Protein Expr. Purif. 8 (3), 271-282 (1996).
- Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J. Mol. Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
- Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the PBAD promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology. 147 (12), 3241-3247 (2001).
- Morgan-Kiss, R. M., Wadler, C., Cronan, J. E. Long-term and homogeneous regulation of the Escherichia coliaraBAD promoter by use of a lactose transporter of relaxed specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (11), 7373-7377 (2002).
- Tabita, F. R., Small, C. L. Expression and assembly of active cyanobacterial ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in Escherichia coli containing stoichiometric amounts of large and small subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82 (18), 6100-6103 (1985).
- Van der Vies, S. M., Bradley, D., Gatenby, A. A. Assembly of cyanobacterial and higher plant ribulose bisphosphate carboxylase subunits into functional homologous and heterologous enzyme molecules in Escherichia coli. EMBO J. 5 (10), 2439-2444 (1986).
- Amann, E., Brosius, J. ATG vectors for regulated high-level expression of cloned genes in Escherichia coli. Gene. 40 (2-3), 183-190 (1985).
- Scheich, C., Kümmel, D., Soumailakakis, D., Heinemann, U., Büssow, K. Vectors for co-expression of an unrestricted number of proteins. Nucleic Acids Res. 35 (6), e43 (2007).
- Conte, E., Landolfi, G., Vincelli, G., Stefan, A., Hochkoeppler, A. pGOODs: new plasmids for the co-expression of proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 33 (9), 1815-1821 (2011).
- Guzman, L., Belin, D., Carson, M., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- McHenry, C. S. DNA replicases from a bacterial perspective. Annu. Rev. Biochem. 80, 403-436 (2011).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Hamdan, S., et al. Hydrolysis of the 5’-p-nitrophenyl ester of TMP by the proofreading exonuclease (ε) subunit of Escherichia coli DNA polymerase III. Biochemistry. 41 (16), 5266-5275 (2002).
- Guillén Suárez, A. S., Stefan, A., Lemma, S., Conte, E., Hochkoeppler, A. A continuous enzyme-coupled assay of phosphate- or pyrophosphate-releasing enzymes. BioTechniques. 53 (2), 99-103 (2012).
- DeRose, E. F., et al. Model for the catalytic domain of the proofreading ε subunit of Escherichia coli DNA polymerase III based on NMR structural data. Biochemistry. 41 (1), 94-110 (2002).
- Ozawa, K., Jergic, S., Park, A. Y., Dixon, N. E., Otting, G. The proofreading exonuclease subunit ε of Escherichia coli DNA polymerase III is tethered to the polymerase subunit α via a flexible linker. Nucleic Acids Res. 36 (15), 5074-5082 (2008).
- Bressanin, D., Stefan, A., Dal Piaz, F., Cianchetta, S., Reggiani, L., Hochkoeppler, A. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core. Biochim. Biophys. Acta. 1794 (11), 1606-1615 (2009).
- Schaaper, R. M. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 268 (32), 23762-23765 (1993).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Reynolds, A. E., Felton, J., Wright, A. Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12. Nature. 293, 625-629 (1981).
- Schaeffer, S. Inducible system for the utilization of β-glucosides in Escherichia coli. I. Active transport and utilization of β-glucosides. J. Bacteriol. 93 (1), 254-263 (1967).
- Miller, J. H., Suthar, A., Tai, J., Yeung, A., Truong, C., Stewart, J. L. Direct selection for mutators in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181 (5), 1576-1584 (1999).
- Dunker, A. K., et al. The unfoldomics decade: an update of intrinsically disordered proteins. BMC Genomics. 9, Suppl 2. (2008).
- Taft-Benz, S. A., Schaaper, R. M. The C-terminal domain of DnaQ contains the polymerase binding site. J. Bacteriol. 181 (9), 2693-2695 (1999).
- Perrino, F. W., Harvey, S., McNeill, S. M. Two functional domains of the ε subunit of DNA polymerase III. Biochemistry. 38 (48), 16001-16009 (1999).
- Kim, D. R., McHenry, C. S. In vivo assembly of overproduced DNA polymerase III. Overproduction, purification, and characterization of the α, α-ε, and α-ε-θ subunits. J. Biol. Chem. 271 (34), 20681-20689 (1996).
- Maul, R. W., Ponticelli, S. K. S., Duzen, J. M., Sutton, M. D. Differential binding of Escherichia coli DNA polymerase to the β-sliding clamp. Mol. Microbiol. 65 (3), 811-827 (2007).
- Greener, A., Callahan, M. XL1-red: highly efficient random mutagenesis strain. Strategies. 7, 32-34 (1994).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E. Jr, McTernan, P. M., Adams, M. W. W. Heterologous expression and maturation of an NADP-dependent [NiFe]-hydrogenase: a key enzyme in biofuel production. PloS One. 5 (5), (2010).
