Protocol
注：此处进行的所有手术均由IACUC（研究合规办公室）提交给批准，并进行以下NIH的指导方针。在行为测试模式用于小鼠幼稚，不用于其他测试。的C57BL / 6野生型和敲除小鼠在此协议中使用先前已被描述图9和这里介绍的数据是从该手稿。
1.准备的检测室和开放现场设备
- 使用多单元旷场迷宫（OFM）包括四个活动室中被用于此分析（ 图1）。每个腔室测定50厘米（长）×50厘米（宽）×38厘米（高度），并从白色高密度和非多孔塑料被做。
- 走动期间质感迷宫为牵引的地板，而迷宫墙壁光滑。迷宫象限是完全空了本次测试的目的。在审议这一原的其余部分栏，上述的迷宫的单个象限会被利用来演示OFM。
- 擦拭室在使用前95％的乙醇和之前随后的测试，以除去由先前对象小鼠左任何气味线索。
- 允许乙醇完全蒸发之前，测试小鼠。这可能需要每个测试环节之间的5-10分钟。
- 为了便于分析，使用SMART视频跟踪软件PanLab /哈佛仪器来记录和评估鼠标移动。
注意：任何商用视频跟踪摄像机和软件可以被用来跟踪测试受试者和评估从开启字段迷宫结果。这是非常重要的是，最终用户要了解如何校准和运行用于每个单独的分析软件。不管摄像机和用来跟踪软件的，当相机和软件根据制造商的说明被正确校准得到最好的结果。 - 执行测试我适用标准昏暗的房间能容纳迷宫设备和运行软件所需的计算机。或者通过将其连接到在天花板上，或使用任何升高的支持系统，它允许照相机的镜头看到整个迷宫区域（ 图2）暂停所述视频摄像机的迷宫上方。
- 由于人类管理员的考验，一定要在房间足够的空间是在迷宫测试科目完全不可见，以免影响小鼠的行为。
2.准备软件测量活动
- 打开视频跟踪软件。
- 一旦软件被打开，将光标移动到位于“数据采集”选项卡，只需单击打开此选项下的“单对象跟踪”选项。
- 选择位于屏幕底部的“静态背景”选项。
- 选择后，“静态背景”的选择N，有必要使用软件采取迷宫的图像之前加入的测试对象。要做到这一点，将光标移动到“照片”按钮位于屏幕，只需点击一下下方。
注：该软件将利用场景的一个图象，而不测试受试者将被从在跟踪处理拍摄的图像中减去。这导致仅被检体的运动由软件进行分析。 - 确认上述拍摄的背景图像完全被跟踪软件通过移动光标到“测试”按钮位于屏幕的底部，并点击一次取出。固体白场将被显示，如果背景图像从跟踪图像完全除去。如果照明条件发生变化或迷宫被意外移动，你会看到在这个领域黑“阴影”，表示两个图像不完全一致。为了改变这种情况，只需重复STE上面的P 2.4。
- 确认的背景设置后，使用时间选项来配置采集过程中时间控制的方式。要做到这一点，将光标移动到“配置”选项卡并单击一次“计时”的标题。使用新打开的窗口进入实验参数。
- 对于这个协议，选择了“设定时间”选项，因为10分钟的跟踪期。设置了“延迟期”，5秒，以允许用户的时间来将鼠标在迷宫的中心，并事先以跟踪的起始搬走。进入10分钟的“采集时间”为测试的持续时间。将“停止控制”设置为“当设定的时间（10分钟）结束”，这将自动关闭摄像头和软件的跟踪功能。
- 将光标移动到“关闭”按钮后，所有的计时已设置为关闭该窗口。你现在就可以开始测试荷兰国际集团的过程。
3.管理的开放式现场测试
注：在本协议中所使用的软件允许多达16个独立的小鼠的跟踪一次。为便于完成并且如上所述，这里所讨论的协议是使用OFM的单个象限一个鼠标。在使用这种协议的设备，最多4个独立的小鼠可以用迷宫的每个象限进行跟踪。如果利用多机箱迷宫，将第一对象小鼠在其定义的象限后，将剩余的小鼠成各自的迷宫象限用于跟踪分析。对于该协议的目的，进一步说明将具体到迷宫的单象限。
- 从他们的住房房间带入考场带来老鼠在他们的家笼。允许小鼠之前适应的程序空间最少30分钟以开始测试。
- 删除单个米轻轻抓住它的尾巴从家笼乌斯和鼠标放置在野外露天迷宫的中间，而同时启动由单一的点击SMART软件上的开始按钮，开始跟踪鼠标移动。这是正常的鼠标快速移动到迷宫的外围墙壁和释放的时间和跟踪鼠标捕获应一致，以记录这个动作。
- 允许在整个迷宫的各象限中的对象小鼠的自由和不间断运行为一个10分钟的时间，在此期间，跟踪软件将记录的运动（ 图3）。
- 在测试期结束时，拿起对象小鼠轻轻，从迷宫中取出，并将其返回到其家笼中。
- 前清洗迷宫，目视计数存在于迷宫粪便博利粒料和手动记录号码进行进一步的分析。
- 删除所有粪粒，并擦干净排尿所有景点。喷地板与迷宫象限用95％乙醇的壁并用干净的纸巾擦拭。让乙醇溶液测试其他老鼠之前完全干燥。
- 下一个鼠标重复此过程。
4.测量与行为分析在测试过程
注：对于测量，露地行为三个方面使用该协议（见讨论）容易表征。关于如何访问视频追踪软件这些测量结果的简要说明如下。
- 从SMART软件的主界面，将光标移动到“区”选项卡，只需单击“定义”，打开区编辑器。
- 按照SMART软件用户手册中的详细说明，也定义区域或网格叠加的跟踪路径。这里，该软件被用来定义一个5×5网格10厘米的正方形覆盖迷宫的地板（
- 从SMART软件的主界面，将光标移动到“分析”选项卡和单单击打开数据分析窗口。
- 将光标移动到“文件”选项卡，然后打开上面创建的区域文件。
- 将光标移动到“配置”选项卡，打开“轨迹分析”选项。这将打开“单科分析配置”窗口。
- 将光标移动到“标准”选项卡，并从可用参数框（左侧）将“旅行描述休闲，距离”参数设置为包含参数框（右侧）。
- 将光标移动到“过渡区”选项卡，将所有适当的参数包括该参数框上面。
- 确保“全田径”框在窗口底部检查。
- 莫已经光标到OK按钮并关闭单科分析配置窗口。
注：根据您要进行分析，许多其他的选择可以在该窗口中选择从分析挖掘数据。看了你的具体方案的详细用户手册，以确定哪些参数是为您的数据分析最重要的。
- 在程序窗口的左上角的文件选项卡，打开单科轨道窗口，放置一个复选标记旁边正在分析所有曲目。将光标移动到复选标记按钮，在窗口的顶部，然后单击关闭轨道资源管理器窗口。
- 将光标移动到数据分析窗口中的“开始”按钮，然后点击一个启动轨道数据进行分析。
- 分析数据可以作为任一ASCII文本文件输出，或者它可以直接导出到Excel电子表格。使用软件程序正在使用的输出工具来输出达TA供自己使用。
注：总行驶距离和时间，指示区花费将输出以下以上概述的数据的分析步骤。再次，应当强调的是该步骤以达到这些测量此处表示将根据所使用的用户软件不同。但数据本身和结果的解释应该是相似的使用的软件程序无关。还值得一提的是，测试管理员偏压从该协议作为所有收集的定量由软件而不是管理员测量数据中的数据中删除。因此没有qualifiable元件到所述收集的数据。
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Representative Results
每在大多数情况下，测试小鼠的品系的个体的平均数目是约20，以产生足够的统计相关性。然而，该数量可以在8-30的范围内根据对小鼠的可用性。根据所需要的测量或比较，它也有利于使用年龄匹配的主题。
第一，可以说是最重要的具体的参数在田野迷宫来衡量的总门诊距离。同时测量单位无关为比较目的，它是最经常表达为公制测量（厘米）。在这里（ 图5）提供的实验数据，野生型（WT）或正常的C57BL / 6小鼠显示出类似的动态能力到特定敲除的C57BL / 6小鼠品系（KO）。当走过的总距离是菌株或处理之间相似，情感行为的进一步的分析被简化，因为运动活性被有效地从所述EQUA除去化。如果在测试的小鼠的运动能力显著差异，进一步分析，如在迷宫的某些指定区域花费区域条目或时间可因歪斜不活动，而不是应变或治疗的效果。技术存在占不平等的自发活动，但这些是最常见的具体的研究问题。
由于两个小鼠品系之间总卧床距离是相似的，我们能够分析thigmotaxis，或受试者的倾向仍接近墙壁，在WT相对于KO小鼠（ 图6）。 thigmotaxis的程度已被确认为在小鼠10引起焦虑行为的量度。 Thigmotaxis随着焦虑水平升高。使用SMART软件，各个区域分别重叠在由小鼠（ 图3）和时间内区与计算并表示为在吨总时间（10分钟）的函数的外区花费行进的路径他迷宫。在这种情况下，KO小鼠显示比它们的WT同行显著更高引起焦虑行为。代表性行进路径在图4中，其中的WT小鼠路径穿过迷宫的中间区域在一个大得多的频率比该KO小鼠这仍然接近即使两个小鼠行进的距离是所述迷宫的壁可见相似。我们可以得出结论，从这个的基因敲除小鼠表现出比野生型小鼠较高的焦虑相关的行为。
为了进一步支持增加焦虑水平在KO小鼠，粪博利留在迷宫后的10分钟的测试期间，由观察者一旦测试受试者除去（ 图13）计算。继流行的观点，即高度情绪化的动物表现出增加排便，基因敲除小鼠相比WT小鼠表现出显著增加粪便勃利存在。此关联与thigmotaxis的水平在KO小鼠测量并指示塔吨在本研究中使用的敲除小鼠表现出增加的情绪和焦虑时相比，他们的WT对应。
图一四象 限OFM 1.实施例 。该OFM图为从圣地亚哥仪器，并获得中描述的所有测试程序使用。迷宫的一个象限的尺寸以厘米为单位，每个象限标识（Q1-Q4）。
图一四象 限OFM架空摄像机视图的实施例2。显示的图片代表了之前的跟踪程序SMART软件识别的摄像头视图。每个象限标（Q1）至（Q4）和将包含一个单一的鼠标跟踪。
图3.比较WT和KO小鼠的轨道路径 。显示了无论是WT或KO小鼠的代表性曲目。每个轨道表示在测试的10分钟时间内由主体行进的总距离。起点（B）和跟踪的结束点（E）的指示。在WT示例轨道跨越进入迷宫定期的中心部分，而正轨道保持紧密接近所述迷宫的壁标明增加thigmotaxis或焦虑相关的行为。
图用来解释跟踪数据从OFM thigmotaxis 4区覆盖 。使用SMART软件分析软件包，一系列的10×10cm的区域分别为已识别D和用于评估受试者的轨道。外区由16个块所确定，而内区由9个街区，被遮蔽。在迷宫的外区花费更多的时间记录为增加thigmotaxis和指示的扩增焦虑相关的行为。
在OFM图5的总行驶距离。WT（N = 24）和KO（N = 27）小鼠进行的OFM并在其各自的轨道厘米总距离合并，并进行统计分析，以可视化在行走的任何差异。 WT和KO小鼠进行同样的OFM测量总距离的时候。其结果为数据被表示为平均值+/- SEM统计分析（叔-tests）中使用Excel 2010（微软，雷德蒙华盛顿州）和SAS 9.2（SAS研究所，卡里NC）进行。 [数据是modified从拉梅什巴布， 等人 ，2008年]
图6.花费的时间，在OFM的内部和外部区域。WT（N = 24）和KO（N = 27）小鼠进行的OFM并在迷宫对小鼠差异统计学分析内和外区域所花费的时间株。时间花费在迷宫的图确定的7措施thigmotaxis或墙壁拥抱行为的外区和指示的焦虑相关行为。 KO小鼠表现出基于thigmotaxis比WT高焦虑的措施。该结果数据表示为平均+/- SEM统计分析（T -tests）用Excel 2010中（微软雷德蒙WA）和SAS 9.2（SAS研究所，卡里NC）进行，P <0.05。 [数据从拉梅什巴布修改， 等人 ，2008年]
图中的OFM 7粪便勃利存款。WT（N = 24）和KO（N = 27）小鼠被允许从迷宫回自己的家笼被删除之前完成10分钟的测试中OFM。除去小鼠后，排便或大便博利沉积物的数量是由观察者手工计数。薄利的人数增加可指示的受试动物的增加焦虑和情绪。当与WT相比KO小鼠显示出增加粪便博利。该结果数据表示为平均+/- SEM统计分析（T -tests）用Excel 2010中（微软雷德蒙WA）和SAS 9.2（SAS研究所，卡里NC）进行，P <0.05。 [数据最初发表于拉梅什巴布， 等人 ，2008年]
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Discussion
旷场迷宫是在动物行为学研究中最广泛使用的平台之一。一些重要的常规和行为学参数2,4可以收集和OFM的表现时进行分析。这些数据允许研究者测量行为，从整体运动活性焦虑有关的情感行为8。然而，使用OFM的也不是没有缺点。一个混杂的问题是大范围可以在任何测试期间被操纵的静态变量。例子包括时间，照明条件和新的物体包容。变异性在实验方案的设置和设计，这是必要的，以支持一个广谱的应用中，可以使它很难比较研究。当受到变性，如不同的背景或转基因小鼠系与药物治疗都包括在内，在测试比较困难可以增加甚至更多。尽管存在这些问题，将OFM仍然是在啮齿类动物行为学研究中应用最广泛的技术之一。在这里，我们讨论从OFM得到的结果和他们的分析，因为它涉及到鼠标的焦虑和情绪。
这里，旷场行为三个方面使用该协议可以容易地特征在于：1）总距离覆盖（在厘米）的测试的整个定时部分期间; 2）Thigmotaxis或的10分钟的总测试时间的百分比的量度该受试者保持邻接其表示的焦虑样行为的迷宫的外壁;留在象限后除去受试者进行计数粪粒（博利）的3）的数目。排便是情感在啮齿类动物5的负相关度量，并且可以用于表示焦虑在小鼠受试者的水平。关于如何访问在SMART软件这些测量的简要说明如下。
的测试对象运动活性是很重要的，以辨别前OFM数据的分析或就此而言，任何动物行为的迷宫。当比较小鼠或药物治疗不同的效果的不同菌株，鼠标的动态能力是极为重要的。如果运动能力受到影响，由于治疗效果，然后测量依赖于标的移动是混淆的能力的活动。因此，在本实验的第一步是要总移动两个主体菌株之间比较。使用SMART软件的被摄体跟踪的特征，我们测量的测试由C57BL / 6小鼠的两个不同的菌株（ 图4）的持续时间期间覆盖在迷宫的总动态距离。野生型（WT）和基因敲除小鼠（KO）显示类似的动态能力。有在总距离（以厘米）无统计学差异在整个实验的10分钟的时间内行进通过任一鼠标线。已经示出了一个菌株相比在行走一个显著差异到其他，更专门的调查，可能使用其他行为范例，将需要以表征的差异。然而，在这种情况下，受试者菌株下地等于允许直接使用未经调整的OFM衍生数据的进一步调查抗焦虑参数。这里应注意的是，一些研究人员已经解释的高活性，或增加的探索行为低至情感性的指标，而其他的探索行为是独立情感11的设想。人们必须承认，在自主活动差异可能混淆的情感措施12。然而，由于总卧床距离是这里使用的小鼠品系之间相似，小鼠的活性水平是从情感因素分离。
饲养行为包括受试动物站在两只后爪垂直直立位置。它被认为是探索性的行为，并已被用作衡量焦虑中都OFM和高架十字迷宫13。但是，没有明确的迹象表明饲养行为要么是抗焦虑或焦虑的。一些研究表明，增加饲养是一致增加的焦虑水平的小鼠14，而其他假设降低饲养行为表示忧虑增加15。因此，虽然这里饲养没有分析，这取决于实验方案，并检查行为学参数，饲养可用于鉴别从简单的动态行为焦虑联的行为。
已经提出了测量焦虑在啮齿动物模型中，比在单一的迷宫环境16使用一个单一的参数要复杂得多。因此，使用多个测试或多个度量在单个测试可以强化的结果进行评估。 Thigmotaxis或墙壁紧靠的行为被观测到，在大多数啮齿类动物和被链接到焦虑相关是haviors。这是最有可能绑在啮齿动物的基本倾向，以避免大的开放领域和感知危险17,18地区。不管根本原因，thigmotaxis是通常被认为是起点，更具体的焦虑相关的测试19的重要焦虑联的行为。
Thigmotaxis在OFM用于评估抗焦虑，引起焦虑，甚至非药物治疗。焦虑相关的药物，如地西泮和氯氮已经表现出对在OFM 4鼠标行为显著影响而多巴胺激动剂已经表明，多巴胺D1和D2受体参与引起焦虑样作用，由于增加多巴胺能传输20。还有以响应鼠标焦虑样行为在OFM 21株明确区分。例如，BALB / c小鼠，共同家鼠的白化实验室培育的菌株，表现出更大的行为反应急性应激比C57BL / 6小鼠22。因此，在受试者之间的反应基线变动都必须建立与测试模式和选择要用于特定研究问题物种相关的参数时，应考虑在内。
这也是流行的观点，即高度情绪化的动物表现出增加排便。这一观点已经被证实了一些，但由于排便焦虑不同的措施的有效性受到质疑23。但是，由于霍尔的原创论文（1934年）与相关情绪在啮齿类动物排便事件，大量文献关于这一主题肯定了这种关系2。最近的研究结果表明，排便可能确实是情绪焦虑有关的行为在相对 较短的时间测试这里进行一个有用的指标，而不是长期的观察（30分钟），其中在反应的差异不太明显的21
要注意的小鼠的这种行为在OFM取决于他们的触觉是很重要的。因此，任何损害或晶须的短缺给小鼠可能会导致在测量焦虑联行为的降低作为小鼠失去与迷宫的壁触觉接触，并进入中央部更容易3。迷宫的探索也可以在测试的过程，甚至在迷宫地板24的颜色取决于食物或水匮乏，照明。它来验证这些变量，以及任何治疗诱发因素，解释OFM结果焦虑相关的行为之前是重要的。所有的测试条件手稿详细的报告也很关键，以便作出适当的交叉研究比较。
另外，虽然这里讨论的使用，因为它涉及到电动机的运动并调查了小鼠的情绪的OFM时，OFM也可用于测试其他行为スCH作为新物体识别和记忆25。取决于存储器的类型分析，时间与一新物体迷宫可以变化从5分钟至24小时。在新物体识别测试迷宫的易用性和灵活性允许对短期或长期记忆的测试，并且可以用于选择性地分析有关的记忆形成的特定阶段急性药物治疗的效果。总之，OFM是性能26根尖测试。测得的焦虑相关的行为有几个行为基本过程的累积。因此，一旦一个响应被检测的测定中，通常有必要进一步调查该响应，以确定一个特定的缺陷。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multi Unit Open Field Test | San Diego Instruments, Inc. | White 7001-0354 | Any single or multi unit open field maze can be used |
| SMART DT Tracking Software | PanLab/Harvard Apparatus | 76-0695 | Any tracking software can be utilized with this protocol |
| Sony 990x Video Camera Recorder | Sony | CCD-TRV328 | Any suitable video camera can be attached to computer for recording tracking profiles. |
References
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